凝結(jié)芽孢桿菌藥敏實(shí)驗(yàn)的研究

柳成東 于曉東 王乙茹 程志斌* 白華毅 錢錦花 趙 平 Phouthapane Vanhnaseng

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明650201；2.大連市普蘭店區(qū)星臺(tái)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，遼寧大連116200；3.玉溪農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南玉溪653100；4.老撾科技部生物技術(shù)與生態(tài)研究所，老撾萬(wàn)象2279）

近三年來(lái)我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部頒布了多項(xiàng)畜禽養(yǎng)殖“減抗、禁抗”法規(guī)條例，促成了益生菌、天然植物提取物等“替抗”產(chǎn)品在飼料與養(yǎng)殖過(guò)程中的應(yīng)用（王乙茹等，2018；葛長(zhǎng)榮等，2019）。凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）是芽孢桿菌屬、乳酸菌類益生菌（Konuray等，2018；夏濤等，2019a），因其具備乳酸桿菌產(chǎn)酸抑菌以及枯草芽孢桿菌耐熱適合飼料制粒的共同優(yōu)勢(shì)（程志斌等，2017；楊保和等，2018），在畜禽飼料替抗領(lǐng)域得到了越來(lái)越多的關(guān)注（黃遵錫等，2017；Wu等，2018；王乙茹等，2019a）。然而，凝結(jié)芽孢桿菌作為一種腸道發(fā)揮益生作用的革蘭氏陽(yáng)性菌，本課題組（夏濤等，2019b；王乙茹等，2019b）以及他人的動(dòng)物試驗(yàn)（Hung 等，2012）表明：與其他益生菌一樣，飼用凝結(jié)芽孢桿菌改善畜禽生產(chǎn)性能的效果可能會(huì)受到飼料中抑菌藥物的干擾。進(jìn)一步而言，飼料禁抗后提高了畜禽感染各類疾病的風(fēng)險(xiǎn)，養(yǎng)殖過(guò)程中抗生素及抗寄生蟲(chóng)類的保健和治療性藥物投入的頻率和數(shù)量顯著增加，這也可能影響飼用凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)揮益生效果（Barba-Vidal 等，2018；Liu 等，2018）。依據(jù)當(dāng)前我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部的最新規(guī)定：金霉素、吉他霉素等部分抗生素可以在養(yǎng)殖場(chǎng)拌入飼料或飲水作為保健預(yù)防藥物使用，維持動(dòng)物健康；此外，抗球蟲(chóng)類藥物依然可以在肉雞及后備蛋雞的商業(yè)全價(jià)配合飼料中添加，且這些抗球蟲(chóng)藥物均可作為保健預(yù)防藥物在肉雞、蛋雞養(yǎng)殖過(guò)程中拌入飼料或飲水使用。

由此可見(jiàn)，開(kāi)展凝結(jié)芽孢桿菌藥敏實(shí)驗(yàn)，評(píng)估畜禽養(yǎng)殖投入藥物對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌飼用效果的影響，完善凝結(jié)芽孢桿菌在畜禽養(yǎng)殖領(lǐng)域的關(guān)鍵應(yīng)用技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)未來(lái)在無(wú)抗飼料與無(wú)抗養(yǎng)殖條件下，凝結(jié)芽孢桿菌更穩(wěn)定地發(fā)揮益生效果。鑒于目前沒(méi)有針對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌藥敏實(shí)驗(yàn)的系統(tǒng)詳細(xì)報(bào)道，本研究具有一定的科學(xué)和生產(chǎn)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 凝結(jié)芽孢桿菌

課題組從云南省曲靖市富源縣農(nóng)村散養(yǎng)的地方品種豬“大河豬”腸道中，分離出一株產(chǎn)乳酸的芽孢桿菌，該菌株經(jīng)過(guò)課題組系統(tǒng)的理化分析與16s RNA鑒定為凝結(jié)芽孢桿菌，命名凝結(jié)芽孢桿菌YNAU 3127，并用于本次實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 目標(biāo)藥物

從我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第168 號(hào)《飼料藥物添加劑使用規(guī)范》中挑選了4 類（抗革蘭氏陰性菌、抗革蘭氏陽(yáng)性菌、廣譜抗菌、抗球蟲(chóng)）16 個(gè)目標(biāo)藥物，進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)（表1）。目標(biāo)藥物添加劑由飼料生產(chǎn)企業(yè)提供。

表1 目標(biāo)藥物

依據(jù)《飼料藥物添加劑使用規(guī)范》中各類藥物飼料添加劑的允許添加劑量范圍（該藥物添加的上限與下限劑量），采用了“低劑量、中劑量、高劑量”3個(gè)濃度（表2），來(lái)評(píng)估藥物對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌YNAU 3127的抑制效應(yīng)。

表2 目標(biāo)藥物的溶解試劑及抑菌劑量

1.2 牛津杯法實(shí)驗(yàn)步驟及評(píng)估方法

1.2.1 凝結(jié)芽孢桿菌的培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、酵母粉5 g、牛肉膏5 g、葡萄糖5 g、NaCl 2.5 g、CaCl20.15 g、MnSO4·H2O 0.1 g、番茄粉0.5 g、瓊脂2%。

1.2.2 凝結(jié)芽孢桿菌的MRS平板制備

將MRS 固體培養(yǎng)基在121 ℃高壓滅菌鍋中滅菌30 min 后，并冷卻至37 ℃左右后倒入培養(yǎng)皿內(nèi)，約20～25 ml。凝固后待水分干燥，即可涂布。

1.2.3 凝結(jié)芽孢桿菌的培養(yǎng)

從培養(yǎng)皿中挑取單一菌落到裝有100 ml 的MRS培養(yǎng)液的三角錐形瓶中，置于搖床24 h 后，吸取1 ml的凝結(jié)芽孢桿菌活菌液到裝有100 ml的無(wú)菌水中，置于搖床30 min。隨后，取出錐形瓶，將菌液稀釋到10-5作為涂布菌液。

1.2.4 放置牛津杯

將菌液涂干后，在每個(gè)培養(yǎng)皿中放置3個(gè)牛津杯（分別表示低劑量、中劑量、高劑量）。然后，在3個(gè)牛津杯中加入100 μl的不同劑量藥物飼料添加劑溶液。

1.2.5 恒溫培養(yǎng)

將加完抗生素的培養(yǎng)皿放置到40 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48 h。

1.2.6 藥敏結(jié)果判定

以牛津杯法的抑菌圈直徑（diameter of inhibition zone，DIZ）判定藥敏性。抑菌圈直徑的測(cè)定如下：用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑的最大值與最小值，以二者的平均值確定抑菌圈直徑（單位mm）。

藥敏性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)如下：“不敏感”，DIZ=0 mm；“中敏感”，0 mm＜DIZ≤16 mm；“敏感”，DIZ＞16 mm。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。同一藥物的不同劑量之間進(jìn)行單因素方差分析和LSD多重比較，SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

表3結(jié)果顯示：凝結(jié)芽孢桿菌YNAU 3127對(duì)金霉素和土霉素2 個(gè)廣譜抗菌藥物，判定為“敏感”水平（DIZ＞16 mm，表3、圖1和圖2），且金霉素和土霉素的DIZ 值均表現(xiàn)為：高劑量＞中劑量＞低劑量，統(tǒng)計(jì)達(dá)到差異顯著水平（P＜0.05）。此外，該凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)硫酸黏桿菌素、喹烯酮、恩拉霉素、吉他霉素、黃霉素、桿菌肽鋅、亞甲基水楊酸、阿維拉霉素、那西肽等9個(gè)藥物，均判定為“不敏感”（DIZ=0 mm）。

表3 凝結(jié)芽孢桿菌的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果(抑菌圈直徑，mm)

圖1 金霉素對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌的抑制效果

圖2 土霉素對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌的抑制效果

該株凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)甲基鹽霉素、莫能菌素2個(gè)抗生素類的抗球蟲(chóng)藥物，判定為“敏感”水平（DIZ＞16 mm，表3 和圖3）。該菌對(duì)高劑量的鹽霉素判定為“敏感”（DIZ＞16 mm，表3 和圖3），但對(duì)低、中劑量的鹽霉素只達(dá)到“中敏感”水平（0 mm＜DIZ≤16 mm，表3 和圖3）。此外，該株凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)地克珠利、尼卡巴嗪2 個(gè)化學(xué)合成類的抗球蟲(chóng)藥物，判定為“不敏感”（DIZ=0 mm）。

圖3 抗球蟲(chóng)藥物對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌的抑制效果

3 討論

牛津杯法是體外評(píng)估細(xì)菌對(duì)抑菌藥物的藥敏性的公認(rèn)實(shí)驗(yàn)方法，此法具有直觀的優(yōu)點(diǎn)（張學(xué)沛等，2014）。當(dāng)然，牛津杯法也有一定的缺陷，因?yàn)樵u(píng)估的目標(biāo)藥物及其濃度不同、細(xì)菌的數(shù)量級(jí)差異等因素會(huì)影響抑菌圈直徑（DIZ），使藥敏性判定標(biāo)準(zhǔn)很難統(tǒng)一，可能導(dǎo)致藥敏性結(jié)論的差異（張煜等，2011）。目前，凝結(jié)芽孢桿菌藥敏實(shí)驗(yàn)的報(bào)道很少，且無(wú)統(tǒng)一的藥敏性判定標(biāo)準(zhǔn)（趙麗娜，2017；嚴(yán)濤等，2018）。趙麗娜（2017）評(píng)估了慶大霉素、氟苯尼考等10個(gè)常用獸藥抗生素對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌的抑菌效果，其藥敏實(shí)驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)是：“低度敏感”，DIZ＜10 mm；“中度敏感”，10 mm＜DIZ≤18 mm；“高度敏感”，DIZ＞18 mm。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)飼用藥物添加劑的藥敏判定標(biāo)準(zhǔn)如下：“不敏感”，DIZ=0 mm；“中敏感”，0 mm＜DIZ≤16 mm；“敏感”，DIZ＞16 mm。本研究與趙麗娜（2017）藥敏判斷標(biāo)準(zhǔn)的最大區(qū)別在于“不敏感”的判定。此外，依據(jù)本實(shí)驗(yàn)所用的牛津杯（7.8 mm），將牛津杯外徑的2 倍16 mm界定為本實(shí)驗(yàn)“中敏感”與“敏感”的區(qū)分。

表3 結(jié)果顯示，金霉素、土霉素對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌YNAU 3127的DIZ值分別為48～58 mm與33～39 mm，判定為“敏感”。趙麗娜（2017）研究顯示，土霉素對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌的DIZ=37 mm。趙麗娜（2017）從獸藥抗生素角度評(píng)估的結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)從藥物飼料添加劑角度評(píng)估的結(jié)果基本一致，共同說(shuō)明：本研究創(chuàng)新采用的牛津杯法，適合于凝結(jié)芽孢桿菌的藥敏實(shí)驗(yàn)評(píng)估。

甲基鹽霉素、莫能菌素、鹽霉素、尼卡巴嗪、地克珠利等是畜禽常用的抗球蟲(chóng)藥物，應(yīng)用于飼料添加劑和保健獸藥，尤其是飼料“禁抗”后，抗球蟲(chóng)藥物只能用于定期驅(qū)蟲(chóng)保健或獸藥治療（Noack 等，2019）。表3 結(jié)果顯示：該株凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)甲基鹽霉素、莫能菌素以及高劑量的鹽霉素，判定為“敏感”水平；對(duì)低、中劑量的鹽霉素判定為“中敏感”；對(duì)化學(xué)合成類的抗球蟲(chóng)藥物地克珠利和尼卡巴嗪“不敏感”。以上結(jié)果表明，凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)不同類型及其劑量的抗球蟲(chóng)藥物的藥敏性不同。這提示未來(lái)無(wú)抗飼料的養(yǎng)殖生產(chǎn)中，如果畜禽飼糧中添加了凝結(jié)芽孢桿菌，養(yǎng)殖過(guò)程就要科學(xué)選用抗寄生蟲(chóng)藥物，規(guī)避“配伍禁忌”。

此外，該凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)2個(gè)抗革蘭氏陰性菌藥物（硫酸黏桿菌素、喹烯酮）以及7個(gè)抗革蘭氏陽(yáng)性菌藥物（恩拉霉素、吉他霉素、黃霉素、桿菌肽鋅、亞甲基水楊酸、阿維拉霉素、那西肽），判定為“不敏感”。課題組依據(jù)這一藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果，完成的飼養(yǎng)試驗(yàn)表明（王乙茹等，2019b）：肉雞飼料中凝結(jié)芽孢桿菌可以與阿維拉霉素組合使用，且生長(zhǎng)性能優(yōu)于單一使用阿維拉霉素。因此，現(xiàn)有的體內(nèi)（王乙茹等，2019b）、體外試驗(yàn)（表3）均證明：如果飼糧是添加了凝結(jié)芽孢桿菌的無(wú)抗飼料，畜禽養(yǎng)殖過(guò)程中治療和保健藥物的選用需要考慮科學(xué)配伍，這樣才能發(fā)揮藥物以及補(bǔ)充有益菌凝結(jié)芽孢桿菌的共同效果。

4 結(jié)論

本研究創(chuàng)新采用牛津杯法，開(kāi)展了凝結(jié)芽孢桿菌的藥敏實(shí)驗(yàn)。研究結(jié)果表明，該法科學(xué)準(zhǔn)確、清晰簡(jiǎn)潔、操作方便，完善了凝結(jié)芽孢桿菌在畜禽無(wú)抗養(yǎng)殖領(lǐng)域的關(guān)鍵應(yīng)用技術(shù)。