丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉對大鼠油酸致急性肺損傷纖維化的干預效應研究

劉志平，李粉英，黃 桑，羅 力，陳遠彬，何光范，曾昭智

[1.廣東藥科大學附屬第二醫(yī)院(廣州新海醫(yī)院)，廣東 廣州 510300；2.廣東省中醫(yī)院，廣東 廣州 510120；3.廣東藥科大學實驗動物中心，廣東 廣州 510006]

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是一種急性的重癥，在臨床并不少見。造成ALI的原因很多，根本原因是肺泡毛細血管的細胞膜因為某些原因通透性增高，往往導致重癥監(jiān)護患者短時間內死亡?，F(xiàn)有研究表明[1-5]，在患者的肺內發(fā)生了多種由炎性因子和炎性細胞浸潤的反應，這些反應在肺泡上皮細胞等作用下被逐級放大，炎性反應也由此更為嚴重。而細胞因子本身的作用又是通過網(wǎng)絡發(fā)揮作用的，具有協(xié)同性和疊加性。現(xiàn)在已經(jīng)有了大量研究證明，ALI早期患者的肺中已經(jīng)出現(xiàn)了纖維化，這種纖維化的程度又直接影響了病情進展，甚至能夠影響預后。因此，通過研究ALI中的炎性因子了解ALI纖維化是怎樣發(fā)生的，以及怎樣或采取何種藥物進行干預，終極目的在于更好地治療ALI，抑或是開辟預防ALI新途徑。遺憾的是目前并沒有特效藥物可以針對ALI進行良好的治療。本研究選擇的藥物是丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉，以期從中國傳統(tǒng)藥物中尋找思路，使用大鼠與油酸，將大鼠誘導出現(xiàn)急性肺損傷纖維化之后再采用藥物進行干預，采大鼠血液檢查白細胞介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和Ⅲ型前膠原(PCⅢ)，探討其可能的作用機制。

1 資料與方法

1.1實驗資料

1.1.1藥物與試劑：丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉注射液(上海上藥第一生化藥業(yè)有限公司，批號：1603102)，IL-1、TNF-α、PCⅢ ELISA檢測試劑盒(上海哈靈生物科技有限公司，批號：201705)，油酸(天津市致遠化學試劑有限公司，批號：2016110142)，10%中性福爾馬林(廣州化學試劑廠，批號：20150303)。

1.1.2儀器：FA2004B電子天平(上海精科天美)，HZT-A1000電子天平(廈門華志)，RM2235切片機(德國徠卡)，AE2000倒置顯微鏡(廈門麥克奧迪)、HCP246恒溫培養(yǎng)箱(德國Memmert)，3K15冷凍離心機(德國SIGMA)，Infinite 200 pro酶標儀(瑞士tecan)，血氣分析儀(美國 ABBOTT 公司)，F(xiàn)orma 902超低溫冰箱(美國Thermo)。

1.1.3動物：本研究所用的均為雄性SD大鼠[由南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許可證號：SYXK(粵)2012-1125，合格證號SCXK(粵)2016-0041]，180～220 g購買好實驗用大鼠后，先將之飼養(yǎng)在屏障環(huán)境中。本次研究經(jīng)過本院醫(yī)學倫理委員會同意。

1.2方法

1.2.1建立ALI 大鼠模型：全部大鼠共66只，將油酸一次性從尾靜脈注射進入大鼠體內，12 h后從大鼠的尾動脈中取約0.2 ml血液監(jiān)測氧合指數(shù)，若達到PaO2/FiO2≤300就說明造模成功，進行下一步工作。

1.2.2分組及各自的處理：取沒有注射油酸的24只大鼠，自尾靜脈中注射與造模組等量的生理鹽水作為對照組。另外在建模成功的大鼠中選取48只，隨機平均分成兩組，其中一組為模型組，另一組為丹參酮治療組，在這兩組小鼠腹腔中以2 ml/kg的量注射生理鹽水。丹參酮治療組腹腔注射丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉注射液10 mg/kg，連續(xù)14 d每天進行一次注射。于停藥第7天隨機處死12只大鼠，第14天時再次處死余下的12只，取相應部位樣品檢測。

1.3觀察指標：體重測定：給藥前、停藥第7天、停藥第14天。血氣分析樣品：大鼠動脈血，時間：給藥前、停藥第7天、停藥第14天。指標：PaO2、PaO2/FiO2。肺指數(shù)、肺組織濕/干重測定時間：停藥第7天、停藥第14天；樣本：大鼠全肺，計算公式：肺指數(shù)=肺重(mg)/體重(g)。干重處理溫度：60 ℃，干重處理時間：72 h；濕/干質量比(W/D)計算目的：肺水腫程度。用大鼠左肺。肺組織病理:停藥第7天、停藥第14天。固定液：10%福爾馬林；樣本：大鼠的右肺上葉，石蠟包埋切片后染色鏡檢。主要觀察指標：肺泡水腫、間質水腫、出血、肺不張、肺壞死、炎性細胞浸潤、肺充血、纖維化等。

1.4血清TNF-α、PCⅢ以及IL-1 含量測定：分別于停藥第7天和第14天大鼠動脈采血3 ml，1 000 r/min離心10 min，分離取用血清，ELISA法測定TNF-α、PCⅢ以及IL-1水平，嚴格按照ELISA試劑盒說明書要求進行操作。

2 結果

2.1丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉對ALI大鼠體重的影響：丹參酮治療組的大鼠體重與其他兩組在停藥7 d和14 d后，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。提示丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉ALI大鼠體重無明顯影響。

表1 丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉對ALI大鼠體重的影響

2.2丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉治療處理后ALI大鼠血液PaO2及PaO2/FiO2結果變化：模型組及丹參酮治療組給藥前PaO2及PaO2/FiO2結果值均明顯低于正常對照組，證明ALI大鼠成功造模。停藥7 d和14 d后，丹參酮治療組與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，明顯高于模型組大鼠，見表2。

表2 丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉對ALI大鼠血液PaO2及PaO2/FiO2結果變化情況

2.3丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉治療處理后ALI大鼠的肺指數(shù)、濕/干重比變化情況：停藥7 d和14 d后，正常對照組肺指數(shù)及濕/干重比均有不同程度降低，丹參酮治療組肺指數(shù)及濕/干重比均有不同程度降低，對比模型組而言，部分結果差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉對ALI大鼠肺指數(shù)以及濕/干重比變化情況

2.4病理學結果

2.4.1肉眼觀察結果：模型組有肺水腫，肺表面出現(xiàn)血紅病變等癥狀，并且體積增大。丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉干預后，血紅病變減少，水腫等接近正常組。

2.4.2光鏡觀察結果：正常組肺泡腔無損壞，未見肺泡炎細胞、肺水腫、支氣管上皮變形、管周炎和支氣管纖維化。模型組鏡下未見肺泡腔，肺泡壁鏡下明顯增厚，可見較多炎細胞，可見明顯肺水腫，支氣管上皮嚴重變形，可見明顯纖維增生伴有肺結構破壞。丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉治療后可見明顯的肺水腫好轉，支氣管變形情況消失，炎細胞明顯減少，纖維化程度大幅減輕，見圖1。

A：正常對照組：HE ×100

2.5丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉對ALI大鼠血液TNF-α、PCⅢ以及IL-1 水平的影響：正常對照組和丹參酮治療組大鼠，相比模型組，在停藥7 d和14 d后，外周血中IL-1、TNF-α、PCⅢ水平均有所降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉對ALI大鼠外周血中IL-1、TNF-α、PCⅢ水平的影響

3 討論

用油酸來制作ALI模型是得到了廣泛應用的ALI研究模型之一，建模容易成功，結果過以滲出、炎性反應和纖維增殖階段為特點[6-8]，早期即可觀察到肺纖維化。

本研究給大鼠注射了一定量的油酸，誘發(fā)了大鼠的肺充血水腫，出現(xiàn)炎性反應，肺泡壁增厚，大量炎細胞浸潤，并且發(fā)生明顯的肺損傷和纖維化，這些變化是對臨床上ALI纖維化進程中病理變化的良好模擬。從PaO2/FiO2≤300及肺水腫、肺指數(shù)等指標來看，造模后的大鼠都明顯高于正常對照[9]，表明進行了成功的造模成功。經(jīng)丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉治療，可見明顯的肺水腫好轉，支氣管變形情況消失，炎細胞明顯減少，纖維化程度大幅減輕，同時能提高動物血液中PaO2、PaO2/FiO2指數(shù)。

ALI纖維化過程中炎性變化有重要意義，IL-1、TNF-α等炎性因子促使大量中性粒細胞聚集于肺組織中，它們一般都黏附于肺毛細血管內皮細胞上，誘發(fā)細胞釋放蛋白酶、氧自由基等，并且釋放更多炎性介質等，損傷細胞，這些就是肺纖維化的病理基礎，由此可能發(fā)生的不僅僅是肺組織中毛細血管通透性增高，使得肺泡液伴隨大量蛋白質滲出，還可能形成透明膜。PCⅢ是膠原纖維所特有的，可以用作機體組織纖維化的標志物，其含量的變化與膠原的形成代謝有一定的相關性，因此用以判斷組織纖維化程度。本實驗發(fā)現(xiàn)在油酸誘導的ALI纖維化模型中TNF-α、PCⅢ以及IL-1 大量表達，再次證明了先前國內外相關文獻研究成果[10-11]，經(jīng)丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉治療后，上述三種因子的水平顯著降低，可以解釋為丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉能夠有效保護ALI纖維化油酸大鼠肺模型，其方式有二，一是直接減少IL-1、TNF-α，二是通過降低PCⅢ，從而減少膠原蛋白沉積在細胞外基質中，從而達到防治ALI纖維化的作用[12]。但本研究并沒有進行信號通路的研究，所以也無法解釋到底哪種調節(jié)機制在疾病的形成中發(fā)揮了作用，因此需要后期實驗室中更加完善的設計和更深入的研究來進行說明。

綜上所述，丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉在某種程度上能夠有效治療油酸模型大鼠ALI纖維化，作用機制可能涉及了炎性因子的調節(jié)作用。但其對炎性因子水平調節(jié)機制和對信號通路的影響需做更進一步的研究。