酶制備牡蠣蛋白水解物的抗氧化活性和功能特性分析

羅齊軍 鄭選梅 李紅

摘要 ? ?為比較分析木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶3種不同酶水解牡蠣獲得的蛋白產(chǎn)物抗氧化活性和功能特性，本文采用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶3種不同酶水解牡蠣蛋白獲得水解物，并分別測定它們在不同pH值下的溶解度、乳化性以及不同濃度水解物的還原能力、DPPH自由基清除率和Fe2+螯合能力。結(jié)果表明，3種酶水解物都有較高的溶解度（P<0.01），胰蛋白酶產(chǎn)生的水解物溶解度最高，94.8%（P<0.05）;水解物溶解度和乳化活性指數(shù)在pH值為4時顯著降低（P<0.05）。牡蠣蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的還原能力、DPPH自由基清除能力和金屬螯合活性隨濃度的增加而增強，其中胰蛋白酶和胃蛋白酶的水解物抗氧化能力較強（P<0.01）。3種蛋白酶水解牡蠣蛋白可獲得抗氧化活性強、溶解度高的水解物，并受濃度和pH值的影響，它們的水解物可作為一種潛在的抗氧化功能多肽利用。

關(guān)鍵詞 ? ?牡蠣;蛋白水解物;抗氧化性;功能特性

中圖分類號 ? ?TS254.1 ? ? ? ?文獻標(biāo)識碼 ? ?A

文章編號 ? 1007-5739（2020）15-0224-03 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）

Abstract ? ?In order to analyze the antioxidant activities and functional properties of protein hydrolysates from oysters treated with papain， pepsin and trypsin， hydrolyzate was obtained by hydrolyzing protein of oysters with papain， pepsin and trypsin， the solubility and emulsifying ability were determined under different pH value， the reducing ability， DPPH free radical scavenging rate and Fe2+ chelation ability of hydrolysate with different concentrations were determined. The results showed that the solubility rate of three enzyme hydrolysates was higher （P<0.01）， and the hydrolysate produced by trypsin was the highest， reached 94.8% （P<0.05）， and the hydrolysate solubility and emulsifying activity decreased significantly when pH value was 4 （P<0.05）. The reducing ability， DPPH free radical scavenging ability and metal chelation activity of oyster protein hydrolysate increased with the increase of concentration， the hydrdysates treated by trypsin and pepsin had stronger antioxidant capacity （P<0.01）. Protein hydrolysates from oyster treated by three enzymes had high antioxidant activity and high solubility affected by the concentration and pH value. Hydrolysates obtained by these methods can be used as a potential antioxidant functional peptide.

Key words ? ?oyster;protein hydrolysate;antioxidant;functional property

蛋白質(zhì)水解物是一種源于動植物等天然蛋白經(jīng)加酸或蛋白質(zhì)水解酶加熱水解并通過分離純化后獲得的產(chǎn)物[1]，有些水解物在其母蛋白序列中并無活性，釋放出來才能表現(xiàn)其生理活性，這些水解產(chǎn)生的肽通常是2～20個氨基酸殘基的長度，大多數(shù)包含二肽和三肽，研究發(fā)現(xiàn)在吸收和利用效率方面要比未水解的蛋白質(zhì)和游離氨基酸更為優(yōu)越[2]，因而其更能發(fā)揮營養(yǎng)作用。腸道以小分子肽的吸收為主，速度比氨基酸分子快[3]，因為小分子肽可以減少底物的競爭，其運載能力要比單個氨基酸強[2]。一些小分子肽如二肽和三肽經(jīng)過內(nèi)臟消化后不被酶解直接被吸收，而更長氨基酸鏈的多肽可能需要被酶解成小分子短肽才能被吸收[4]。除了營養(yǎng)作用外，一些不同蛋白質(zhì)水解物還有其他重要的生物學(xué)活性，大量營養(yǎng)學(xué)或醫(yī)學(xué)研究證明存在于動物、植物如大豆[5]、小麥面筋[6]、牛乳[7]、魷魚[8]、海參[9]、螺旋藻[10]等天然生物中的多肽或蛋白水解物具有生物活性，在抑菌、抗病毒、抗血栓、抗高血壓、抗氧化、降膽固醇、延緩衰老以及免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)和激素調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮各種作用。

牡蠣屬雙殼貝類，肉中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，其蛋白質(zhì)含量高達50%[11]，氨基酸組成較完善，含有較高的必需氨基酸（高達40%），為公認(rèn)的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，譽稱之為“海中牛奶”。其也可作為傳統(tǒng)醫(yī)藥學(xué)的藥材，古代中醫(yī)名著《本草綱目》中，記載牡蠣具有滋陰壯陽、降血壓、減低膽固醇之功效，牡蠣被我國首批藥食同源的保健療效食品列入[12]，其具有很高的利用價值，尤其是其所含有的豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，對人體健康具有很大的營養(yǎng)保健作用。因此，牡蠣蛋白是海洋生物活性肽的良好來源，其蛋白質(zhì)水解物或多肽已被研究證明具有抗氧化[13]、抗菌[14]、抗腫瘤[15]和抗高血壓活性[16]。但蛋白質(zhì)水解物的功能特性因水解酶種類和水解條件不同而產(chǎn)生差異，作為優(yōu)質(zhì)的牡蠣蛋白在功能性水解物利用方面仍然存在不足。因此，本研究通過多種蛋白酶水解牡蠣蛋白獲得牡蠣水解物，并比較分析它們的抗氧化活性和功能特性，為其在食品、保健品或藥物等領(lǐng)域的利用提供參考。

1 ? ?材料與方法

1.1 ? ?試驗材料

1.1.1 ? ?主要試劑。胰蛋白酶（1∶300）、木瓜蛋白酶（1∶2 000）、胃蛋白酶（1∶3 000），1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），均購置上海生生工程有限公司。

1.1.2 ? ?主要設(shè)備。JJ-2組織搗碎機（深圳國華儀器有限公司），DY89-II電動玻璃勻漿機（寧波新芝生物科技股份有限公司），UV-2000紫外可見分光光度計（美國Unico公司），F(xiàn)E20K精密pH計（瑞士梅特勒托利多），3K30超速冷凍離心機（德國Sigma公司）。

1.2 ? ?試驗方法

1.2.1 ? ?牡蠣蛋白水解物的制備。市售湛江沿海養(yǎng)殖鮮牡蠣，清洗干凈后放置于50 ℃烘箱中干燥12 h，組織搗碎機粉碎后過200目得到干燥粉末。采用優(yōu)化的蛋白酶解條件水解牡蠣粉末。分別將10 g牡蠣干粉懸浮于300 mL蒸餾水中，將混合物的pH值調(diào)至各種酶活性最佳值。木瓜蛋白酶處理混合物的水解條件為：pH值6.0，37 ℃，4 h，E/S（1∶100）;胰蛋白酶處理混合物的水解條件為：pH值8.0，37 ℃，4 h，E/S（1∶100）;胃蛋白酶處理混合物的水解條件為：pH值2.0，37 ℃，4 h，E/S（1∶100）。在水解過程中不斷攪拌，并用1 mol/L HCl或NaOH不斷調(diào)節(jié)至相應(yīng)的pH值，水解反應(yīng)4 h后將混合物在95 ℃水浴中保持15 min使酶失活終止水解反應(yīng)。水解混合物在4 ℃離心（5 000 r/min）30 min，取上清液凍干后密封-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ? ?可溶性測定。將200 mg蛋白水解物樣品溶解于20 mL去離子水中，并用HCl和NaOH（1 mol/L）將混合物調(diào)至不同的pH值（2、4、6、8）。在25 ℃將混合物攪拌30 min，離心（8 000 r/min，15 min）。參考Robinson等[17]改進的方法測定上清液中的蛋白質(zhì)含量。在0.5 mol/L NaOH中溶解樣品，測定樣品的總蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)溶解度計算公式：溶解度（%）=上清液蛋白含量/樣品總蛋白含量×100。

1.2.3 ? ?乳化性質(zhì)測定。根據(jù)Pearce等[18]改進的方法測定乳化能力。10 mL花生油和30 mL 1%蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物溶液混合，并將所得油和蛋白質(zhì)混合液分別調(diào)pH值至2、4、6和8。勻漿機混勻混合物（8 000 r/min），混勻后于0、10 min從容器底端吸取等分的乳液100 μL，并與10 mL 0.1%十二烷基硫酸鈉溶液混合。500 nm波長下測量稀釋溶液光密度。乳液形成后測得即光密度OD0和10 min光密度OD10，計算乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)：

乳化活性指數(shù)（m2/g）=（2×2.303×OD500）/（0.25×蛋白克數(shù)）;

乳化穩(wěn)定性指數(shù)（min）=10×OD0 /（OD0-OD10）

1.2.4 ? ?還原能力測定。水解產(chǎn)物的還原能力根據(jù)Latorres等[19]方法測定。將不同濃度（1、3、5 mg/mL）的1 mL蛋白水解產(chǎn)物樣品與2.5 mL磷酸鹽緩沖液（pH值6.0，0.2 mol/L）和2.5 mL 1%鐵氰化鉀混合。于50 ℃條件下將混合物孵育（30 min），然后加入2.5 mL 10%（w/v）三氯乙酸。將混合物離心（3 000 r/min）10 min。最后將2.5 mL上清液與0.5 mL 0.1%（w/v）氯化鐵混合，并加入2.5 mL蒸餾水。反應(yīng)10 min后，700 nm波長測定所得溶液的光密度。

1.2.5 ? ?DPPH自由基清除能力測定。采用Latorres等[19]方法測定水解物清除DPPH自由基的能力。將各種濃度（1、3、5 mg/mL）的不同提取物乙醇1 mL溶液加到4 mL的0.004% DPPH甲醇溶液中。在孵育（25 ℃）30 min后，517 nm波長測光密度OD樣品，用蒸餾水代替樣品外，以相同的方式進行對照測得光密度OD空白，反應(yīng)混合物的較低光密度表明較高的DPPH自由基清除活性。DPPH對自由基的抑制百分比（%）通過以下公式計算得出：自由基清除能力（%）=（OD空白-OD樣品）/OD空白×100。

1.2.6 ? ?Fe2+螯合能力測定。使用Chalamaiah等[20]的改進方法測定了對Fe2+的螯合活性。分別將0.5、1.5、2.5 mg/mL的樣品溶液與3.7 mL蒸餾水混合。然后使混合物與0.1 mL的2 mmol/L FeCl2和0.2 mL的5 mmol/L菲洛嗪反應(yīng)，在室溫下放置20 min。在562 nm波長測定光密度OD樣品。蒸餾水代替樣品外作為空白對照測得光密度OD空白，計算螯合活性：螯合活性（%）=（OD空白-OD樣品）/OD空白×100

1.3 ? ?數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

測量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，數(shù)據(jù)用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，顯著性水平為P<0.05，極顯著性水平為P<0.01。

2 ? ?結(jié)果與分析

2.1 ? ?牡蠣蛋白水解物溶解性

如圖1所示，通過胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶作用牡蠣蛋白獲得的牡蠣水解產(chǎn)物在pH值2～8范圍內(nèi)溶解度在77.8%以上，溶解度均高于未進行蛋白酶處理的樣品（P<0.01）。在pH值為4時，這3種水解物溶解度相對較低。蛋白質(zhì)水解物通常在等電點處溶解度低。在pH值為6～8時，這3種水解物顯示出更高的溶解度（大于80.7%），可能是因為pH值對肽的弱酸性和堿性側(cè)鏈基團上的電荷產(chǎn)生了影響。經(jīng)胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶水解作用，產(chǎn)物溶解度顯著提高（P<0.01）。通過蛋白酶水解小分子量多肽增加，極性基團的數(shù)量增多，蛋白質(zhì)水解成小分子的肽更易溶解。蛋白水解物溶解性質(zhì)是其利用的非常重要的功能特性，蛋白水解物的高溶解度更適合許多食品應(yīng)用，也會影響起泡和乳化特性等[21]。

2.2 ? ?水解物乳化性質(zhì)比較

不同pH值（2～8）牡蠣蛋白水解物的乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)如圖2、3所示，水解物的乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)在pH值為4時最低（P<0.01），可能是因為溶解度降低的緣故。因在pH值為4時溶解度降低，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)最低，而pH值遠(yuǎn)離4時這些指數(shù)增加。水解物的乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)也因水解酶種類而不同，胃蛋白酶水解物顯示了較低的乳化活性指數(shù)。水解產(chǎn)物肽段中氨基酸組成可能不同，從而引起肽段的電荷變化。不同酶水解可能會影響乳化特性。未進行酶處理的樣品表現(xiàn)了較高的乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)（P<0.01），認(rèn)為是水解物小分子量的多肽不如具有較好的親水和疏水基團作用力大，分子蛋白難以維持泡沫的形成和穩(wěn)定[22]。

2.3 ? ?水解產(chǎn)物的還原能力

如圖4所示，與未處理的牡蠣蛋白比較，水解產(chǎn)物的還原能力隨濃度的增加而顯著增強，且在胃蛋白酶和胰蛋白酶產(chǎn)生的蛋白水解物中有較高的還原能力（P<0.01），水解物可能是具氧化性物質(zhì)的良好電子供體。牡蠣蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物可將Fe3+還原為Fe2+，隨濃度的增加還原能力增加，這與Naqash等[23]報道的粉紅鱸魚蛋白水解產(chǎn)物的還原能力與濃度的變化相似。

2.4 ? ?DPPH自由基清除率

如圖5所示，與未水解蛋白比較，蛋白酶產(chǎn)生的水解產(chǎn)物都表現(xiàn)出顯著的清除活性（P<0.01）。在3 mg/mL和5 mg/mL的水解物濃度時DPPH自由基清除率較高，顯示出最大的抗氧化活性。因此，牡蠣蛋白水解產(chǎn)物含有電子供體并且可以與自由基反應(yīng)轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定的產(chǎn)物并終止自由基鏈反應(yīng)。

2.5 ? ?Fe2+螯合能力

如圖6所示，由3種蛋白酶獲得的水解產(chǎn)物隨濃度的增加金屬離子螯合能力增強，尤其胰蛋白酶和胃蛋白酶獲得的水解產(chǎn)物表現(xiàn)出顯著的Fe2+離子螯合活性（P<0.01）。在較低的濃度（0.5、1.5、2.5 mg/mL）時，3種水解產(chǎn)物的螯合活性顯示出顯著差異（P<0.05），而在較高的濃度（1.5、2.5 mg/mL）下，胰蛋白酶和胃蛋白酶無顯著性差異（P>0.05），但顯著高于木瓜蛋白酶（P<0.01）。各種蛋白酶作用產(chǎn)生的肽可作為金屬離子螯合劑，Chalamaiah等[24]認(rèn)為蛋白水解物金屬離子螯合活性可能是因水解產(chǎn)生大量的組氨酸殘基引起，小分子肽可能會螯合一些金屬離子氧化劑（如Fe2+和Cu2+），從而減少脂質(zhì)氧化，并作為間接抗氧化劑起作用。鐵和銅等金屬離子是脂質(zhì)過氧化作用的刺激物，多肽的螯合作用有助于延緩過氧化作用，可防止細(xì)胞和組織損害[25]。牡蠣蛋白水解物多肽具有較好的金屬螯合能力，胰蛋白酶和胃蛋白酶表現(xiàn)尤為突出，是潛在可利用的抗氧化劑。

3 ? ?結(jié)論與討論

試驗表明，3種酶水解物都有較高的溶解度，其中胰蛋白酶產(chǎn)生的水解物溶解度最好;水解物溶解度和乳化活性指數(shù)均受pH值的影響。牡蠣蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的還原能力、DPPH自由基清除能力和金屬螯合活性反映水解物的抗氧化性質(zhì)，隨濃度的增加而增強，其中胰蛋白酶和胃蛋白酶水解物具有較高的抗氧化能力。因此，它們的水解物可廣泛用于食品工業(yè)或保健品等領(lǐng)域。

4 ? ?參考文獻

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