不同抗性小鼠ECTV 感染前后重要模式識別受體的組織表達(dá)差異分析

何小兵,王 聰,成溫玉,賈懷杰,陳國華,房永祥,劉翊中,景志忠,*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蘭州 730046； 2.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,蘭州 730030)

病毒感染細(xì)胞后,會釋放出自身的核酸DNA 或RNA,其中DNA 可被胞內(nèi)的DNA 模式識別受體識別,引起轉(zhuǎn)錄因子IRFs 和NF-κB 的活化,進(jìn)而激活I(lǐng)型IFNs 和炎癥因子以及抗病毒基因的表達(dá),啟動早期的抗感染天然免疫反應(yīng)。 因此天然免疫DNA 識別受體是宿主細(xì)胞模式識別受體(PRRs)的重要組成部分,在抵御DNA 病毒以及其他病原感染中具有關(guān)鍵作用[1]。 其中TLR9 是第一個被發(fā)現(xiàn)的DNA 識別受體,位于pDC 和B 細(xì)胞的內(nèi)涵體上,主要識別DNA病毒基因組中非甲基化的CpG-DNA,通過MyD88-IRF7 信號軸誘導(dǎo)I 型IFNs 的產(chǎn)生[2]。 近年來,一系列胞質(zhì)DNA 識別受體被陸續(xù)報道,大部分胞質(zhì)DNA識別受體主要通過STING 誘導(dǎo)I 型IFNs 及IL-1β 和IL-18 的表達(dá),發(fā)揮抗病毒天然免疫作用[3-4]。 目前,DNA 識別受體主要包括Toll 樣受體家族中的TLR9、OAS 樣受體家族中的cGAS 及DAI 和RNA 聚合酶III(RNA pol III)等[1,5-7]。

鼠痘(Mousepox) 是由鼠痘病毒(Ectromelia virus, ECTV)感染嚙齒動物鼠類引起的一種高度接觸性傳染病[8]。 ECTV 是正痘病毒屬的成員,不僅是研究人獸共患痘病毒跨種感染與傳播的模式病原,也是研究痘病毒與宿主天然免疫系統(tǒng)相互作用的良好模型[9]。 研究發(fā)現(xiàn),不同品系小鼠對ECTV感染具有易感性與抗性,其中BALB/c 小鼠對鼠痘易感而C57BL/6 小鼠對其具有抗性[10-13],但人們對其易感/抗性分子機(jī)制,特別是模式識別天然免疫分子機(jī)制與其相關(guān)性研究幾乎為空白,為揭示小鼠抵抗ECTV 感染的模式識別與天然免疫應(yīng)答機(jī)制,首先建立實(shí)時熒光定量PCR 技術(shù)方法(qPCR)[14],對不同抗性品系小鼠在正常狀態(tài)和感染ECTV 后其DNA 識別受體的組織差異表達(dá)進(jìn)行分析比較,探討鼠痘病毒抗性/易感小鼠DNA 模式識別天然免疫信號途徑關(guān)鍵分子的組織表達(dá)差異與抗病性的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

6～8 周齡SPF 級BALB/c 品系小鼠(雌雄各半)40 只,體重20～22 g,購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動物中心[SCXK(甘)2015-001]；6～8 周齡SPF 級C57BL/6 品系小鼠(雌雄各半)40只,購自蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心[SCXK(甘)2015-002]。 為保證小鼠的活動空間,每只鼠籠飼養(yǎng)5 只小鼠,自由采食、飲水,實(shí)驗(yàn)在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所生物安全三級(P3) 實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行[SYXK(甘)2015-003],由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動物福利與倫理管理委員會審核遵循3R 原則(LVRIAEC2016-005)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及毒株

Vero 細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；ECTV 毒株由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存。

1.2 主要試劑

DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal calf serum,FBS)購自美國Gibco 公司；TRIzol Reagent 購自美國Invitrogen 公司；淋巴細(xì)胞分離液購自美國Sigma 公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒,SYBR?Premix ExTaqTMII 試劑盒,DL2000 DNA marker 購自大連寶生物生物工程有限公司等；其他試劑均為化學(xué)純。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 傳代細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)

從液氮中取出裝有Vero 細(xì)胞的凍存管,用少量含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基輕輕將細(xì)胞重懸,然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,37℃、5%CO2恒溫復(fù)蘇培養(yǎng)。

當(dāng)Vero 細(xì)胞形態(tài)良好,且匯合80%～90%時可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。 根據(jù)細(xì)胞生長情況進(jìn)行1 ∶3傳代,傳代后的細(xì)胞仍于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.2 ECTV 的TCID50測定

傳代培養(yǎng)的Vero 細(xì)胞用于病毒滴度測定,每天觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect, CPE)并記錄結(jié)果,一般觀察7～10 d。 按照Reed-Muench 法進(jìn)行計算:lgTCID50=細(xì)胞病變高于50%的病毒稀釋度的對數(shù)+距離比例×稀釋系數(shù)的對數(shù)。 其中,距離比例=(高于50%病變率的百分?jǐn)?shù)-50%)/(高于50%病變率的百分?jǐn)?shù)-低于50%病變率的百分?jǐn)?shù))。

1.3.3 小鼠感染與采樣

將40 只BALB/c 和40 只C57BL/6 小鼠按照參考文獻(xiàn)[3]介紹的方法分別隨機(jī)分為8 組(5 只/組),其中1 組作為空白對照,不進(jìn)行感染；1 組作為感染對照,進(jìn)行感染；其余6 組均為實(shí)驗(yàn)組,感染對照組和實(shí)驗(yàn)組分別按103.5TCID50每只小鼠皮下注射0.1 mL ECTV 液,攻毒后采集感染前后的小鼠組織樣品,其中設(shè)定感染前的樣品為0 hpi(hour post inoculation, hpi)。 實(shí)驗(yàn)組小鼠分別在感染ECTV 后6 h、12 h、24 h、48 h、96 h、144 h 六個時間點(diǎn),采集小鼠血液、心臟、脾、肝、肺、腎、小腸和肌肉組織。

1.3.4 樣品處理

血液樣品采用淋巴細(xì)胞分離液,分離外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)；組織樣品用滅菌PBS 溶液沖洗,剪碎,將5 只小鼠的組織樣品混合,稱重后分裝至無RNA 酶的1.5 mL EP 管中,按每50 ～150 mg組織樣品加入1 mL TRIzol,充分研磨呈勻漿后,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 總RNA 的提取及檢測

取-80℃保存的小鼠PBMC、心臟、肝、脾、肺、腎、肌肉、小腸組織各一管,按TRIzol Reagent 法提取各組織總RNA。 用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量,用核酸濃度測定儀檢測提取的RNA 純度,當(dāng)OD260與OD280的比值在1.8 ～2.1 范圍內(nèi)時,表明提取RNA 樣品的質(zhì)量比較好。 提取RNA 時依據(jù)0 hpi、6 hpi、12 hpi、24 hpi、48 hpi、96 hpi、144 hpi 七個不同時間點(diǎn)分批提取,避免單次提取樣品數(shù)量過多造成的RNA 降解或污染等問題。

1.3.6 cDNA 的合成

參照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒說明進(jìn)行兩步法反轉(zhuǎn)錄合成小鼠七個時間點(diǎn)的8 種組織的cDNA 模板。 反應(yīng)總體系為20 μL,反應(yīng)步驟及程序如下:

(1)根據(jù)核酸濃度測定儀檢測的各RNA 樣品的濃度,計算反應(yīng)體系中需加入1.0 μg RNA 樣品時其所需加入的體積,每個無RNA 酶的PCR 管中應(yīng)加入的組分如下:

RNA 模板(RNA template)＜1.0 μg,基因組DNA消除劑(gDNA Eraser)1.0 μL,5×DNA 消除劑緩沖液(5×DNA Eraser Buffer)2.0 μL,無RNA 酶水(RNA free water)X μL,總體積補(bǔ)足到10.0 μL。

(2)將上述反應(yīng)液充分混合,短暫離心后置于42℃金屬浴反應(yīng)2 min。 反應(yīng)結(jié)束后,將其取出置于冰中。

(3)然后向上述各PCR 反應(yīng)管中再加入以下各反應(yīng)組分:

反轉(zhuǎn)錄酶混合物(PrimeScript RT Enzyme Mix)1.0 μg,反轉(zhuǎn)錄引物混合物(RT primer Mix)1.0 μL,5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液(5×Primerscript Buffer)4.0 μL,無RNA 酶水(RNA free water)4.0 μL,總體積補(bǔ)足到10.0 μL。

(4)輕輕混勻后,于PCR 儀中37℃孵育反轉(zhuǎn)錄15 min,85℃變性5 s,反應(yīng)終止即得反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 模板,于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.7 引物設(shè)計

選擇在組織內(nèi)廣泛表達(dá),并高度保守的基因?yàn)閮?nèi)參基因,以其擴(kuò)增的產(chǎn)物作為參照物。 經(jīng)分析確定β-actin 為本實(shí)驗(yàn)的最佳內(nèi)參基因,它在感染前后小鼠的不同組織中表達(dá)高度穩(wěn)定。 根據(jù)NCBI/GenBank 中公布的基因序列,應(yīng)用Primer 3 Input 設(shè)計目的基因與內(nèi)參基因的實(shí)時熒光定量PCR 引物,并采用PrimerBank 對上下游引物進(jìn)行驗(yàn)證,所有引物均由上海英駿生物工程有限公司合成,引物的基本信息見表1。

1.3.8 實(shí)時熒光定量PCR

以上述反應(yīng)體系、反應(yīng)程序和引物對目的基因進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR(qPCR)擴(kuò)增對引物特異性驗(yàn)證,隨后以β-actin 為內(nèi)參基因?qū)λ袑?shí)驗(yàn)樣品中6 個目的基因進(jìn)行定量擴(kuò)增,每個樣品的目的基因與內(nèi)參基因必需一一對照在96 孔板上,均各設(shè)三個技術(shù)重復(fù)及三次生物學(xué)重復(fù),根據(jù)擴(kuò)增后的融解曲線判斷擴(kuò)增的特異性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用2-△△Ct法計算相對表達(dá)量,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)差()表示。 分析感染前目的基因在小鼠PBMC、心臟(heart)、肝(liver)、脾(spleen)、肺(lung)、腎(kidney)、小腸(small intestine)、肌肉(muscle) 組織中的表達(dá)差異,以及小鼠在感染ECTV 前(0 hpi)、感染后(6 hpi、12 hpi、24 hpi、48 hpi、96 hpi、144 hpi)七個時間點(diǎn)的目的基因表達(dá)量的變化。

表1 小鼠重要DNA 識別受體qRT-PCR 引物Table 1 Primers of DNA sensors used for the qRT-PCR assay

2 結(jié)果

2.1 易感/抗性品系小鼠感染模型的建立

按照103.5TCID50接種劑量經(jīng)腹部皮下分別感染BALB/c 和C57BL/6 小鼠,經(jīng)實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn),BALB/c 品系小鼠在感染后第7 天,2 只感染鼠出現(xiàn)一定的感染癥狀,表現(xiàn)為食欲衰退,被毛粗亂,嗜睡,精神不振。 感染后第10 天,5 只BALB/c 小鼠均出現(xiàn)感染癥狀,并有1 只死亡。 而在整個觀察過程中,感染對照C57BL/6 小鼠均未出現(xiàn)臨床癥狀,但提取感染3 d 的C57BL/6 小鼠脾的基因組DNA,普通PCR 擴(kuò)增檢測到ECTV 基因的存在。 這說明BALB/c 和C57BL/6 小鼠對ECTV 存在易感性的差異,本實(shí)驗(yàn)成功地建立了ECTV 的易感/抗性品系小鼠感染模型。

2.2 目的基因qPCR 擴(kuò)增方法的建立

普通PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,如圖1 所示可見各目的基因條帶單一,且大小與預(yù)期一致,表明擴(kuò)增特異性及穩(wěn)定性較好,引物可用于后續(xù)qPCR 擴(kuò)增。

從各目的基因的熔解曲線(圖2)可以看出,所設(shè)計實(shí)時熒光定量PCR 引物擴(kuò)增產(chǎn)物特異性好,無引物二聚體或其他非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物等引起的雜峰出現(xiàn),可用于相應(yīng)目的基因的表達(dá)差異檢測。

2.3 TLR9 在不同品系小鼠組織中的表達(dá)差異分析

2.3.1 TLR9 在正常小鼠組織中的表達(dá)差異

圖1 小鼠重要DNA 識別受體基因的PCR 擴(kuò)增Note.M, DNA marker.1, TLR9.2, DAI.3,cGAS.4, STING.5, RNA Pol III.6, RIG-IFigure 1 Amplification of key DNA sensors genes by PCR

在BALB/c 和C57BL/6 小鼠的PBMC、心臟、肝、脾、肺、腎、小腸、肌肉組織中均能檢測到TLR9的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。 以BALB/c 小鼠的脾平均相對表達(dá)量為對照,結(jié)果表明:TLR9 在BALB/c 小鼠的小腸組織中表達(dá)量最高,其次為脾和肌肉組織,在PBMC、心臟、肝、肺、腎組織中表達(dá)量極低；TLR9 在C57BL/6 小鼠的脾組織中表達(dá)量最高,其次為心臟組織,在PBMC、肝、肺、腎、小腸、肌肉組織中表達(dá)量極低；比較兩種品系小鼠間TLR9 的表達(dá)差異發(fā)現(xiàn),其在C57BL/6 小鼠的脾和心臟組織中的表達(dá)量明顯高于BALB/c 小鼠,而在小腸組織中表達(dá)量明顯低于BALB/c 小鼠(圖3)。

2.3.2 TLR9 在感染小鼠組織中的表達(dá)差異

以0 h 正常小鼠組織平均相對表達(dá)量為對照,結(jié)果表明:在BALB/c 小鼠感染ECTV 后,TLR9 在PBMC、心臟、肝、脾、肺、腎、小腸、肌肉組織中的表達(dá)量均上調(diào),其在感染后第144 h 的PBMC 和肺組織中表達(dá)量最高,在感染后第24 h 的心臟、脾、腎組織中表達(dá)量最高,在感染后第96 h 肝、肌肉組織中表達(dá)量最高,在感染后第48 h 的小腸組織中表達(dá)量最高。

圖2 小鼠重要DNA 識別受體基因的熔解曲線Note.A, TLR9.B, DAI.C, cGAS.D, STING.E, RNA Pol III.F, RIG-I.Figure 2 Dissociation curves of DNA sensor genes for the gene-specific primer

圖3 TLR9 在正常小鼠不同組織中的表達(dá)差異Note.The Y-axis shows the relative expression level of TLR9 mRNA.The X-axis shows the different organic tissues.Compared with the BALB/c group,**P＜0.01,***P＜0.001.Figure 3 Relative level of TLR9 mRNA expression in different tissues from control mice

在C57BL/6 小鼠 感染 ECTV 后, TLR9 在PBMC、肺、小腸等組織中表達(dá)量均上調(diào),其中在PBMC 中表達(dá)最高,可達(dá)28 倍；在PBMC、腎、肌肉等組織的不同時間點(diǎn)均存在明顯的表達(dá)上調(diào)現(xiàn)象,其在感染后第144 h 的PBMC、肝、脾、肺、肌肉組織中表達(dá)量達(dá)到最高,在感染后第6 h 的腎組織中表達(dá)量最高,在感染后第48 h 的小腸組織中表達(dá)量最高；但在脾和心臟組織中表達(dá)下調(diào)(圖4)。

2.4 DAI 在不同品系小鼠組織中的表達(dá)差異分析

2.4.1 DAI 在正常小鼠組織中的表達(dá)差異

BALB/c 小鼠和C57BL/6 小鼠的PBMC、心臟、肝、脾、肺、腎、小腸、肌肉組織中均能檢測到DAI 的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。 以BALB/c 小鼠的脾平均相對表達(dá)量為對照,結(jié)果表明:DAI 在BALB/c 小鼠的肝組織中表達(dá)量最高,其次分別為小腸、脾、心臟、肌肉、腎組織,在PBMC 和肺組織中表達(dá)量極低；DAI 在C57BL/6 小鼠的肌肉組織中表達(dá)量最高達(dá)30 倍,其次為小腸、肺、肝、心臟、脾、腎組織,在PBMC 中表達(dá)量最低；比較兩種品系小鼠間DAI 的轉(zhuǎn)錄表達(dá)差異發(fā)現(xiàn),其在C57BL/6 小鼠的任一組織中的表達(dá)量都高于BALB/c 小鼠(圖5)。

2.4.2 DAI 在感染小鼠組織中的表達(dá)差異

以0 h 正常小鼠的組織平均相對表達(dá)量為對照,結(jié)果表明:在BALB/c 小鼠感染ECTV 后,DAI 在PBMC、心臟、肝、脾、肺、腎、小腸、肌肉組織中表達(dá)量均上調(diào),其在感染后第144 h 的PBMC 和肺臟組織中表達(dá)量最高,在感染后第24 h 的肝、脾、肺、腎、肌肉組織中表達(dá)量最高,在感染后第48 h 心臟、小腸組織中表達(dá)量最高。

在C57BL/6 小鼠感染ECTV 后,DAI 在PBMC中表達(dá)量上調(diào),而在心臟、肝、脾、肺、腎、小腸組織中的表達(dá)量下調(diào),直至第144 h 開始呈現(xiàn)上調(diào)趨勢,其中在脾、心臟、肺和小腸組織上調(diào)最明顯；而在肌肉組織中的表達(dá)量顯著下調(diào)(圖6)。

圖4 TLR9 在感染小鼠不同組織中的表達(dá)差異Note.The Y-axis shows the relative expression level of TLR9 mRNA.The X-axis shows the different time point(h) after infection.Compared with the BALB/c group,*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.Figure 4 Relative mRNA expression level of TLR9 in different tissues of mice after infected ECTV

圖5 DAI 在正常小鼠不同組織中的表達(dá)差異Note.The Y-axis shows the relative expression level of DAI mRNA.The X-axis shows the different organic tissues.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.Figure 5 Relative levels of DAI mRNA expression different tissues from control mice

2.5 cGAS 在不同品系小鼠組織中的表達(dá)差異分析

2.5.1 cGAS 在正常小鼠組織中的表達(dá)差異

BALB/c 和C57BL/6 小 鼠的PBMC、心臟、肝、脾、肺、腎、小腸、肌肉組織中均能檢測到cGAS 的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。 以BALB/c 小鼠脾的平均相對表達(dá)量為對照,結(jié)果表明:cGAS 在BALB/c 小鼠的脾組織中表達(dá)量最高,其次分別為肺、心臟、肌肉、腎組織,在PBMC、肝、小腸組織中表達(dá)量極低；cGAS 在C57BL/6 小鼠的肌肉組織中表達(dá)量最高,其次分別為心臟、脾、肺、肝組織,在PBMC、腎、小腸組織中表達(dá)量極低；比較兩種品系小鼠間cGAS 的表達(dá)差異發(fā)現(xiàn),其在C57BL/6小鼠的PBMC、心、肝、肌肉組織中的表達(dá)量明顯高于BALB/c 小鼠,在脾、肺、小腸和腎的表達(dá)量差別不大(圖7)。

2.5.2 cGAS 在感染小鼠組織中的表達(dá)差異

以0 h 正常小鼠的組織平均相對表達(dá)量為對照,結(jié)果表明:在BALB/c 小鼠感染ECTV 后,cGAS在PBMC、心臟、肝、脾、肺、腎、小腸、肌肉組織中表達(dá)量均上調(diào),其中在感染后第144 h 的PBMC 中表達(dá)量最高,在感染后第96 h 的心臟、肝、脾組織中表達(dá)量最高,在感染后第48 h 腎、肌肉組織中表達(dá)量最高,在感染后第24 h 肺、小腸組織中表達(dá)量最高。

在C57BL/6 小 鼠 感 染 ECTV 后, cGAS 在PBMC、心臟、脾、肺、腎、小腸組織中表達(dá)量變化不大,但在感染后第144 h 的PBMC、心臟、脾、肺、小腸組織中表達(dá)上調(diào)且量最大,在感染后第6 h 的腎組織中表達(dá)量最高；而cGAS 在肝和肌肉組織中的表達(dá)均下調(diào)(圖8)。

圖6 DAI 在感染小鼠不同組織中的表達(dá)差異Note.The Y-axis shows relative expression level of DAI mRNA.The X-axis shows the different time point(h) after infection.Compared with the BALB/c group,*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.Figure 6 Relative mRNA expression level of DAI in different tissues of mice after infected ECTV

圖7 cGAS 在正常小鼠不同組織中的表達(dá)差異Note.The Y-axis shows the relative expression level of cGAS mRNA； The X-axis shows the different organic tissues.Compared with the BALB/c group,*P＜0.05,***P＜0.001.Figure 7 Relative level of cGAS mRNA expression in different tissues from control mice

2.6 RNA pol III 在不同品系小鼠組織中的表達(dá)差異分析

2.6.1 RNA pol III 在正常小鼠組織中的表達(dá)差異

BALB/c 和C57BL/6 小鼠的PBMC、心臟、肝、脾、肺、腎、小腸、肌肉組織中均能檢測到RNA pol III的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。 以BALB/c 小鼠的脾平均相對表達(dá)量為對照,結(jié)果表明:RNA pol III 在BALB/c 小鼠的肌肉組織中表達(dá)量最高,其次分別為心臟、肝、腎、肺、脾、小腸組織,在PBMC 中表達(dá)量最低；RNA polIII在C57BL/6 小鼠的肌肉組織中表達(dá)量最高,其次分別為腎、肺、肝、心臟、脾、小腸組織,在PBMC 中表達(dá)量最低；比較兩種品系小鼠間RNA pol III 的表達(dá)差異發(fā)現(xiàn),其在C57BL/6 小鼠的肌肉組織中表達(dá)量顯著高于BALB/c 小鼠,而在其余組織中的表達(dá)量無明顯品系間差異(圖9)。

2.6.2 RNA pol III 在感染小鼠組織中的表達(dá)差異

以0 h 正常小鼠的組織平均相對表達(dá)量為對照,結(jié)果表明:在BALB/c 小鼠感染ECTV 后,RNA pol III 在PBMC、心臟、肝、脾、肺、腎、小腸、肌肉組織中表達(dá)量均上調(diào),其中在感染后第12 h 的PBMC、心臟、肌肉組織中表達(dá)量最高,在感染后第24 h 的腎、小腸組織中表達(dá)量最高,在感染后第96 h的肝、脾組織中表達(dá)量最高,在感染后第144 h 的肺組織中表達(dá)量最高。

在C57BL/6 小鼠感染ECTV 后,RNA pol III 在PBMC、心臟、肝、脾、肺、小腸、肌肉組織中表達(dá)量均上調(diào),其中在感染后第12 h 的PBMC 中表達(dá)量最高,在感染后第48 h 的心臟、肝組織中表達(dá)量最高,在感染后第144 h 的脾、肺、小腸組織中表達(dá)量最高；而RNA pol III 在腎、肌肉組織中的表達(dá)均呈下調(diào)(圖10)。

2.7 RIG-I 在不同品系小鼠組織中的表達(dá)差異分析

2.7.1 RIG-I 在正常小鼠組織中的表達(dá)差異

圖8 cGAS 在感染小鼠不同組織中的表達(dá)差異Note.The Y-axis shows the relative expression level of cGAS mRNA.The X-axis shows the different time point (h) after infection.Compared with the BALB/c group, *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001.Figure 8 Relative mRNA expression level of cGAS in different tissues of mice after infected ECTV

BALB/c 和C57BL/6 小鼠的PBMC、心臟、肝、脾、肺、腎、小腸組織中均能檢測到RIG-I 的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。 以BALB/c 小鼠脾的平均相對表達(dá)量為對照,結(jié)果表明:RIG-I 在BALB/c 小鼠的肝和肺組織中表達(dá)量較高,其次分別為腎、脾、心臟、小腸組織,在PBMC 中表達(dá)量最低；RIG-I 在C57BL/6 小鼠的肝組織中表達(dá)量最高,其次分別為腎、心臟、脾、肺、小腸組織,在PBMC 中表達(dá)量最低；比較兩種品系小鼠間RIG-I 的表達(dá)差異發(fā)現(xiàn),其在C57BL/6 小鼠的肝、腎、心臟和脾等組織中的表達(dá)量都顯著高于BALB/c 小鼠(圖11)。

2.7.2 RIG-I 在感染小鼠組織中的表達(dá)差異

圖9 RNA pol III 在正常小鼠不同組織中的表達(dá)差異Note.The Y-axis shows the relative expression level of RNA pol ⅢmRNA.The X-axis shows the different organic tissues.Compared with the BALB/c group,*P＜0.05,**P＜0.01.Figure 9 Relative level of RNA pol III mRNA expression in different tissues from control mice

以0 h 正常小鼠的組織平均相對表達(dá)量為對照,結(jié)果表明:在BALB/c 小鼠感染ECTV 后,RIG-I在PBMC、小腸、心臟、腎、肝、脾、肺組織中表達(dá)量均上調(diào),其中在感染后第144 h 的PBMC 中表達(dá)量最高,在感染后第24 h 的心臟、肝、PBMC、脾、肺、腎組織中表達(dá)量最高,在感染后第48 h 的小腸組織中表達(dá)量最高。

在C57BL/6 小 鼠 感 染 ECTV 后, RIG-I 在PBMC、心臟、肝、脾、肺、腎、小腸組織中表達(dá)量均上調(diào),其中在感染后第144 h 的PBMC、心臟、脾、肺、腎組織中表達(dá)量最高,在感染后第12 h 的肝臟組織中表達(dá)量最高,在感染后第6 h 的小腸組織中表達(dá)量最高(圖12)。

3 討論

TLR9 是第一個被發(fā)現(xiàn)的DNA 識別受體,能夠識別微生物基因組中的CpG DNA 序列,激活MyD88 依賴的信號通路,從而促進(jìn)I 型干擾素和促炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)[2]。 DAI 能識別胞質(zhì)中dsDNA,DAI 與DNA 結(jié)合后,一方面介導(dǎo)I 型干擾素的產(chǎn)生,另一方面激活NF-κB 通路產(chǎn)生多種細(xì)胞因子[7]。 cGAS 與胞質(zhì)中DNA 結(jié)合生成cGAMP,進(jìn)而激活STING 并磷酸化TBK1,啟動天然免疫反應(yīng)[3]。RNA pol III 能夠識別胞質(zhì)中的poly (dA ∶dT)即DNA 成分,并轉(zhuǎn)錄成dsRNA,進(jìn)而被RIG-I 識別,激活VISA 并誘導(dǎo)I 型干擾素表達(dá)[1,5]。 本研究旨在探討這些DNA 識別受體表達(dá)差異與小鼠抗病力之間的關(guān)系,進(jìn)而為抗ECTV 感染的天然免疫機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。 因此,本實(shí)驗(yàn)選擇對ECTV 感染易感的BALB/c 小鼠和抗性的C57BL/6 小鼠進(jìn)行研究,通過對其PBMC、心臟、肝、脾、肺、腎、小腸、肌肉等8個組織的TLR9、DAI、cGAS、RNA pol III、RIG-I 基因在ECTV 感染前后轉(zhuǎn)錄表達(dá)的實(shí)時定量檢測,發(fā)現(xiàn)這些重要受體在不同抗性小鼠中的差異表達(dá)特征和規(guī)律,探討其與抗病性間的關(guān)系。

圖10 RNA pol III 在感染小鼠不同組織中的表達(dá)差異Note.The Y-axis shows relative expression level of RNA pol ⅢmRNA.The X-axis is the different time point(h) after infection.Compared with the BALB/c group, *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001.Figure 10 Relative mRNA expression level of RNA pol III in different tissues of mice after infected ECTV

圖11 RIG-I 在正常小鼠不同組織中的表達(dá)差異Note.The Y-axis shows the relative expression level of RIG-I mRNA.The X-axis shows the different organic tissues.Compared with the BALB/c group,*P＜0.05,***P＜0.001.Figure 11 Relative level of RIG-I mRNA expression in different tissues from control mice

圖12 RIG-I 在感染小鼠不同組織中的表達(dá)差異Note.The Y-axis shows the relative expression level of mRNA.The Xaxis shows the different time point(h) after infection.Compared with the BALB/c group,*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.Figure 12 Relative mRNA expression level of RIG-I in different tissues of mice after infected ECTV

在小鼠感染前實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),TLR9 在BALB/c小鼠的小腸和脾組織中表達(dá)量較高,在C57BL/6 小鼠的脾組織中表達(dá)量較高,而在其余組織中均為低水平表達(dá),說明TLR9 可能主要在免疫器官中發(fā)揮重要作用,這與TLR9 在人富含免疫細(xì)胞的組織如脾、淋巴結(jié)、骨髓和外周血中高度表達(dá)的結(jié)論一致[15]。

DAI 分別在BALB/c 小鼠和C57BL/6 小鼠的肝和肌肉組織中表達(dá)量最高,在PBMC 中表達(dá)量最低。 但在不同抗性小鼠間比較發(fā)現(xiàn),其在C57BL/6小鼠的任一組織中的表達(dá)量都高于BALB/c 小鼠。有研究表明,DAI 基因在人的小腸、脾、淋巴結(jié)、扁桃體、骨髓中表達(dá)量較高,而在胸腺、肺、肝、胰腺中表達(dá)量較低[16]。 這說明DAI 在不同組織中的表達(dá)具有明顯的種屬、品系差異性。

cGAS 在BALB/c 小鼠的脾組織中表達(dá)量最高,其次分別為肺、心臟、肌肉、腎組織,在PBMC、肝、小腸組織中表達(dá)量極低；cGAS 除在C57BL/6 小鼠的肌肉組織中表達(dá)量最高外,在其他組織中的表達(dá)趨勢二者基本一致,但cGAS 在C57BL/6 小鼠的PBMC、心臟、肝、肌肉組織中的表達(dá)量明顯高于BALB/c小鼠。

RNA pol III 在BALB/c 小鼠和C57BL/6 小鼠的肌肉組織中表達(dá)量最高,在PBMC 中表達(dá)量最低；比較兩品系小鼠間RNA pol III 的表達(dá)差異發(fā)現(xiàn),其在C57BL/6 小鼠的肌肉組織中表達(dá)量顯著高于BALB/c 小鼠,而在其余組織中的表達(dá)量無明顯品系間差異。 RIG-I 在BALB/c 小鼠和C57BL/6 小鼠的肝組織中表達(dá)量最高,在PBMC 中表達(dá)量最低；比較兩品系小鼠間RIG-I 的表達(dá)差異發(fā)現(xiàn),其在C57BL/6 小鼠的肝、腎、心臟和脾等組織中的表達(dá)量都顯著高于BALB/c 小鼠。 盡管本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這兩個基因在組織中的表達(dá)模式有所不同,但有研究表明,腺病毒和EB 病毒的DNA 在RNA pol III 的作用下轉(zhuǎn)變成5’-ppp-dsRNA,然后被RIG-I 識別,誘導(dǎo)IFNα/β 的表達(dá),這說明RNA pol III 與RIG-I 在識別和應(yīng)答DNA 上具有功能相關(guān)性,且共同發(fā)揮了間接識別和應(yīng)答DNA 的天然免疫[6]。

當(dāng)ECTV 感染BALB/c 小鼠和C57BL/6 小鼠后,檢測上述5 個基因在兩種品系小鼠的八個組織中表達(dá)量的變化,發(fā)現(xiàn)這5 個基因在BALB/c 小鼠的各個組織中表達(dá)均上調(diào),但其表達(dá)峰值出現(xiàn)的時間點(diǎn)在每種組織中有所不同,大多是在感染后第24 h 表達(dá)量達(dá)到最高。 在C57BL/6 小鼠感染ECTV后,除RIG-I 基因整體表達(dá)上調(diào)外,其余4 個基因僅在免疫相關(guān)組織的一些感染時間點(diǎn)特別是144 h 明顯呈峰值上調(diào)表達(dá),在非免疫組織的大多數(shù)感染時間點(diǎn)均呈下調(diào)表達(dá),其中TLR9 和DAI 分別在心臟和肌肉組織中表達(dá)下調(diào),cGAS 在肝組織中的表達(dá)下調(diào),RNA pol III 在腎和肌肉組織中均表達(dá)下調(diào)。

總之,TLR9、DAI、cGAS、RNA pol III 和RIG-I 這5 個與DNA 直接或間接識別相關(guān)的受體在不同抗性小鼠組織中均呈廣泛性表達(dá),但在非感染時C57BL/6 小鼠的表達(dá)明顯高于BALB/c 小鼠,在ECTV 感染后BALB/c 小鼠的這些基因表達(dá)明顯上調(diào),而C57BL/6 小鼠變化不大甚至下調(diào),這種差異表達(dá)現(xiàn)象說明這些基因可能與小鼠的抗病力有關(guān),但具體關(guān)系與機(jī)制需進(jìn)一步深入研究。