豬作為人類疾病模型的研究進展

陳雨榮,安星蘭,汪正鑄,張 勝,翟巖輝,代相鵬*,李子義*

(1.吉林大學第一醫(yī)院人類疾病動物模型國家地方聯(lián)合工程實驗室, 長春 130021；2.吉林大學動物醫(yī)學學院, 長春 130062)

動物模型指非人類的活體實驗動物,用于疾病、基因功能、藥學及其他科學問題的研究[1]。 “動物模型”這一術語在文獻中首次出現(xiàn)于上世紀60年代,到目前為止,已有數(shù)以千計有價值的動物模型被應用于醫(yī)學研究的各個領域[2]。 嚙齒類動物是目前數(shù)量最大、應用最廣泛的動物模型。 然而嚙齒類動物與人親緣關系較遠,其遺傳、體型以及壽命與人類有較大差異[3]。 嚙齒類動物模型存在的缺陷限制了研究人員對人類疾病、藥物開發(fā)以及疾病治療方案的研究。 非人靈長類動物與人類親緣關系近,是最好的人類疾病動物模型,但存在實驗費用昂貴、實驗技術復雜、動物資源匱乏和倫理等問題[4]。 大量研究表明,豬與人的氨基酸同源性達84.1%, 在解剖結(jié)構(gòu)、生理代謝以及疾病發(fā)生機理上與人有很多相似之處[5]。 豬作為人類疾病研究的動物模型優(yōu)勢眾多,其應用可追溯到上世紀九十年代末[6]。 以豬作為人類疾病動物模型的研究涉及糖尿病、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、遺傳性疾病、腫瘤以及其他領域,這些模型對于揭示疾病發(fā)生的機制、尋找藥物靶點、開展藥物篩查和藥效評價、找到治療及診斷疾病的方法等具有重要意義。由于豬的品種、獲得模型的方法以及檢測指標差異,造成很多模型在表面效度、結(jié)構(gòu)效度、預測效度方面存在差異,從而影響了豬在人類疾病研究中的應用。 為深入理解不同疾病的豬模型、不同方法建立的豬模型在模擬人類疾病中存在的問題,為更好的利用豬作為人類疾病模型研究人類疾病的發(fā)生發(fā)展和探索藥物治療策略,本文將重點綜述近年來獲得的豬模型在人類疾病研究中的應用現(xiàn)狀和存在的問題,為優(yōu)化豬模型的建立和應用提供理論參考。

1 人類疾病模型豬的研究進展

1.1 糖尿病

我國成人糖尿病患者數(shù)量達1.14 億,高居世界第一[7]。 糖尿病會引起心血管和腦血管疾病、視網(wǎng)膜病變、腎病、周圍神經(jīng)病變以及下肢動脈病變等多種并發(fā)癥[8]。 研究表明,豬在進食方式、胰腺形態(tài)及發(fā)育水平、胃腸道結(jié)構(gòu)、代謝水平以及血糖水平方面與人類非常相似,且糖尿病模型豬在疾病發(fā)展方面更接近人[9-10]。 Ⅰ型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T1DM)的特征是胰島素依賴性,主要是由于胰島β 細胞功能遭到破壞引起胰島素的極度缺乏[11]。 通過胰腺切除術獲得的Ⅰ型糖尿病豬模型的發(fā)病率和死亡率較高且影響了胰腺的外分泌功能,而通過靜脈注射鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ,150 mg/kg)誘導的糖尿病動物存活時間長,更適合用于長期的糖尿病研究[12]。 Ⅱ型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)占糖尿病總?cè)藬?shù)的90%以上,其特征是胰島素抵抗性[13]。 1979 年,Phillips等[14]人培育成自發(fā)性Ⅱ型糖尿病豬“Low K”品系,該品系豬的葡萄糖清除率明顯降低,F-5 代的葡萄糖耐量降低的遺傳率約為0.26,但“Low K”品系葡萄糖耐量降低的特性最終未能維持下來。 Xi 等[15]利用高脂高糖飼料對中國貴州小型豬進行6 個月的誘導飼養(yǎng)后,該豬出現(xiàn)胰島素抵抗、輕度糖尿病和動脈粥樣硬化病變。 該模型豬可能是研究糖尿病性血脂異常并發(fā)動脈粥樣硬化的良好動物模型。吳延軍等[16]采用高脂高糖飼料聯(lián)合低劑量STZ 方法成功建立廣西巴馬小型豬T2DM 模型,該模型豬特征明顯且更為穩(wěn)定,均出現(xiàn)胰島素抵抗和葡萄糖耐量受損等癥狀。 Renner 等[17]培育出在胰島中表達顯性抑制腸促胰島素( glucose-dependent insulinotropic polypeptide receptor, GIP ) 受體(GIPRdn)的轉(zhuǎn)基因豬,該豬葡萄糖耐量受損,胰島素分泌減少,β 細胞數(shù)量減少但凋亡不明顯。GIPRdn轉(zhuǎn)基因豬可用于研究GIP 在葡萄糖穩(wěn)態(tài)和胰腺發(fā)育中的作用。 Umeyama 等[18]培育出人肝細胞核因子(hepatocyte nuclear factor 1α,HNF1α)突變體豬,22 頭轉(zhuǎn)基因仔豬中18 頭在斷奶前死亡,其余仔豬胰島發(fā)育不全,非空腹時血糖高于正常水平,該模型可用于研究青少年發(fā)病的成人型糖尿病(maturity-onset diabetes of the young,MODY)。 胰島素(insulin,INS)基因的突變會引起永久性新生兒糖尿 病 ( permanent neonatal diabetes mellitus,PNDM)[19]。 Renner 等[20]培育出在豬胰島β 細胞中特異性表達INSC94Y的突變體豬,該豬的胰島素蛋白錯誤折疊,糖尿病表型穩(wěn)定且其癥狀可通過胰島素治療改善,是胰島素補充和胰島移植的良好實驗模型(見表1)。

1.2 心血管疾病

動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是心血管疾病發(fā)病的主要病理基礎,嚴重威脅人類健康[21]。Prescott 等[22]發(fā)現(xiàn)了第一個出現(xiàn)自發(fā)性高膽固醇癥和動脈粥樣硬化病變的豬品種。 該豬的載脂蛋白B和載脂蛋白U 的Lpb5 和Lpu1 等位基因發(fā)生突變,豬的動脈出現(xiàn)脂質(zhì)條紋以及鈣化、壞死的斑塊,這些病變特征與人類晚期動脈粥樣硬化病變非常相似。 劉錄山等[23]采用高脂高膽固醇飼料(基礎飼料+2%膽固醇和10%豬油)喂養(yǎng)貴州小香豬12 個月后發(fā)現(xiàn)其血脂水平明顯升高, 并出現(xiàn)AS 病變斑塊,病理形態(tài)學結(jié)果表明這些斑塊具有人類成熟斑塊的特點且病變分布特點也與人類AS 病變一致。 馮大明等[24]選用貴州小香豬,采用頸總動脈球囊損傷方法聯(lián)合高脂飼料喂養(yǎng)方式建立了AS 小型豬模型,模型豬血管內(nèi)膜增厚并出現(xiàn)病理性血管重構(gòu)。此外,Whyte 等[25]人建立了過表達人過氧化氫酶(human catalase,hCat)轉(zhuǎn)基因豬。 轉(zhuǎn)基因仔豬hCat mRNA 表達和hCat 蛋白表達量均升高。 內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)可釋放一氧化氮(NO),進而調(diào)節(jié)血管功能及結(jié)構(gòu)。 Hao 等[26]通過核移植建立了胎盤血管內(nèi)皮細胞過表達eNOS 的轉(zhuǎn)基因豬,研究人員預測該模型豬成年后會出現(xiàn)血管損傷表型(見表2)。

表1 糖尿病模型豬Table 1 Pig models of diabetes

1.3 遺傳性疾病

囊性纖維化(cystic fibrosis,CF)是第7 對染色體上CF 基因突變引起的常染色體隱性遺傳病。 CF小鼠模型無法表現(xiàn)與人類相似的肝、肺、呼吸道及腸道病變[27]。 2008 年,Rogers 等[28]采用腺相關病毒(adeno-associated virus,AAV)介導的同源重組技術獲得了CFTR 雙等位基因敲除豬。 新生CFTR-/-豬的臨床、電生理和病理結(jié)果與CF 新生兒相似,出現(xiàn)胎糞性腸梗阻、胰腺外分泌功能不全等癥狀。2013 年,Stoltz 等[29]建立腸內(nèi)表達CFTR 的CF 豬模型。 CFTR 基因表達可誘導新生仔豬回腸負離子轉(zhuǎn)運,挽救胎糞腸梗阻表型,但無法改善胰腺外分泌功能。 血友病A 是一種X 染色體上的凝血因子Ⅷ異常導致的遺傳性疾病。 2012 年,Kashiwakura等[30]建立了敲除F8 基因的血友病A 豬模型。 模型豬具有與人類血友病A 類似的嚴重出血傾向,且注射人F8 凝血因子可起到治療效果。 家族性高膽固醇血癥(familial hypercholesterolemia,FH)是一種罕見的常染色體顯性遺傳病,患者低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)水平增高并常伴有早發(fā)型冠心病。 Carlson 等[31]利用TALEN 技術構(gòu)建了LDL 受體(LDL receptor,LDLR)基因敲除小型豬,該模型豬是研究FH 的理想實驗動物模型。 家族性腺瘤性息肉病(familial adenomatous polyposis,FAP)是一種常染色體顯性遺傳性疾病,患者整個結(jié)直腸布滿大小不一的腺瘤。 Flisikowska 等[32]通過將突變的腺瘤性息肉病基因(adenomatous polyposis coli,APC)定點插入到豬基因組獲得FAP 豬,具有與人類相似的發(fā)病進程和息肉生長位置。 血管性血友病(von Willebrand disease,vWD)是血管性血友病因子(von Willebrand Factor,vWF)基因突變引起的遺傳性出血性疾病。 利用CRISPR/Cas9 技術敲除豬vWF 雙等位基因,可以獲得vWD 豬模型[33],該豬出血時間明顯延長,表現(xiàn)出嚴重凝血障礙且血漿中無vWF 抗原。 酪氨酸血癥Ⅰ型(hereditary tyrosinemia type I,HT1)是由于延胡索二酰乙酰乙酸水解酶(fumarylacetoacetate hydrolase,FAH)基因突變而導致FAH 缺乏,酪氨酸及其代謝產(chǎn)物蓄積,造成肝損害的伴常染色體隱性遺傳病。 通過敲除豬FAH 基因而建立的人遺傳性HT1 豬模型,仔豬出現(xiàn)嚴重肝損傷和與急性肝衰竭等癥狀。 FAH 基因敲除豬可用于HT1 和自發(fā)性急性肝衰竭的研究以及肝細胞治療效果的臨床前測試[34]。 酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)與人類皮膚白化病的發(fā)生相關。 TYR 雙等位基因突變豬的仔豬皮膚、毛發(fā)和眼睛中的黑色素完全消失,該模型豬是研究人類白化病發(fā)病機制及治療的重要模型[35](見表3)。

表2 心血管疾病模型豬Table 2 Pig models of cardiovascular disease

表3 遺傳性疾病模型豬Table 3 Pig models of hereditary disease

1.4 神經(jīng)退行性疾病

神經(jīng)退行性疾病是一類進行性發(fā)展的致殘,嚴重可致死的疾病,其主要特征為特異性神經(jīng)元的大量丟失。 常見的神經(jīng)退行性疾病包括亨廷頓舞蹈癥(huntington’ s disease, HD)、 阿 爾 茨 海 默 病(alzheimer disease,AD)、帕金森綜合征(parkinson’s disease,PD) 和肌萎縮側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)等。 HD 是由位于第四號染色體上的亨廷頓基因(huntingtin,HTT)發(fā)生突變所導致的常染色體顯性遺傳病。 2001 年建立的htt75Q突變豬并沒有出現(xiàn)HD 表型[36]。 httN208-105Q突變豬腦內(nèi)的變異蛋白雖然可誘導神經(jīng)元凋亡,但轉(zhuǎn)基因豬吮吸困難,存活時間較短[37]。 2018 年,李曉江、李世華和賴良學團隊[38]首次利用CRISPR/Cas9 技術成功建立HTT 基因敲入豬模型,模型豬表現(xiàn)出如體重下降、行為異常以及多棘神經(jīng)元嚴重退行性病變等HD 癥狀。 腦內(nèi)β 淀粉蛋白(amyloid β-protein,Aβ)沉積是誘發(fā)AD 的原因,Aβ 蛋白是由淀粉樣肽前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)水解產(chǎn)生,目前已明確早老素1 基因(presenilin 1,PSEN1)、早老素2 基因(presenilin 2, PSEN2)、APP基因和載脂蛋白E 基因(apolipoprotein E,ApoE)為AD 四大致病基因[39]。 2009 年,Kragh 等[40]建立了APP695sw轉(zhuǎn)基因AD 豬模型,但1 歲的AD 轉(zhuǎn)基因豬沒 有 表 現(xiàn) 出 記 憶 障 礙[41]。 攜 帶 APP695sw和PSEN1M146I雙基因的轉(zhuǎn)基因AD 豬在10-18 月齡的豬腦神經(jīng)元中會出現(xiàn)Aβ-42 的蓄積[42]。 2017 年,Lee 等[43]利用多順反子系統(tǒng)建立了攜帶hAPP、hTau 和hPSEN1 三個突變基因的AD 轉(zhuǎn)基因豬,該轉(zhuǎn)基因豬大腦中出現(xiàn)Aβ-40 和Aβ-42 的蓄積。 PD是神經(jīng)系統(tǒng)退化性疾病,黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元變性死亡是主要誘因,部分患者出現(xiàn)parkin 基因、帕金森蛋白7 基因(DJ-1)和磷酸酶及張力蛋白同源物誘導的蛋白激酶(PTEN-induced putative kinase,PINK)的突變。 但用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)建立的parkin、DJ-1和PINK 三基因敲除豬并未出現(xiàn)PD 癥狀[44]。 同樣,PINK1 和PINK2 雙基因敲除豬直至7 月齡時仍未表現(xiàn)出PD 癥狀[38]。 Nielsen 等[45]采用肌注1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyL-4-phenyL-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP)11 周的方法獲得了具有PD 癥狀的豬,動物出現(xiàn)運動遲緩、僵硬、協(xié)調(diào)和咀嚼困難等癥狀。 ALS 為脊髓前角及腦干運動神經(jīng)元及錐體束進行性變性引起的病征。研究表明,超氧化歧化酶1(superoxide dismutase 1,SOD1)、反式激活應答DNA 結(jié)合蛋白(transactive response DNA binding protein,TARTDP)、融合肉瘤蛋白基因(fused in sarcoma,FUS)、血管生成素(angiogenin,ANG)和自噬受體蛋白基因(optineurin,OPTN)這5 種基因突變后可引起典型的ALS 疾病表型[46]。 實驗表明,hSOD1G93A轉(zhuǎn)基因豬表現(xiàn)有運動神經(jīng)受損、骨骼肌變性等ALS 的典型癥狀[47]。TDP-43M337V突變的轉(zhuǎn)基因豬出現(xiàn)皮膚松弛、運動障礙和過早死亡等癥狀,檢測發(fā)現(xiàn)了PSF 相關的、頻繁出現(xiàn)在的ALS 患者腦神經(jīng)元中的異常RNA 剪接[48](見表4)。

1.5 腫瘤模型

模型豬也被用于研究不同類型的腫瘤的發(fā)生機制。 密蘇里大學[49]通過選育獲得的Sinclair 小型豬具有較高的皮膚黑色素瘤發(fā)病率,且其黑色素瘤與人類黑色素瘤在遺傳上有一定的相似性。Sinclair 豬和德國慕尼黑大學[50]選育的MMSTROLL 豬以及由Libechov 研究所[51]選育的MeLiM豬是常用的自發(fā)黑色素瘤模型。 研究人員發(fā)現(xiàn)黑色素瘤與豬單細胞抗原復合體(swine leukocyte antigen, SLA)、 黑 素 皮 質(zhì) 素 1 型 受 體 基 因(melanocortin 1 receptor,MC1R)和小眼畸形相關轉(zhuǎn)錄因子(microphtalmia-associated transcription factor,MITF)基因等相關[52]。 2011 年,Luo 等[53]利用重組腺相關病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)介導的同源重組基因打靶技術獲得BRCA1基因敲除的雜合子(BRCA1+∕-)乳腺癌Yucatan 小型豬,但均在出生后18 d 內(nèi)死亡。 2015 年,Donninger等[54]分離豬乳腺上皮細胞,用SV40LT(simian virus 40 large t antigen)載體轉(zhuǎn)染獲得永生化的豬乳腺癌細胞,利用RNA 干擾技術使BRCA1 基因失活(BRCA1+∕-)建立了第一個豬乳腺癌細胞系,該細胞系具有乳腺癌干細胞的特征。 2012 年,Leuchs等[55]培育了Tp53R167H(tumor protein 53)基因突變豬,但仔豬表型正常。 隨后,2014 年,Sieren 等[56]也建立了Tp53 基因突變豬,性成熟的純合子豬發(fā)生了淋巴瘤、成骨腫瘤和腎腫瘤病變。 敲除Tp53 的豬可以作為自發(fā)性骨肉瘤豬模型,其長骨和顱骨發(fā)生多個骨肉瘤[57]。 鼠類肉瘤病毒癌基因(kirsten rat sarcoma viral oncogene, KRAS)突變對于胰腺癌、非小細胞肺炎以及大腸癌的發(fā)生至關重要[58-59]。2015 年,Li 等[60]建立的KRAS 基因突變豬的新生仔豬未發(fā)生腫瘤。 Schook 等[61]建立的KRasG12D和TP53R167H誘導表達的轉(zhuǎn)基因豬“oncopig”可發(fā)生間質(zhì)瘤。 Callesen 等[62]通 過 激 活 KRAS 和 cMyc(cellular myelocytomatosis oncogene),失活p53 和成視網(wǎng)膜細胞瘤蛋白基因(retinoblastoma protein,pRB),建立了誘導性“oncopig”腸癌模型,經(jīng)誘導處理后,三分之一的豬表現(xiàn)為十二指腸神經(jīng)內(nèi)分泌癌,并伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。 通過在不同部位誘導這些基因表達,可以獲得“oncopig”軟組織瘤豬模型[63]以及“oncopig”胰腺導管腺癌豬模型[64](見表5)。

表4 神經(jīng)退行性疾病模型豬Table 4 Pig models of neurodegenerative disease

1.6 其它疾病模型

免疫缺陷動物可用于腫瘤標本異種移植以及建立免疫系統(tǒng)人源化動物模型,為研究癌癥的發(fā)病機制和腫瘤藥物的安全性與有效性奠定基礎。SCID(severe combined immunodeficient,SCID)豬可由自然突變或通過基因編輯而得到,涉及Artemis 基因、白介素受體γ 鏈基因(interleukiN-2 receptor gamma gene,IL2RG)和重組活化基因RAG1/2 基因(recombination activating gene 1/2)[65]。 2012 年發(fā)現(xiàn)的Artemis 基因自然突變豬的外周血中缺乏B、T細胞而NK 細胞正常,胸腺和淋巴結(jié)明顯萎縮[66],耳皮下注射的人黑色素瘤細胞和胰腺癌細胞能形成腫瘤[67]。 IL2RG 基因敲除豬的胸腺發(fā)育不全,T、NK 細胞缺乏,B 細胞數(shù)量正常但無法正常分泌抗體和發(fā)揮抗原遞呈作用[68]。 采用鋅指核酸酶技術(zinc-finger nucleases,ZFNs)獲得的IL2RG 基因敲除公豬表現(xiàn)出SCID 樣表型[69]。 CRISPR/Cas9 技術獲得的IL2RG 基因敲除的純合母豬全部表現(xiàn)SCID表型,并且縮短了實驗周期[70]。 2014 年,賴良學團隊[71]發(fā)現(xiàn)RAG1 以及RAG2 雙等位基因突變的仔豬免疫器官發(fā)育不全,外周血中缺乏成熟的B 和T細胞,而RAG2 雜合突變仔豬表型正常。 進一步研究發(fā)現(xiàn),RAG1 基因純合純合敲除豬的新生仔豬胸腺發(fā)育不全且外周血中缺乏成熟T、B 細胞[72]。 將人誘導多能干細胞注入RAG2 雙等位基因敲除豬耳部及腹部,受體豬分別于12 d、7.5 周后在注射部位形成明顯畸胎瘤[73]。 Suzuki 等[74]建立的RAG2 雙等位基因敲豬最長存活至34 d。 而RAG2 和IL2RG雙基因敲除豬的仔豬胸腺發(fā)育異常,外周血中缺乏成熟的B、T 細胞,NK 細胞減少[75]。 IL2RG 和ARTEMS 雙基因敲除豬的仔豬缺乏B、T、NK 細胞[65]。 吉林大學第一醫(yī)院人類疾病動物模型國家地方聯(lián)合工程實驗室李子義、楊永廣團隊聯(lián)合中科院動物所周琪團隊,目前已獲得RAG1 和IL2RG 雙基因突變的(RAG1-/-/IL2Rγ-/Y)SCID 豬,仔豬表現(xiàn)出明顯的SCID 癥狀,這些免疫缺陷動物模型對免疫系統(tǒng)人源化豬模型的建立具有重要意義。

表5 腫瘤模型豬Table 5 Pig models of cancer

2 展望

豬的生理學、解剖學和遺傳學特征與人類非常接近,是目前很多人類疾病的理想動物模型。 表面效度、結(jié)構(gòu)效度、預測效度是評價動物模型的三個方面。 表面效度指模型的表征與人類疾病特征相似,利用人類疾病的發(fā)病機制建立的模型則具有結(jié)構(gòu)效度,模型產(chǎn)生的預測在臨床有效則具有預測效度[76]。 對于糖尿病豬模型,胰腺切除副作用大,表面效度不佳。 利用人工選育、化學或膳食誘導以及基因工程技術建立的豬糖尿病模型均能較好地模擬人類糖尿病的臨床癥狀,具有表面效度,但其中絕大多數(shù)模型仍缺乏結(jié)構(gòu)效度和預測效度。 轉(zhuǎn)GIPRdn模型豬被用于研究利拉魯肽治療青少年MODY 患者的安全性及有效性的研究,具有一定的預測效應[77]。 對于AS 豬模型,豬與人的心血管系統(tǒng)相似度高,豬AS 模型具有較好的表面效度,尚無預測效度。 利用基因工程技術建立的疾病模型表面效度直接,一些通過對致病基因進行編輯從而建立的動物模型還具有結(jié)構(gòu)效度,可以滿足研究者的不同需要,但預測效度尚未體現(xiàn),如敲除CFTR 基因的CF 豬模型以及敲除F8 基因的血友病A 模型等。一些基因工程模型具有結(jié)構(gòu)效度但缺乏表面效度,如轉(zhuǎn)htt75Q的HD 豬模型未表現(xiàn)出HD 表型。

目前,研究人員已經(jīng)成功建立了大量的人類疾病豬模型,這些模型對于研究人類重大疾病發(fā)病機制、尋找預防和治療辦法具有重要意義。 但其中一些模型未形成穩(wěn)定表型、仍無法準確模擬人類疾病以及未能廣泛應用于基礎理論研究等。 因此,在人類疾病豬模型的研究中,我們需要有針對性的深入研究,形成完善的技術體系,并將疾病動物模型建立和疾病發(fā)病機制基礎研究和治療等臨床研究有機結(jié)合,為人類疾病的研究提供適合的動物模型。