茶多酚對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中MCP-1、IL-6表達(dá)水平的影響

高 麗，許 偉，李 萍，楊 琨，宋 琦

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 牙周科，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 病理科，貴州 遵義 563099)

牙周病原微生物可通過(guò)多種途徑影響血管內(nèi)皮細(xì)胞(Vascular endothelial cell,VEC)的功能，在牙周病與心血管疾病的相關(guān)性研究中占有核心地位。牙齦卟啉單胞菌(Porphyrom onas gingivalis,P.g)是紅色復(fù)合體的重要成員之一，被認(rèn)為是證據(jù)充分的高致病性牙周病原菌，在動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[1]。

P.g可產(chǎn)生大量破壞宿主組織的毒力因子，對(duì)細(xì)菌的毒性起到了決定性作用，其中LPS是P.g眾多毒力因子中最為重要的一種因子[2]。

P.g可以侵入各種類型的內(nèi)皮細(xì)胞，包括HUVEC、人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human aortic endothelial cells,HAEC)、心臟內(nèi)皮細(xì)胞[3]，導(dǎo)致細(xì)胞粘附分子表達(dá)的增加，并通過(guò)誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)促進(jìn)炎癥介質(zhì)(IL-6、MCP-1)的產(chǎn)生[4]，從而引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷及功能障礙，這可能是牙周炎與心血管疾病相關(guān)聯(lián)系的機(jī)制之一。由于內(nèi)皮細(xì)胞是動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中受影響的主要細(xì)胞之一，因此它們已廣泛用作體外模型系統(tǒng)，以鑒定牙齦卟啉單胞菌的潛在毒力機(jī)制。近年來(lái)，由于TP對(duì)癌癥和其它多種疾病(糖尿病、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等)具有多重保護(hù)作用而成為研究的重點(diǎn)[5]。TP與牙周疾病的相關(guān)研究認(rèn)為，TP具有一定的抗菌特性，其可抑制中間普氏菌、P.g、伴放線放線桿菌及具核梭桿菌等多種牙周重要致病菌的生長(zhǎng)[6]。

本研究通過(guò)不同濃度的TP干預(yù)牙齦卟啉單胞菌脂多糖(Pg-LPS)誘導(dǎo)的HUVEC炎癥反應(yīng)模型，討論TP對(duì)Pg-LPS誘導(dǎo)的VEC中MCP-1、IL-6表達(dá)水平的影響，初步分析TP對(duì)VEC的調(diào)節(jié)和保護(hù)作用，以期為牙周病及心血管疾病的防治，開(kāi)發(fā)新型抗心血管疾病藥物提供新的思路和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 TP(純度≥98%)，中國(guó)陸圣康源公司；Pg-LPS(美國(guó)InvivoGen公司)；胎牛血清(美國(guó)Hyclone公司)；單道可調(diào)式移液器(德國(guó)Eppendorf公司)；全波段酶標(biāo)檢測(cè)儀(1500，美國(guó)Thermo公司)；倒置顯微鏡(TMS-1015，日本OLYMPUS公司)；電泳儀(美國(guó)BIO-RAD公司)；凝膠圖像分析系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD公司)；熒光倒置顯微鏡(DP50，日本OLYMPUS公司)；IL-6、MCP-1酶聯(lián)免疫試劑盒(伊萊瑞特生物有限公司)；IL-6、MCP-1單克隆抗體(Cell Signaling Technoiogy，英國(guó))；兔抗人VIII因子抗體(博士德，中國(guó))，蛋白marker(Thermo，立陶宛)。

1.2 方法

1.2.1 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定 本研究獲遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，收集產(chǎn)科健康產(chǎn)婦正常足月剖宮產(chǎn)臍帶組織(產(chǎn)婦均知情同意)。嚴(yán)格按照無(wú)菌操作技術(shù)，取長(zhǎng)度約0.2 m的新生兒臍帶，放入預(yù)冷至4℃的無(wú)菌凍存管中(含雙抗的PBS buffer)，迅速轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行HUVEC的分離培養(yǎng)；無(wú)菌盒內(nèi)，用無(wú)菌PBS反復(fù)沖洗靜脈至流出液清亮無(wú)色為止，分離臍靜脈，酶消化法收集細(xì)胞，于37 ℃、5%CO2、飽和適度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞鋪滿瓶底80%～90%后，加入37 ℃預(yù)熱的0.25%胰蛋白酶1 mL，37 ℃、5% CO2、100%濕度培養(yǎng)箱中消化1～2 min，按1∶2進(jìn)行傳代。取3～4代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。采用DAB法進(jìn)行Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化鑒定細(xì)胞來(lái)源。

1.2.2 HUVEC的分組與處理 選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第四代HUVEC，用1mL濃度為0.25%的胰蛋白酶(Trypsin)消化20 min，制成2×105/mL濃度的細(xì)胞懸液，接種于6孔板中，每孔2 mL，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至鋪滿板底80%時(shí)，PBS洗3次，每次1 min，吸盡殘留PBS；按陰性對(duì)照組(Control)、陽(yáng)性對(duì)照組(LPS)、LPS+TP1組、LPS+TP2組分組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔；LPS+TP1組加入5 mg/LTP培養(yǎng)液，LPS+TP2組加入40 mg/LTP培養(yǎng)液，其余組更換原培養(yǎng)液，放入37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育12 h后，去除培養(yǎng)液，用PBS緩沖液沖洗3遍，Control組更換原培養(yǎng)液，另外3組加入Pg-LPS培養(yǎng)液(10 mg/mL)，孵育1d，建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

1.2.3 TP對(duì)Pg-LPS誘導(dǎo)的HUVEC中炎癥因子表達(dá)水平的影響

1.2.3.1 ELISA法檢測(cè)L-6和MCP-1蛋白含量 ①將低溫保存的各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液(-80 ℃冰箱)及ELISA檢測(cè)試劑盒(4 ℃冰箱)取出，靜置0.5 h，平衡至室溫。②建立標(biāo)準(zhǔn)孔:將標(biāo)準(zhǔn)品加入0.5 mL蒸餾水混均，配制成2 000 pg/mL 的溶液，采用倍比稀釋法，使最終獲得MCP-1的濃度分別為240、160、80、40、20 ng/L，IL-6的濃度分別為6、4、2、1、0.5 ng/L。③蛋白測(cè)定:每孔加入待測(cè)樣品10 μL，將反應(yīng)板充分混均，封板，37 ℃ 孵育120 min，洗板；加入100 μL 第一抗體工作液，混均，37 ℃孵育30 min，洗滌。加入50 μL 稀釋好的酶標(biāo)抗體，混均，37 ℃ 孵育30 min，洗滌。加入50 μL 新鮮配制的底物工作液；加入50 μL 反應(yīng)終止液，混均。15 min之內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)處讀取各孔光密度值(Optical density,OD)。

1.2.3.2 Western blot法檢測(cè)IL-6 和MCP-1的蛋白表達(dá)水平 按1.2.2實(shí)驗(yàn)組分組，各實(shí)驗(yàn)組用細(xì)胞刮收集細(xì)胞，加入100 μL漿蛋白抽提試劑(PMSF終濃度為1 mM)，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的的離心管，渦旋混勻，冰浴15 min，12 000 g、4 ℃離心10 min，提取漿蛋白保存?zhèn)溆茫粚?0～100 μL核蛋白抽提試劑(PMSF終濃度為1 mM)加入沉淀，渦旋混勻，冰浴15 min，12 000 g、4 ℃離心10 min，吸取核蛋白保存?zhèn)溆茫凰械鞍讟悠贩謩e經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，分別加入羊抗兔IL-6 和MCP-1單克隆抗體，比例分別為1∶1 000和1∶800，4 ℃搖床孵育過(guò)夜；于搖床上先用TBST洗膜2次，每次10 min，滴加羊抗兔IgG二抗，比例為1∶20 000，37 ℃搖床孵育60 min；TBST洗膜，ECL試劑盒顯影，晾干膠片，圖片掃描，保存；運(yùn)用AlphaEaseFC軟件檢測(cè)蛋白灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 SPSS16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料，兩組數(shù)據(jù)比較采用Student's T-test檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)比較用One-Way ANOVA分析，組間兩兩比較則用LSD-t檢驗(yàn)。以α=0.05 為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 HUVEC的分離與鑒定 在倒置顯微鏡下觀察以酶消化法分離培養(yǎng)的HUVEC，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞接種后生長(zhǎng)迅速，貼壁生長(zhǎng)，3～5 d即可融合成片，表現(xiàn)為鋪路石樣鑲嵌排列的單層生長(zhǎng)(見(jiàn)圖1)。細(xì)胞形態(tài)呈梭形或多角形，邊界清楚，中間突起的部分，可見(jiàn)圓形或橢圓形細(xì)胞核，核仁1～2個(gè)。VEC的Ⅷ因子相關(guān)抗原抗體通過(guò)免疫熒光將細(xì)胞鑒定為HUVEC(見(jiàn)圖2)。

圖1 HUVEC光鏡下形態(tài)(×100)

圖2 Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫熒光染色(×200)

2.2 HUVEC 培養(yǎng)液中的L-6、MCP-1含量 應(yīng)用ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，IL-6、MCP-1的蛋白含量水平在4組間的差異顯著(P<0.05)。HUVEC 中IL-6、MCP-1的分泌明顯受到LPS影響(P<0.05)，TP預(yù)刺激后顯著抑制了LPS刺激HUVEC分泌IL-6、MCP-1的表達(dá)水平(P<0.05)，且高濃度TP預(yù)刺激組(LPS+TP2：40 mg/L)較低濃度預(yù)刺激組(LPS+TP1：5 mg/L)抑制效果更為顯著(P<0.05，見(jiàn)表1)。

表1 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)IL-6、MCP-1的含量

2.3 HUVEC內(nèi)IL-6、MCP-1的蛋白表達(dá) IL-6、MCP-1的蛋白表達(dá)水平在組間比較均有明顯差異(P<0.05)。LPS組、LPS+TP1組、LPS+TP2組的IL-6、MCP-1的蛋白表達(dá)量較陰性對(duì)照組高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而TP預(yù)刺激HUVEC 后，隨著TP濃度的增加，LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞IL-6、MCP-1蛋白表達(dá)水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表2，圖3)。

表2 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)HUVEC 中IL-6、MCP-1蛋白表達(dá)水平(n=3)

圖3 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞IL-6、MCP-1蛋白表達(dá)水平

3 討論

隨著牙周醫(yī)學(xué)的發(fā)展，牙周疾病與全身系統(tǒng)性疾病(癌癥、心血管疾病、糖尿病等)的相關(guān)研究日益受到重視，而茶及其提取物TP通過(guò)研究認(rèn)為可以減少罹患心血管疾病和癌癥的風(fēng)險(xiǎn)，成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)[9]。在治療心血管疾病中，TP可通過(guò)調(diào)節(jié)各種信號(hào)傳導(dǎo)途徑表現(xiàn)出抗炎、抗氧化和抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的作用[10]。相比于抗心血管疾病藥物，茶容易獲取且價(jià)格便宜，被認(rèn)為是控制和管理心血管疾病的有效方法。然而，TP具有多種生物學(xué)和藥理學(xué)特性，其對(duì)心血管疾病的作用機(jī)制尚不完全明確。

大量臨床研究發(fā)現(xiàn)，伴放線聚集桿菌和P.g等牙周主要致病菌可導(dǎo)致外周血中促炎細(xì)胞因子水平升高，其中包括與AS發(fā)病相關(guān)的IL-6、MCP-1等關(guān)鍵炎性標(biāo)志物，炎性介質(zhì)的高表達(dá)也增加了系統(tǒng)性炎癥和感染的風(fēng)險(xiǎn)[11]。Li等研究表明，LPS通過(guò)p44/42和p38 MAPK信號(hào)通路介導(dǎo)增強(qiáng)VEC釋放IL-6[12]，并可刺激VEC分泌MCP-1(也稱趨化因子配體2)，增強(qiáng)單核細(xì)胞的遷移能力并黏附至血管內(nèi)皮表面[13]。

Cai等[14]研究發(fā)現(xiàn)，體外實(shí)驗(yàn)用Pg-LPS刺激小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞(RAW 264.7)，可提高IL-6及TNF-α的分泌水平，Pg-LPS刺激Apo E基因敲除(Apo E-/-)小鼠，可促進(jìn)MCP-1、sICAM-1的表達(dá)增加。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：IL-6、MCP-1表達(dá)水平在陽(yáng)性對(duì)照組(LPS)HUVEC內(nèi)明顯上調(diào)(P<0.05)，且細(xì)胞外MCP-1、IL-6的變化趨勢(shì)與之相同，蛋白含量水平也相應(yīng)上調(diào)。這反映了VEC可受到Pg-LPS的影響，導(dǎo)致促炎介質(zhì)的表達(dá)增加，誘發(fā)機(jī)體局部炎癥反應(yīng)和系統(tǒng)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)AS的進(jìn)展。

研究表明，不同濃度的TP，隨著劑量的增加，能依賴性地降低P.g誘導(dǎo)的口腔上皮細(xì)胞IL-6的表達(dá)水平[15]。TP中的活性物質(zhì)EGCG可抑制P.g誘導(dǎo)的小鼠牙齦組織中TNF-α、IL-6、IL-17和IL-1β等細(xì)胞炎性因子的表達(dá)水平[16]。EGCG還可濃度依賴性的降低TNF-α誘導(dǎo)的MCP-1信使RNA及蛋白的表達(dá)水平，同時(shí)抑制單核細(xì)胞的黏附功能[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：加入不同濃度TP(5、40 mg/L)預(yù)刺激HUVEC后，TP明顯抑制 Pg-LPS誘導(dǎo)的HUVEC的MCP-1、IL-6釋放及細(xì)胞內(nèi)MCP-1、IL-6蛋白的表達(dá)水平。這些數(shù)據(jù)表明，TP能有效下調(diào)HUVEC炎性因子MCP-1、IL-6表達(dá)水平，降低細(xì)胞炎性損傷，對(duì)Pg-LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙具有保護(hù)作用。MCP-1及IL-6是引發(fā)心血管疾病的重要炎癥標(biāo)志物，TP展現(xiàn)出對(duì)其顯著的抑制作用，使TP可能成為潛在的防治心血管疾病及牙周病的有效藥物。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，TP可抑制Pg-LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞MCP-1、IL-6的表達(dá)水平，對(duì)VEC具有一定的保護(hù)作用，為今后TP的藥理作用及心血管疾病和牙周病防治的研究提供了一定的參考。但遺憾的是，本實(shí)驗(yàn)研究是建立在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜕?，沒(méi)有對(duì)體內(nèi)生理狀態(tài)下TP的作用進(jìn)行分析，TP在機(jī)體內(nèi)是否具有同樣的功效還需要更多的研究闡明。