不同微生物添加組合對桑枝葉青貯效果的影響

黃光云， 何仁春， 羅鮮青， 周志揚(yáng)， 賈銀海， 周俊華， 梁琪妹，黃 香， 黃春花， 唐承明， 廖海洪， 李紹波， 王啟芝， 黃麗霞

(廣西壯族自治區(qū)畜牧研究所，南寧 530001)

桑枝葉含有豐富的碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪酸以及豐富的維生素和礦物質(zhì)，其中粗蛋白質(zhì)為16%～29%，粗纖維為8%～15%顯著高于其他青飼料[1]。桑枝葉作為畜禽飼料營養(yǎng)成分全面，利用價(jià)值高，可與優(yōu)質(zhì)牧草相媲美。新鮮桑枝葉其枝稈部纖維素、木質(zhì)素含量較高，適口性差，消化利用率低，直接飼喂不僅會造成浪費(fèi)，而且會影響其利用效果。但將其切斷、揉搓發(fā)酵制作青貯，能較好地集中保存和利用，減少營養(yǎng)成分的損失，為畜禽養(yǎng)殖提供優(yōu)質(zhì)的飼料資源。大量研究顯示，利用桑枝葉青貯料飼喂泌乳牛，采食率可提高7%以上，產(chǎn)奶量可提高20.5%，能節(jié)約蛋白質(zhì)精料20%左右[2]。桑枝葉混合青貯組比全株玉米青貯組雜交肉用公羊增重提高9.02%(P<0.05)；料肉比降低6.98%(P<0.05)，能顯著提高肉用雜交育肥羊生產(chǎn)性能[3]。李棟棟等[4]研究發(fā)現(xiàn)，2%和4%發(fā)酵桑葉組平均日增質(zhì)量略高于對照組，但是采食量和料肉比低于對照組，差異顯著(P<0.05)；說明將發(fā)酵桑葉添加到飼養(yǎng)仔豬的飼料中，仔豬生長性能得到一定程度的改善，減少了飼養(yǎng)仔豬的生產(chǎn)成本。因此，桑枝葉作為動物的非常規(guī)飼料，具有極大的開發(fā)潛力和利用價(jià)值。

米曲霉是一種好氣性真菌，是一類產(chǎn)復(fù)合酶的菌株，除產(chǎn)蛋白酶外，還可產(chǎn)淀粉酶、糖化梅、纖維素酶、植酸酶等[5]。植物乳桿菌能夠有效加強(qiáng)青貯飼料乳酸菌主導(dǎo)作用，產(chǎn)生更多乳酸而快速降低pH，抑制酵母和梭菌等有害菌的生長，提高青貯有氧穩(wěn)定性?？莶菅挎邨U菌好氧生長，不僅產(chǎn)酶能力強(qiáng)且能產(chǎn)生多種氨基酸及蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等胞外酶，降解粗飼料中某些復(fù)雜的糖類，提高粗飼料的轉(zhuǎn)化率和安全性[6]。有關(guān)研究不同微生物組合發(fā)酵桑枝葉開發(fā)新飼料資源的研究報(bào)道較少，因此，本試驗(yàn)以新鮮桑枝葉為原料，探究添加不同微生物組合青貯方法對桑枝葉青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響，擬為開發(fā)利用廣西生態(tài)桑資源，合理利用蠶繭生產(chǎn)區(qū)過剩桑枝葉，為發(fā)酵桑枝葉飼料在畜禽養(yǎng)殖中的合理應(yīng)用提供相關(guān)試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用桑枝葉取自廣西百色種植區(qū)，人工收割，大炬牌鍘草揉絲機(jī)9ZF5型，揉搓切1 cm備用。米曲霉(XMS01)、植物乳桿菌(XMS02)、植物乳桿菌(XMS03)均為：廣西畜牧研究所動物營養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室，自主選育。商品菌劑：多功能飼料發(fā)酵劑(枯草芽孢桿菌>56.0×108cfu/g，沼澤紅假單胞菌>20×108cfu/g)。新鮮桑枝葉常規(guī)營養(yǎng)成分見表1。商品菌劑活化：按產(chǎn)品說明比例，5 t青貯飼料使用該產(chǎn)品500 g與1 kg紅糖，加入100 kg水激活24 h后使用。高鹽察氏培養(yǎng)基用于米曲霉(XMS01)活化及菌落計(jì)數(shù)，MRS培養(yǎng)基用于植物乳桿菌(XMS02)、植物乳桿菌(XMS03)活化及菌落計(jì)數(shù)。

表1 新鮮桑枝葉常規(guī)營養(yǎng)成分 %DM

1.2 菌液計(jì)數(shù)

將植物乳桿菌(XMS02)、植物乳桿菌(XMS03)菌種培養(yǎng)至第2代進(jìn)行接種，用無菌水對其接種菌液逐級稀釋，對1×10-5，1×10-6，1×10-73個(gè)稀釋梯度進(jìn)行平板涂布，每個(gè)梯度3個(gè)重復(fù)，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h計(jì)數(shù)。采用平板計(jì)數(shù)法，植物乳桿菌(XMS02)菌液濃度為1.7×108cfu/mL，植物乳桿菌(XMS03)菌液濃度為1.9×108cfu/mL。

米曲霉接種液：在接種液中加入玻璃球，用振蕩器振蕩后3層紗布過濾，用無菌水對所得孢子懸浮液逐級稀釋，采用血球計(jì)數(shù)法計(jì)算米曲霉孢子濃度。米曲霉(XMS01)菌液濃度為1.53×107cfu/mL。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及方法

試驗(yàn)分3個(gè)組：自然發(fā)酵組(對照組)、自備菌劑微貯組(試驗(yàn)組I)與商品菌劑微貯組(試驗(yàn)組Ⅱ)，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)取3 kg新鮮桑枝葉。對照組桑枝葉樣品噴灑無菌水200 mL/kg。

試驗(yàn)組I：分2個(gè)階段進(jìn)行，第一階段有氧發(fā)酵，桑枝葉樣品噴灑米曲霉菌液10 mL/kg和無菌水90 mL/kg，在無菌室室溫下發(fā)酵2 d；第二階段為無氧青貯，噴灑10 mL/kg植物乳桿菌XMS02菌液+10 mL/kg植物乳桿菌XMS03菌液+80 mL/kg無菌水。

試驗(yàn)組Ⅱ：桑枝葉樣品噴灑商品菌劑活化后的菌液200 mL/kg。

青貯原料與添加菌劑充分混勻，專用帶放氣閥薄膜發(fā)酵飼料袋，打包密封青貯，標(biāo)記后避光室溫下保存30 d，每個(gè)重復(fù)均取樣進(jìn)行分析。

1.4 測定項(xiàng)目及方法

1.4.1 感官評定 根據(jù)《青貯飼料質(zhì)量評定標(biāo)準(zhǔn)(試行)》[7]進(jìn)行色澤、質(zhì)地、氣味以及霉變情況等現(xiàn)場感官評定。

1.4.2 常規(guī)指標(biāo)分析 各組樣品經(jīng)65 ℃烘48 h風(fēng)干，過40目篩粉碎制成樣品，儲存于樣品袋中，以備分析。參照參考文獻(xiàn)[8]中的常規(guī)法進(jìn)行水分、CP、EE、NDF、ADF含量的測定,每個(gè)樣品測2個(gè)平行樣，相對偏差須在允許范圍內(nèi)。

干物質(zhì)回收率(DMR)測定：

DMR=(青貯后原料質(zhì)量×青貯后干物質(zhì)率)/裝袋時(shí)原料質(zhì)量×原料干物質(zhì)率×100%

1.4.3 青貯飼料pH值及品質(zhì)評定 青貯結(jié)束，實(shí)驗(yàn)室評定包括測定青貯開袋后pH值和有機(jī)酸(乳酸、乙酸、丙酸和丁酸)含量。

青貯的桑枝葉開封以后將樣品混合均勻，每袋取35 g樣品，放入250 mL廣口瓶中，添加超純水150 mL，置于4 ℃冰箱中，每隔4 h搖勻1次；經(jīng)過24 h后，用2層紗布進(jìn)行過濾并分裝樣液，分別用于pH、乳酸、氨態(tài)氮(NH3-N)和揮發(fā)性脂肪酸(VFA)的測定。乳酸含量用試劑盒(A019-2，南京建成生物工程研究所)進(jìn)行測定；揮發(fā)性脂肪酸(乙酸、丙酸和丁酸)含量參照E．Kaiser等[9]的方法采用氣相色譜儀(島津2014C)進(jìn)行測定；pH值采用pHS-3C型pH計(jì)進(jìn)行測定；氨態(tài)氮含量采用I9型紫外—可見分光光度計(jì)以比色法測定。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行初步處理，應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因子方差分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并進(jìn)行Duncan氏法多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同組合桑枝葉青貯感官評價(jià)

經(jīng)過30 d青貯對桑枝葉進(jìn)行現(xiàn)場感官評定。從表2結(jié)果可見，對照組有淡酸味、色澤褐色，略帶粘性，總分43分，按青貯評分標(biāo)準(zhǔn)與等級劃分評分為一般。

表2 不同微生物組合青貯對桑枝葉的感官評定

表3 不同微生物組合青貯對桑枝葉常規(guī)營養(yǎng)成分的評定 %DM

試驗(yàn)組I：有酸香味、舒適感較好，色澤黃綠，松散軟弱不粘手，莖葉保持良好，總分73分，按青貯評分標(biāo)準(zhǔn)與等級劃分評分為良好。

試驗(yàn)組Ⅱ：有酸香味、芳香味弱，暗褐色，柔軟，莖葉結(jié)構(gòu)保持良好，總分68分，按青貯評分標(biāo)準(zhǔn)與等級劃分評分為良好。

2.2 不同組合桑枝葉發(fā)酵營養(yǎng)成分影響

由表3對不同組合桑枝葉發(fā)酵營養(yǎng)成分分析可知，與對照組相比，試驗(yàn)組干物質(zhì)含量均無顯著變化(P>0.05)；CP含量均顯著提高(P<0.05)，且兩試驗(yàn)組間差異不顯著(P>0.05)；EE含量均無顯著變化(P>0.05)；NDF和ADF含量均顯著降低(P<0.05)，且兩試驗(yàn)組間差異不顯著(P>0.05)；試驗(yàn)組Ⅰ中DMR高于對照組和試驗(yàn)組Ⅱ，但差異不顯著(P>0.05)。與青貯前桑枝葉中各營養(yǎng)成分含量(表1)相比，青貯后各組CP含量均有所提高；除對照組青貯后ADF含量升高外，試驗(yàn)組NDF和ADF含量青貯后均有所降低。

2.3 不同組合桑枝葉發(fā)酵品質(zhì)的影響

由表4可知，與對照組相比，試驗(yàn)組Ⅰ和試驗(yàn)組Ⅱ中pH含量均有降低(P>0.05)；試驗(yàn)組乳酸含量顯著高于對照組(P<0.05)，兩試驗(yàn)組間差異不顯著(P>0.05)；試驗(yàn)組乙酸含量顯著高于對照組(P<0.05)，2個(gè)試驗(yàn)組間乙酸含量差異不顯著(P>0.05)；試驗(yàn)組丙酸、丁酸含量與對照組相比差異不顯著(P>0.05)；與對照組相比，試驗(yàn)組中氨態(tài)氮含量均有所降低(P>0.05)。

表4 不同微生物組合青貯對桑枝葉發(fā)酵品質(zhì)的影響 mmol/kg

3 討 論

3.1 桑枝葉青貯飼料感官評定的分析

桑枝葉青貯品質(zhì)直接影響其利用的價(jià)值，試驗(yàn)中筆者對桑枝葉的感官指標(biāo)進(jìn)行了評定，對照組桑枝葉的感官評定，發(fā)酵品質(zhì)評價(jià)均未達(dá)到優(yōu)質(zhì)飼料的水平，說明在不添加發(fā)酵劑的情況下，受發(fā)酵環(huán)境等條件的限制，造成了桑枝葉發(fā)酵緩慢，影響發(fā)酵效果。但是在添加發(fā)酵劑的桑枝葉青貯后，通過對其氣味、色澤、質(zhì)地和霉變等情況進(jìn)行感官評定，試驗(yàn)I組73分和試驗(yàn)Ⅱ組68分，試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ組得分均高于對照組總分43分，綜合評價(jià)的結(jié)果，試驗(yàn)Ⅰ和Ⅱ組青貯品質(zhì)優(yōu)于對照組，說明添加相關(guān)微生物制劑等有利于改善桑枝葉發(fā)酵品質(zhì)。試驗(yàn)結(jié)果與唐慶鳳等[13]研究結(jié)果一致。

3.2 不同微生物組合青貯對桑枝葉常規(guī)營養(yǎng)成分的影響

不同的菌種產(chǎn)酶的能力及種類不同，而且菌種之間存在協(xié)同或頡頏作用，混合菌發(fā)酵主要是通過菌種之間的協(xié)同作用，擴(kuò)大對發(fā)酵底物的適應(yīng)性，從而起到改善發(fā)酵底物品質(zhì)的效果，因此，菌種的選擇及組合非常關(guān)鍵。降解木質(zhì)素的益生菌以真菌降解效果為較好，降解纖維素和半纖維素的益生菌可發(fā)酵生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白[6]。本試驗(yàn)所選的菌種試驗(yàn)組Ⅰ、Ⅱ主要真菌菌種有枯草芽孢桿菌、米曲霉(XMS01)、發(fā)酵前期芽孢桿菌、曲霉等好氧微生物繁殖生長，消耗氧氣，從而為乳酸菌提供厭氧生長環(huán)境；發(fā)酵后期乳酸菌類增殖發(fā)酵會產(chǎn)生大量乳酸，使微生物在無氧條件下發(fā)生強(qiáng)制自溶，釋放出胞內(nèi)酶及生物活性物質(zhì)，使蛋白酶發(fā)生酶解反應(yīng)，產(chǎn)生香味物質(zhì)。CP是衡量青貯飼料營養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)之一。Keles等[10]研究表明，在飼料發(fā)酵過程中，同型發(fā)酵乳酸菌能夠產(chǎn)生乳酸，降低pH，抑制有害微生物的生長，降低NDF含量，增加CP含量。楊剛等[11]研究表明，對羽毛粉分別添加米曲霉、枯草芽孢桿菌發(fā)酵72 h后，米曲霉產(chǎn)蛋白酶活力達(dá)3 256.61 U/g(P<0.05)，枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶活力達(dá)到690.03 U/g(P<0.05)。本試驗(yàn)中，與對照組相比試驗(yàn)組I和Ⅱ的CP含量均顯著提高(P<0.05)，但試驗(yàn)組間差異不顯著(P>0.05)。試驗(yàn)組I和Ⅱ的ADF、NDF的含量均比對照組降低，可能是因?yàn)楸驹囼?yàn)所選的菌種相互之間存在較好的協(xié)同發(fā)酵作用，其粗纖維中的木聚糖鏈和木質(zhì)素聚合物酯鏈被酶解，發(fā)酵過程中，益生菌大量生長繁殖，分泌的酶可降解纖維素、半纖維素與木質(zhì)素間連接的結(jié)合鍵，使與木質(zhì)素交聯(lián)在一起的纖維素和半纖維素游離出來，破壞粗飼料中難消化的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，使其他營養(yǎng)物質(zhì)暴露出來。

3.3 不同微生物組合青貯對桑枝葉發(fā)酵品質(zhì)的影響

在試驗(yàn)I組添加乳酸菌的繁殖產(chǎn)生乳酸，在密封的發(fā)酵環(huán)境中，經(jīng)過乳酸菌等微生物的生長發(fā)酵活動，可快速發(fā)酵產(chǎn)生乳酸、乙酸和丙酸等揮發(fā)性脂肪酸，降低青貯飼料的pH，抑制不良微生物繁殖，也改善桑枝葉的發(fā)酵品質(zhì)，達(dá)到長期保存青綠飼料的目的。對照組pH值均偏高，不能有效抑制不良微生物的繁殖,在常溫發(fā)酵條件下生成大量丁酸，導(dǎo)致發(fā)酵品質(zhì)低，表明桑枝葉直接青貯不利于改善桑枝葉發(fā)酵品質(zhì)。本試驗(yàn)中試驗(yàn)I、和Ⅱ組乳酸含量顯著高于對照組(P<0.05)，兩試驗(yàn)組間差異不顯著(P>0.05)；試驗(yàn)組乙酸含量顯著高于對照組(P<0.05)，2個(gè)試驗(yàn)組間乙酸含量差異不顯著(P>0.05)。表明對照組品質(zhì)低于試驗(yàn)組。青貯中的乳酸、乙酸、丁酸，其中乳酸所占的比例越大越好，但丁酸所占的比例越小越好[12]。丁酸含量越少，表明青貯飼料的品質(zhì)越高。在青貯飼料中，主要反映飼料在青貯過程中蛋白質(zhì)被破壞程度的高低，即氨態(tài)氮含量的高低，所以青貯飼料開窖后氨態(tài)氮含量越低，表明青貯飼料的品質(zhì)越佳。試驗(yàn)I和Ⅱ組的氨態(tài)氮含量略低于對照組，表明試驗(yàn)I和Ⅱ組在青貯過程中營養(yǎng)成分損失較低，青貯品質(zhì)比對照組優(yōu)。

4 結(jié) 論

添加米曲霉(XMS01)、植物乳桿菌(XMS02)、植物乳桿菌(XMS03)、枯草芽孢桿菌等在一定程度提高桑枝葉青貯的CP、乳酸和丁酸含量，顯著降低NDF和ADF含量，均能提高桑枝葉青貯的品質(zhì)。