一株好氧反硝化菌的分離鑒定及脫氮特性研究

郭 超,尹 輝,,范 奎,陳張娜,李燕敏

(1.武漢科技大學(xué)城市建設(shè)學(xué)院,湖北 武漢430065；2.武漢理工大學(xué)土木工程學(xué)院,湖北 武漢430070；3.武漢黃陂凱迪水務(wù)有限公司,湖北 武漢 432200；4.北京城建亞泰建設(shè)集團(tuán)有限公司,北京100013)

眾所周知，水體富營養(yǎng)化是當(dāng)今水污染防治領(lǐng)域的一個熱點(diǎn)問題[1]。水體中氮污染是引起水體的富營養(yǎng)化的一個重要原因，氮含量超標(biāo)不僅會增加水處理成本，而且會直接影響動物及人體的健康[2]。因此，高效去除水體中氮已經(jīng)成為廢水處理研究中的重要課題之一。常見的治理水體中氮污染的方法或技術(shù)包括物理、化學(xué)和生物脫氮[3]。其中，生物脫氮技術(shù)具有高效、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于治理水體中氮污染[4-5]。傳統(tǒng)的生物脫氮過程包括硝化和反硝化兩個作用過程，其中硝化作用需要在好氧條件下完成，反硝化作用在厭氧或兼性厭氧條件下發(fā)生[6-7]，這會導(dǎo)致傳統(tǒng)的硝化、反硝化過程不能同步實現(xiàn)，進(jìn)而影響污水的脫氮效率[8]。近年來，隨著人們環(huán)保意識的增強(qiáng)，除氮技術(shù)得到了快速發(fā)展，出現(xiàn)了很多新型的生物脫氮技術(shù)，如短程硝化、好氧反硝化、厭氧氨氧化等工藝[9-11]。其中，好氧反硝化工藝突破了人們對傳統(tǒng)硝化和反硝化理論的認(rèn)識，給生物脫氮技術(shù)提供了一種嶄新的思路。

好氧反硝化作用是指在好氧條件下，好氧反硝化菌在一系列酶的作用下將硝酸鹽氮轉(zhuǎn)化為氣態(tài)氮的過程。20世紀(jì)80 年代，人們首次發(fā)現(xiàn)了具有好氧反硝化功能的副球菌屬(Paracoccus)[12]。該菌屬的發(fā)現(xiàn)打破了反硝化作用只能在缺氧或厭氧條件下進(jìn)行的傳統(tǒng)觀點(diǎn)，為實現(xiàn)同步硝化反硝化工藝奠定了微生物學(xué)基礎(chǔ)。與傳統(tǒng)的生物脫氮技術(shù)相比，同步硝化反硝化工藝具有反應(yīng)速率高、操作簡單、污水處理效率高等優(yōu)點(diǎn)[13]。而實現(xiàn)該工藝的關(guān)鍵問題是富集更多的好氧反硝化菌，為此研究者在自然界中篩選出了越來越多的好氧反硝化菌[14]。據(jù)報道，國內(nèi)外學(xué)者篩選出的好氧反硝化菌有異養(yǎng)球硫細(xì)菌(Thiosphaerapantotropha)[15]、產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes)[16-17]、副球菌屬(Paracoccus)[18-19]、紅球菌屬(Rhodococcus)[20]、芽胞桿菌屬(Bacillus)[21]等。由于各類菌屬在不同環(huán)境中篩選出來，其脫氮性能也存在一定的差異。

為了進(jìn)一步豐富已有好氧反硝化菌屬的特性，本文以本課題組培養(yǎng)的具有同步脫氮除磷的好氧顆粒污泥為污泥樣品，通過富集、分離、純化初步分離出9株具有好氧反硝化特性的單菌株，并利用靜態(tài)反硝化試驗，篩選出一株具有較強(qiáng)好氧反硝化能力的高效菌株Y8，通過對其進(jìn)行鑒定，進(jìn)一步探討該高效菌株在不同操作和運(yùn)行條件下的反硝化性能，最終確定該菌株最佳的好氧反硝化條件。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 污泥樣品來源

好氧顆粒污泥外觀呈黃褐色或黃色，粒徑約為1 mm，污泥濃度在8 000 mg/L左右，系統(tǒng)對COD、氮和磷的去除率在85%左右。

1.1.2 培養(yǎng)基配制

為了篩選和研究好氧反硝化菌，本試驗配制了4種培養(yǎng)基，其組成如下。

(1) 富集培養(yǎng)基：檸檬酸鈉5.0 g，KNO32.0 g，K2HPO41.0 g，KH2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 30.0 g，蒸餾水1 L，調(diào)節(jié)pH值至7.0～7.2。

(2) BTB固體培養(yǎng)基：瓊脂20.0 g，檸檬酸鈉5.0 g，KNO32.0 g，K2HPO41.0 g，KH2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 30.0 g，BTB 1 mL，蒸餾水1 L，調(diào)節(jié)pH值至7.0～7.2。

(3) 普通細(xì)菌培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 30.0 g，蒸餾水1 L，調(diào)節(jié)pH值至7.0～7.2。

(4) 反硝化培養(yǎng)基：檸檬酸鈉 5.0 g，KNO31.0 g，KH2PO41.0 g，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.05 g，CaCl2·2H2O 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，NaCl 30.0 g，蒸餾水1 L，調(diào)節(jié)pH值至7.0～7.2。

1.2 試驗方法

1.2.1 好氧反硝化菌的分離與篩選

(1) 富集：先從SBR反應(yīng)器中吸取25 mL泥水混合液，并將其攪拌均勻，再加入至250 mL滅菌的富集培養(yǎng)基中，放入30℃氣浴搖床以160 r/min轉(zhuǎn)速培養(yǎng)2～3 d;然后取25 mL富集液加入新的富集培養(yǎng)基中，按相同步驟繼續(xù)培養(yǎng)，共富集3次。

(2) 分離與純化：先用移液槍吸取0.1 mL富集液，加入含有0.9 mL無菌水的小試管中，搖勻后即得到濃度為10-1的菌液，以此類推將富集液依次稀釋到10-3、10-4、10-5、10-6、10-7濃度；然后將以上濃度梯度的菌液分別涂布于BTB培養(yǎng)基上，倒置放入30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d；最后挑取培養(yǎng)基變藍(lán)的單菌落，在BTB培養(yǎng)基上劃線純化，倒置放入30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，如此重復(fù)4次后得到純菌落，斜面4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 好氧反硝化菌株反硝化能力的測定

將分離的菌株移植到100 mL細(xì)菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，取培養(yǎng)液10 mL離心，棄去上清液并用蒸餾水洗滌固體顆粒，后轉(zhuǎn)接至100 mL反硝化液體培養(yǎng)基中，透氣塞封口，30℃、160 r/min氣浴搖床連續(xù)培養(yǎng)，每隔12 h取樣，測定其脫氮效率，從中優(yōu)選出高效的好氧反硝化菌株。

1.2.3 高效好氧反硝化菌株DNA的提取和PCR擴(kuò)增與測序

細(xì)菌基因組16SrDNA提?。孩傥?00 μL無菌水至PCR管中，并用滅菌的接種環(huán)挑取單個菌落(2～3環(huán))溶于無菌水；②將PCR管置于PCR儀中，94℃裂解4 min提取DNA；③離心機(jī)上以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心10 min;④吸取70～80 μL上清液到新的PCR管中。

PCR擴(kuò)增[22]：先配制PCR反應(yīng)體系(50 μL)：5 μL 10×Taq Buffer ，5 μL dNTP，1 μL 27F， 1 μL 1492R，1 μL Taq酶，10 μL template(即上清液)(空白加10 μL無菌水)無菌水補(bǔ)足至50 μL;然后在PCR儀上擴(kuò)增大約2.5 h，之后稱取0.14 g瓊脂糖于錐形瓶，加入20 mL 1×TAE[23](0.4 mL 50×TAE+20 mL H2O)，用微波爐煮沸至瓊脂糖溶解后補(bǔ)水至原重；最后配制1×TAE緩沖液(2.5 mL 50×TAE+125 mL H2O)倒入電泳槽，并放入瓊脂糖。進(jìn)樣時，第一個孔為1 μL 6×loading buffer+5 μL marker，后面的孔為0.6 μL 6×loading buffer+3 μL PCR產(chǎn)物[23]。

電泳：進(jìn)行電泳時，其條件為電壓80 mV，電流80 mA，時間30 min。

染色與洗滌：先將電泳后的膠放入EB中染色10 min左右；然后用清水洗掉膠上的EB染色劑；最后在紫外成像儀器上觀察PCR樣品純度是否良好，符合則送樣檢測。

將該高效菌株測序得到的16SrDNA序列與基因數(shù)據(jù)庫中已有細(xì)菌序列進(jìn)行同源性比對[24]，選擇序列相似度高的菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 操作和運(yùn)行條件對高效好氧反硝化菌株脫氮性能的影響

(1) 碳源試驗：設(shè)置4個試驗組，反硝化培養(yǎng)基中碳源分別采用相同碳含量的丁二酸鈉、酒石酸鉀鈉、葡萄糖、檸檬酸鈉，其他成分保持不變，培養(yǎng)基的pH值為7.0，溫度為30℃。通過本試驗確定高效好氧反硝化菌株最適合的碳源。

(2) pH值試驗：設(shè)置5個試驗組，反硝化培養(yǎng)基的組成同第1.1.2節(jié)(4)所述，但培養(yǎng)基的pH值分別設(shè)定為6.0、6.5、7.0、7.5和8.0，溫度為30℃。通過本試驗確定高效好氧反硝化菌株最適合的pH值范圍。

(3) 溫度試驗：設(shè)置5個試驗組，反硝化培養(yǎng)基的組成同第1.1.2節(jié)(4)所述，培養(yǎng)基的pH值為7.0，反應(yīng)溫度分別控制為20℃、25℃、30℃、35℃和40 ℃。通過本試驗確定高效好氧反硝化菌株最適合的溫度范圍。

1.2.5 好氧反硝化菌株生長曲線的測定

吸取2 mL種子液接種至盛有200 mL反硝化培養(yǎng)基中維持30℃、160 r/min條件下連續(xù)培養(yǎng)，間隔一定時間內(nèi)取樣，測定波長為600 nm處的吸光度，并繪制好氧反硝化菌株的生長曲線。

可以看到，隨著SPP階數(shù)的上升，Er隨θ變化而變化的周期變小.其它分量對θ的依賴關(guān)系隨著階數(shù)的上升也有著類似的變化.這是由于場量中都含有因子ei(nθ+βz-ωt)，n越大，相同的θ所引入的相位就越大，即場量隨θ變化而變化得越快，故場量隨θ分布的周期就越小.

1.3 測試方法

2 結(jié)果與討論

2.1 好氧反硝化菌初篩結(jié)果

好氧顆粒污泥樣品經(jīng)富集培養(yǎng)后，不同梯度富集液進(jìn)一步培養(yǎng)48 h，挑選BTB初篩培養(yǎng)基變藍(lán)的菌落進(jìn)行研究，觀察不同條件下菌落的形態(tài)。經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，稀釋倍數(shù)為10-3和10-4的培養(yǎng)基上菌落較為密集，稀釋倍數(shù)為10-5的培養(yǎng)基上單菌落數(shù)量較多，而稀釋倍數(shù)在10-6以上的培養(yǎng)基上已無菌落生長，見圖1。

從涂布平板上挑取單菌落，采用平板劃線法進(jìn)行分離與純化，由圖1(d)可見共劃分了3個區(qū)域，每個區(qū)域劃3條線，從第一區(qū)域到第三區(qū)域菌落數(shù)逐漸減少，在第三區(qū)域末端可見若干明顯的單菌落，菌落大小約為2 mm，呈規(guī)則圓形，表面光滑黏稠，顏色為不透明淡黃色。

圖1 不同條件下菌落的形態(tài)Fig.1 Colony morphology under different conditions

2.2 初篩菌株反硝化性能的測定

圖2 各菌株反硝化過程中N-N和N-N濃度的變化Fig.2 Change of concentration in the denitrification process of each strain

表1 各菌株培養(yǎng)48 h后對氮的總?cè)コ蔜able 1 Total removal rate of N after 48 h culture for each strain

2.3 菌株Y8的生長曲線

將菌株Y8 接種至反硝化培養(yǎng)基中進(jìn)行好氧反硝化試驗，觀察菌株Y8的生長情況，其試驗結(jié)果見圖3。

圖3 菌株Y8的生長曲線Fig.3 Growth curve of strain Y8

由圖3可見，在好氧條件下，菌株Y8 的遲緩期為0～8 h，此時菌株生長較緩慢；在16～24 h內(nèi)菌體量增長速度最快，到36 h時達(dá)到最大生長量，進(jìn)入穩(wěn)定期；在44 h左右時菌體進(jìn)入衰亡期。

2.4 菌株Y8的鑒定

依據(jù)第1.2.3的方法，對菌株Y8進(jìn)行基因組16SrDNA的提取和PCR擴(kuò)增與測序，將測序得到的基因序列提交至GenBank進(jìn)行Blast檢索，然后用MEGA7.0以領(lǐng)位相接[26](Neighbour-joining)法構(gòu)建菌株Y8系統(tǒng)發(fā)育樹,見圖4。

由圖4可見，菌株Y8與Halomonasvenusta在同一個分支上，同時對該菌株染色得到為革蘭氏陰性菌，外觀呈桿狀，結(jié)合其菌落的形態(tài)(見圖1)，初步判定該菌株Y8為鹽單胞菌。另外，由上述分析可知，菌株Y8具有顯著的好氧反硝化效果，這一點(diǎn)與鹽單胞菌屬具有硝酸鹽和亞硝酸鹽還原能力一致[27]。而孫雪梅等[28]在魚類養(yǎng)殖環(huán)境中分離出的鹽單胞菌X3以及沈輝等[29]在海洋灘涂沉積物中分離出的鹽單胞菌MD5，同屬于鹽單胞菌，均具有較強(qiáng)的脫氮能力，尤其在高鹽環(huán)境下其脫氮能力更為顯著。

2.5 不同操作和運(yùn)行條件對菌株Y8脫氮性能的影響

2.5.1 碳源的影響

碳源不僅可以給細(xì)菌生命活動提供能量，也給細(xì)菌好氧反硝化過程提供電子受體，因此碳源對好氧反硝化菌生長和脫氮性能的影響很大。好氧反硝化菌主要以葡萄糖、乙酸鈉、丁二酸鈉和檸檬酸鈉等為碳源，少數(shù)也以某些難降解有機(jī)物為碳源[30]。本試驗中菌株Y8 分別以酒石酸鉀鈉、丁二酸鈉、檸檬酸鈉、葡萄糖作為唯一碳源時，培養(yǎng)48 h后其反硝化脫氮效果見圖5。

由圖5可見，丁二酸鈉作為碳源的氮去除率最高，菌株Y8培養(yǎng)48 h后氮的去除率達(dá)到77.86%，其次是檸檬酸鈉，氮的去除率高于40%，而以酒石酸鉀鈉作為碳源時，氮的去除率僅為18.14%。因此，在現(xiàn)有的4種碳源中，丁二酸鈉為菌株Y8的最

佳碳源。這是因為丁二酸鈉為微生物呼吸作用時三羧酸循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物，可以被菌株直接利用，同時還能増強(qiáng)硝酸鹽還原酶的活性。葡萄糖雖然屬于易被微生物利用的物質(zhì)，但菌株在利用葡萄糖時需要先水解為小分子有機(jī)酸，所以對氮的去除效果不如丁二酸鈉好[31]。這與Chen等的研究結(jié)果一致，與葡萄糖、蔗糖這類大分子碳源相比，丁二酸鈉和檸檬酸鈉是好氧反硝化作用的優(yōu)選碳源[30]。

2.5.2 pH值的影響

一般認(rèn)為，pH值會引起細(xì)胞膜電荷的變化，進(jìn)而影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，且會影響相關(guān)酶的活性，改變生長環(huán)境中營養(yǎng)物質(zhì)以及有害物質(zhì)的性質(zhì)[31]。因此，pH值對菌株好氧反硝化作用有重要的影響。本試驗設(shè)定pH值范圍為6.0～8.0,研究不同pH值對菌株Y8反硝化脫氮效果的影響，其試驗結(jié)果見圖6。

圖6 不同pH值對菌株Y8脫氮效果的影響Fig.6 Effect of different pH values on nitrogen removal effect of strain Y8

由圖6可見，菌株Y8在pH值為6.0～8.0的范圍內(nèi)均可進(jìn)行好氧反硝化作用，但當(dāng)pH值為6.0時菌株Y8的反硝化能力相對較差，氮的去除率僅為10.02%；當(dāng)pH值為6.5時，氮的去除率最高，脫氮率達(dá)到61.02%；當(dāng)pH值高達(dá)8.0時，氮的去除率也維持在較高水平。因此，菌株Y8達(dá)到最佳反硝化脫氮效果的pH值為6.5，在pH值為6.5～8.0時其也具有較好的反硝化脫氮效果。

2.5.3 溫度的影響

溫度作為影響微生物活動的重要因素之一，對微生物的代謝和活性有重要的影響。本試驗設(shè)定溫度范圍為20～40℃，研究了不同溫度對菌株Y8反硝化脫氮效果的影響，其試驗結(jié)果見圖7。

圖7 不同溫度對菌株Y8脫氮效果的影響Fig.7 Effect of different temperatures on nitrogen removal effect of strain Y8

由圖7可見，菌株Y8在20～40℃溫度范圍內(nèi)均具有一定的活性，說明菌株Y8有較大的溫度適應(yīng)范圍。當(dāng)菌株Y8培養(yǎng)溫度為25℃時，氮的去除率最高，脫氮率高達(dá)59.56%；當(dāng)菌株Y8培養(yǎng)溫度為20℃時，氮的去除率為57.23%，且隨著溫度的升高菌株Y8的脫氮率逐漸下降；當(dāng)菌株Y8培養(yǎng)溫度為30～35℃時，氮的去除率在41%～45%之間；當(dāng)菌株Y8培養(yǎng)溫度升高至40℃時，菌株Y8的脫氮率最低，氮的去除率下降至30%以下。試驗結(jié)果表明：菌株Y8反硝化脫氮效果最佳的溫度為25℃，適應(yīng)的溫度范圍為20～35℃。據(jù)研究，多數(shù)好氧反硝化菌的脫氮性能在過高和過低的溫度時都會被抑制，一般適宜的溫度范圍為25～37℃。Ren等[32]研究發(fā)現(xiàn)，在37℃下Acinetobactersp.YB好氧反硝化菌的脫氮效果最好，微生物生長速率也隨著溫度的升高而升高[32]。本試驗結(jié)果與該文獻(xiàn)報道的結(jié)果基本一致。

3 結(jié) 論

從同步脫氮除磷好氧顆粒污泥中分離、篩選出一株高效好氧反硝化菌株Y8，經(jīng)16SrDNA 序列分析，并結(jié)合形態(tài)和特性分析，確定菌株Y8為鹽單胞菌(Halomonassp.)。該菌株的生長曲線測試結(jié)果表明：約8 h后菌株生長進(jìn)入指數(shù)期，指數(shù)期約持續(xù)28 h，穩(wěn)定期約持續(xù)8 h，44 h后進(jìn)入衰亡期。該菌株的反硝化特性試驗結(jié)果表明：菌株Y8進(jìn)行好氧反硝化時，最佳的碳源、pH值和溫度分別為丁二酸鈉、6.5和25℃，同時在偏堿性條件下，該菌株具有較強(qiáng)的好氧反硝化能力。