九香蟲提取物對(duì)錳中毒大鼠睪丸損傷的干預(yù)效果及Claudin1作用

李 芳，范曉莉，雷鎮(zhèn)華，戴寶全，王鳳月，侯曉暉

(遵義醫(yī)科大學(xué) 細(xì)胞生物學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

隨著現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展，錳礦石的開采、錳鐵冶煉、汽油抗爆劑及干電池的使用大幅度增加，職業(yè)暴露隨之增加，這也很大程度上增加了錳中毒的機(jī)率。因而，過量的錳也成為一種職業(yè)危險(xiǎn)因素和環(huán)境污染物，其可通過呼吸道、消化道和皮膚接觸直接進(jìn)入機(jī)體，造成機(jī)體多種臟器的損傷[1-2]?，F(xiàn)有研究表明錳暴露會(huì)在一定程度上導(dǎo)致雄性動(dòng)物的生殖器官損傷，錳可通過血睪屏障(Blood-testis barrier,BTB)導(dǎo)致睪丸生精功能障礙，表現(xiàn)為組織萎縮、精子活力降低及數(shù)目減少等[3-4]。然而，錳是如何通過BTB造成生精功能障礙的作用機(jī)制尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，Claudin1作為BTB緊密連接的重要因子之一，在熱應(yīng)激處理后的小鼠睪丸支持細(xì)胞(TM4)中表達(dá)水平有所降低，可通過添加代謝產(chǎn)物肉堿得以恢復(fù)[5]。

九香蟲是一種重要的中藥昆蟲，《中華人民共和國(guó)藥典》載其具有“理氣止痛、溫中助陽(yáng)”之功效，用于腎虛陽(yáng)痿和腰膝酸痛等癥[6]。同時(shí)，九香蟲具有抗菌、抗癌和抗炎等作用[7-10]，亦可修復(fù)錳導(dǎo)致的大鼠生殖器官損傷并影響錳在體內(nèi)的分布[11-13]。本研究先利用錳造成雄性SD大鼠生殖器官損傷，再用九香蟲的石油醚提取物(CcE)進(jìn)行干預(yù)，最后對(duì)大鼠的行為學(xué)、生殖器官臟器系數(shù)、精子數(shù)目及Claudin1的分布和表達(dá)情況進(jìn)行評(píng)價(jià)，以探討CcE對(duì)錳中毒大鼠生殖損傷的干預(yù)效果及Claudin1在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雄性SD大鼠(SPF級(jí))50只，購(gòu)自陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號(hào)：SCXK[渝]2012-0005)。

1.1.2 九香蟲提取液 中藥九香蟲購(gòu)于遵義市百頤醫(yī)藥公司，取一定量干燥的九香蟲打成粗粉后，加入一定體積的石油醚，經(jīng)冷浸、攪拌、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后減壓回收，然后利用真空冷凍干燥獲得九香蟲浸膏，最后用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配制成100 mg/mL的CcE溶液，保存于-20 ℃冰箱備用，使用時(shí)按照需要進(jìn)行稀釋。

1.1.3 主要試劑 Claudin1多克隆抗體購(gòu)于Abcom，β-actin鼠單克隆抗體購(gòu)于Proteintech，免疫組化試劑盒購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)公司，總蛋白定量測(cè)定試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 造模及干預(yù)實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為空白對(duì)照組(A)、錳模型組(B)、CcE低劑量干預(yù)組(C)、CcE中劑量干預(yù)組(D)和CcE高劑量干預(yù)組(E)。除空白對(duì)照組給予生理鹽水外，其余各組按照15 mg/kg腹腔注射氯化錳溶液，連續(xù)30 d；同時(shí)，CcE各劑量組分別按照50、100、200 mg/kg灌胃CcE，連續(xù)30 d。

1.2.2 行為學(xué)觀察 按照常規(guī)方法[11]制備去勢(shì)雌鼠，并于術(shù)后2周用于實(shí)驗(yàn)。去勢(shì)雌鼠在合籠前肌肉注射苯甲酸雌二醇和黃體酮獲得發(fā)情雌鼠，合籠后在紅光燈下觀察15 min，記錄雄鼠的撲捉、騎跨、插入及射精等交配活動(dòng)次數(shù)。

1.2.3 睪丸和附睪臟器系數(shù)及精子數(shù)目測(cè)定 大鼠注射水合氯醛麻醉后，取下雙側(cè)睪丸和附睪進(jìn)行稱重，并計(jì)算其臟器系數(shù)，即臟器重量(g)/體重(g)×100%。

將左側(cè)附睪置于5 mL PBS緩沖液中剪碎尾部，再放入37 ℃水浴箱中孵育15 min后制成精子混懸液，取10 μL精子混懸液與90 μL PBS混合后再取出10 μL置于血球細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，計(jì)算總精子數(shù)n，則精子數(shù)為n×25/5×稀釋倍數(shù)(10)×107/mL。

1.2.4 睪丸組織錳含量測(cè)定 按照常規(guī)方法[13]硝化睪丸組織并逐級(jí)稀釋，利用石墨爐原子吸收光譜法檢測(cè)睪丸中的錳含量，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。錳標(biāo)準(zhǔn)溶液純度為99.99%，濃度為1 000 mg/L，購(gòu)自上海市計(jì)量測(cè)試技術(shù)研究院。

1.2.5 睪丸形態(tài)學(xué)觀察 按照常規(guī)方法進(jìn)行睪丸組織固定、包埋、切片及HE染色，在光鏡下觀察睪丸組織生精小管的細(xì)胞排列及結(jié)構(gòu)完整性。

1.2.6 Claudin1蛋白表達(dá) IHC：按照常規(guī)方法[14]將石蠟切片進(jìn)行脫蠟、脫水等步驟，按免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行操作，一抗為Claudin1多克隆抗體，二抗為生物素化羊抗兔IgG。

Western blot：按照常規(guī)方法[14]提取睪丸組織總蛋白，BCA法測(cè)蛋白濃度，按照蛋白上樣量60 μg進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉等步驟，然后加入Claudin1(1∶1 000)、內(nèi)參β-actin(1∶5 000)以及山羊抗兔二抗(1∶2 000)，凝膠成像系統(tǒng)曝光并保存圖片后定量分析。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué) 錳模型組較空白對(duì)照組大鼠的交配行為各項(xiàng)指標(biāo)(撲捉、騎跨、插入及射精)均明顯降低(P<0.05)；CcE各劑量干預(yù)組較錳模型組大鼠的上述指標(biāo)均明顯升高(P<0.05，見表1)。

表1 CcE對(duì)錳暴露雄性大鼠交配行為的影響

2.2 睪丸和附睪臟器系數(shù)以及精子數(shù)目 錳模型組較空白對(duì)照組大鼠的睪丸和附睪臟器系數(shù)以及精子數(shù)目均明顯減少(P<0.05)；CcE各劑量干預(yù)組較錳模型組大鼠的上述指標(biāo)均有一定程度增加(見表2)。

表2 CcE對(duì)錳暴露雄性大鼠睪丸和附睪臟器系數(shù)及精子數(shù)目的影響

2.3 睪丸組織錳含量 錳模型組較空白對(duì)照組大鼠的睪丸組織錳含量明顯增高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CcE各劑量干預(yù)組較錳模型組大鼠的睪丸組織錳含量均有所降低，其中CcE低劑量干預(yù)組明顯降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖1)。

A：空白對(duì)照組；B：錳模型組；C：CcE低劑量干預(yù)組；D：CcE中劑量干預(yù)組；E：CcE高劑量干預(yù)組；*：與空白對(duì)照組相比，P<0.05；#：與錳模型組相比，P<0.05。

2.4 睪丸組織形態(tài)學(xué)

2.4.1 HE染色 空白對(duì)照組大鼠的生精小管排列整齊、結(jié)構(gòu)完整(見圖2A)。錳模型組大鼠的生精小管上皮萎縮、排列紊亂，生精小管管腔及間隙異常擴(kuò)大(見圖2B)。CcE各劑量干預(yù)組大鼠的睪丸組織得到一定程度修復(fù)，生精小管上皮細(xì)胞排列有序，管腔縮小(見圖2C～E)。

A：空白對(duì)照組；B：錳模型組；C：CcE低劑量干預(yù)組；D：CcE中劑量干預(yù)組；E：CcE高劑量干預(yù)組。

2.4.2 Claudin1分布部位 空白對(duì)照組Claudin1在生精小管中有較高的陽(yáng)性表達(dá)，其中生精小管基膜處呈連續(xù)陽(yáng)性表達(dá)(見圖3A)。與空白對(duì)照組相比，錳模型組Claudin1在生精小管中表達(dá)明顯減少，僅生精小管基膜處呈不連續(xù)陽(yáng)性表達(dá)(見圖3B)。與錳模型組相比，CcE各劑量干預(yù)組Claudin1在睪丸組織表達(dá)均明顯增加，其中CcE中、高劑量組生精小管基膜處呈連續(xù)陽(yáng)性表達(dá)，基本恢復(fù)至空白組水平(見圖3C～E)。

A：空白對(duì)照組；B：錳模型組；C：CcE低劑量干預(yù)組；D：CcE中劑量干預(yù)組；E：CcE高劑量干預(yù)組。

2.5 Claudin1蛋白表達(dá) 與空白對(duì)照組相比，錳模型組大鼠睪丸組織Claudin1蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；CcE中、高劑量干預(yù)組大鼠睪丸組織Claudin1蛋白表達(dá)量顯著增加(P<0.05，見圖4)。

A：空白對(duì)照組；B：錳模型組；C：CcE低劑量干預(yù)組；D：CcE中劑量干預(yù)組；E：CcE高劑量干預(yù)組；*：與空白對(duì)照組相比，P<0.05；#：與錳模型組相比，P<0.05。

3 討論

隨著人們健康意識(shí)的增強(qiáng)，越來(lái)越重視環(huán)境污染對(duì)人和動(dòng)物的負(fù)面影響及其干預(yù)方法[15]。與此同時(shí)，錳作為環(huán)境污染物之一對(duì)人類健康的損傷及其治療方法也逐漸被提上日程。雄性動(dòng)物在錳暴露的過程中，其睪丸組織是敏感性最高的臟器之一[2]。錳可穿過BTB并蓄積于睪丸組織內(nèi)，導(dǎo)致生精小管損傷，使睪丸功能受到抑制，進(jìn)而抑制精子的發(fā)生[16]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)提倡早發(fā)現(xiàn)、早治療，金屬錳作為有毒有害物質(zhì)進(jìn)入人體后到達(dá)敏感器官，如果有藥物能夠有效清除則會(huì)減輕錳對(duì)機(jī)體的損傷。本研究中建模成功的錳中毒大鼠在利用CcE干預(yù)后，大鼠睪丸組織中錳含量顯著降低，說明CcE可能有清除睪丸組織中錳的作用，但具體機(jī)制尚不清楚。

目前，已有許多學(xué)者開展九香蟲及其提取物對(duì)錳中毒大鼠的干預(yù)研究，涉及睪丸、肝臟等多個(gè)器官，對(duì)大鼠的組織形態(tài)、精子數(shù)目、臟器系數(shù)、行為學(xué)、激素水平等均有非常好的修復(fù)作用，可能是通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因p53、Bax、Bcl-2等表達(dá)，阻抑凋亡發(fā)生，或是通過調(diào)節(jié)超氧化物歧化酶等抑制過氧化作用而實(shí)現(xiàn)[12,14,17]。但是對(duì)于錳是如何進(jìn)入睪丸組織以及對(duì)血睪屏障重要組成部分支持細(xì)胞的研究尚屬空白，本研究除了提供睪丸形態(tài)學(xué)、行為學(xué)、錳含量等常規(guī)修復(fù)結(jié)果外，還從BTB重要因子Claudin1入手，通過免疫組化和Western blot檢測(cè)得知Claudin1在CcE干預(yù)后表達(dá)水平有所上升且在支持細(xì)胞周圍分布增多。這也從另一個(gè)角度證實(shí)錳中毒后支持細(xì)胞受損且BTB破壞，后者可以通過CcE的修復(fù)有所改善。

此外，本研究中CcE低劑量組清除錳的作用優(yōu)于其他劑量組，而Claudin1在CcE中、高劑量組表達(dá)更接近正常大鼠，說明不同濃度CcE在干預(yù)效果方面有所不同。因而，對(duì)于CcE的最佳使用濃度或者不同作用時(shí)的最優(yōu)劑量尚不明確，需要繼續(xù)深入研究。

綜上所述，九香蟲石油醚提取物干預(yù)錳中毒大鼠，可以降低睪丸組織中的錳含量，改善大鼠的生殖能力和交配能力，以及修復(fù)睪丸組織Claudin1的表達(dá)。因此，CcE對(duì)錳中毒大鼠的干預(yù)作用可能與修復(fù)BTB重要因子Claudin1有關(guān)。