RACK1、HSF1、E-cadherin 在宮頸癌中的表達(dá)及與臨床特征、預(yù)后的關(guān)系

胡娟，張洪波，劉榮華

江漢大學(xué)附屬醫(yī)院/武漢市第六醫(yī)院1婦產(chǎn)科，2檢驗(yàn)科，武漢 430014

3華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院婦產(chǎn)科，武漢 430030

宮頸癌為女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，以陰道出血、陰道排液為主要癥狀，近年來隨著腫瘤篩查的普及及治療技術(shù)的進(jìn)步，其發(fā)生率及病死率已有所下降，但仍有較多患者死于腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移[1]。因此臨床對(duì)于宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究及預(yù)后影響因素的探討有重要價(jià)值。分子生物學(xué)指標(biāo)為近年來宮頸癌預(yù)后研究的重點(diǎn)，不僅能夠預(yù)測(cè)臨床結(jié)局，且可利于療效評(píng)估及靶向治療[2]。激活的激酶C受體1（receptor for activated C kinase 1，RACK1）可與多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子相互作用，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化等過程，在多種惡性腫瘤中高表達(dá)[3]。熱休克轉(zhuǎn)錄因子1（heat shock transcription factor 1，HSF1）為機(jī)體重要的轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)控腫瘤間質(zhì)細(xì)胞生成，促進(jìn)惡性腫瘤發(fā)生[4]。E-鈣黏蛋白（E-cadherin）作為一種鈣離子依賴性跨膜糖蛋白，可維持上皮細(xì)胞間黏附，其表達(dá)下調(diào)是引起腫瘤發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移的主要誘因之一[5]。目前臨床上缺乏宮頸癌聯(lián)合檢測(cè)RACK1、HSF1、E-cadherin表達(dá)的研究報(bào)道，本研究旨在探討其在宮頸癌發(fā)生中的機(jī)制，并分析其與臨床特征及預(yù)后的關(guān)系，為此類患者尋找新的防治靶點(diǎn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2011年6月至2013年1月武漢市第六醫(yī)院收治的宮頸癌患者的病歷資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)病理組織活檢證實(shí)為宮頸癌；②病歷資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①接受新輔助放化療；②全子宮切除史；③全身系統(tǒng)明顯病變。根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，共納入宮頸癌患者68例，年齡31～73歲，平均（46.82±7.84）歲；病理類型：腺癌55例，鱗狀細(xì)胞癌13例；臨床分期：Ⅰ期10例，Ⅱ期14例，Ⅲ期44例；分化程度：低分化32例，中分化29例，高分化7例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移50例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例。選取同期28例宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）患者，年齡30～70歲，平均（44.93±8.82）歲。另選取23例因子宮肌瘤行全子宮切除術(shù)患者，年齡33～70歲，平均（45.90±9.17）歲。3組受試者的年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。分別選取宮頸癌患者、CIN患者、全子宮切除患者的宮頸癌組織、CIN組織及正常宮頸組織。

1.2 主要試劑和儀器

鼠抗人RACK1單克隆抗體、鼠抗人HSF1單克隆抗體、鼠抗人E-cadherin單克隆抗體均購(gòu)自上海田源生物技術(shù)有限公司；蘇木精購(gòu)自上海科興商貿(mào)有限公司；中性樹脂膠購(gòu)自北京鑫鼎鵬飛科技發(fā)展有限公司；免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海戶實(shí)醫(yī)藥科技有限公司；濃縮型二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）購(gòu)自紹興迪申生物技術(shù)有限公司。A550石蠟切片機(jī)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；GD（J）W-010低溫箱購(gòu)自西安恒茂動(dòng)力科技有限公司；GZX-DH.400-BS-Ⅱ電熱恒溫培育箱購(gòu)自西化儀（北京）科技有限公司；HH.W21電熱恒溫水箱購(gòu)自北京同德創(chuàng)業(yè)科技有限公司；ND11-DYY-8C電泳儀購(gòu)自上海壘固儀器有限公司；9700聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀購(gòu)自濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司；LJ-CLP03光學(xué)顯微鏡購(gòu)自北京科譽(yù)興業(yè)科技發(fā)展有限公司。

1.3 檢測(cè)方法

收集相關(guān)宮頸組織，放置于液氮中并轉(zhuǎn)移至-80℃低溫箱中待用。選用免疫組織化學(xué)染色法進(jìn)行測(cè)定，石蠟標(biāo)本進(jìn)行4 μm層厚連續(xù)切片，放置于70℃烤箱中烘烤1.5 h。將切片進(jìn)行二甲苯脫蠟，并予以100%、90%、80%、70%梯度酒精水化。于蒸餾水中漂洗3 min，以PBS沖洗3次。于切片中加入3% H2O2去離子水孵育10 min，抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性。以PBS沖洗3次，參照各抗體要求進(jìn)行相應(yīng)的熱抗原修復(fù)，PBS沖洗3次。于切片中加入適當(dāng)比例稀釋的一抗（RACK1抗體稀釋度為 1∶100，HSF1抗體稀釋度為 1∶50，E-cadherin抗體稀釋度為1∶100），放置于4℃冰箱中過夜。以PBS沖洗3次，加入通用性免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）抗體-辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）多聚體，室溫環(huán)境下放置30 min。以PBS沖洗3次，于每個(gè)切片中加入2滴剛配制的DAB溶液進(jìn)行顯色，在顯微鏡下調(diào)控顯色時(shí)間至陽(yáng)性物質(zhì)出現(xiàn)棕黃色反應(yīng)時(shí)，以自來水沖洗并終止顯色反應(yīng)。取蘇木素進(jìn)行復(fù)染，以自來水再次返藍(lán)，梯度酒精以脫水干燥，二甲苯透明，中性樹脂進(jìn)行封片。

1.4 結(jié)果判定

在高倍鏡（400倍）下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，單個(gè)視野觀察200個(gè)以上細(xì)胞，RACK1陽(yáng)性表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核，HSF1陽(yáng)性表達(dá)在細(xì)胞核，E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)。按染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞所占比例判定結(jié)果。陽(yáng)性細(xì)胞所占比例：51%～100%計(jì)為3分，26%～50%計(jì)為2分，10%～25%計(jì)為1分，＜10%計(jì)為0分。染色強(qiáng)度：棕褐色計(jì)為3分，棕黃色計(jì)為2分，淺黃色計(jì)為1分，無色計(jì)為0分。二者分?jǐn)?shù)乘積≥3分即為陽(yáng)性[6]。

1.5 隨訪

宮頸癌患者均以門診復(fù)診、電話等方式進(jìn)行為期5年的隨訪，明確患者生存情況，統(tǒng)計(jì)5年生存率，其中失訪1例，隨訪率為98.53%。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較采用方差分析；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或連續(xù)矯正法；采用Log-rank檢驗(yàn)分析比較生存情況；采用Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型進(jìn)行多因素分析；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同宮頸組織中RACK1、HSF1、cadherin陽(yáng)性表達(dá)情況的比較

宮頸癌組織中RACK1、HSF1的陽(yáng)性表達(dá)率均高于CIN組織及正常宮頸組織，E-cadherin的陽(yáng)性表達(dá)率分別低于CIN組織及正常宮頸組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（圖1、表1）

圖1 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)宮頸癌、CIN、正常宮頸組織中RACK1、HSF1、E-cadherin的表達(dá)情況（SP染色，×400）

表1 不同宮頸組織中RACK1、HSF1、E-cadherin蛋白陽(yáng)性表達(dá)情況的比較[n（%）]

2.2 不同臨床特征的宮頸癌患者宮頸癌組織中RACK1、HSF1、E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)情況的比較

臨床分期為Ⅲ期、深肌層浸潤(rùn)、低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者的宮頸癌組織中RACK1陽(yáng)性表達(dá)率分別高于臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、淺肌層浸潤(rùn)、中～高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移宮頸癌患者的宮頸癌組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.157、7.955、3.961、14.371，P＜0.05）；臨床分期為Ⅲ期、深肌層浸潤(rùn)、低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者的宮頸癌組織中HSF1陽(yáng)性表達(dá)率分別高于臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、淺肌層浸潤(rùn)、中～高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移宮頸癌患者的宮頸癌組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.126、4.983、5.884、11.730，P＜0.05）；臨床分期為Ⅲ期、深肌層浸潤(rùn)、低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者的宮頸癌組織中E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)率分別低于臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、淺肌層浸潤(rùn)、中～高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移宮頸癌患者的宮頸癌組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=13.421、21.454、37.370、14.985，P＜0.05）；不同年齡及病理類型宮頸癌患者的宮頸癌組織中RACK1、HSF1、E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)情況比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征的宮頸癌患者宮頸癌組織中RACK1、HSF1、E-cadherin的陽(yáng)性表達(dá)情況

2.3 宮頸癌預(yù)后影響因素的單因素分析

不同年齡、病理類型、臨床分期、肌層浸潤(rùn)、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、RACK1、HSF1、E-cadherin表達(dá)的宮頸癌患者的生存情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表3）

2.4 宮頸癌預(yù)后影響因素的多因素分析

將2.3中分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素納入多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型，結(jié)果顯示，年齡＞50歲、腺癌、臨床分期為Ⅲ期、深肌層浸潤(rùn)、低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、RACK1陽(yáng)性表達(dá)、HSF1陽(yáng)性表達(dá)均是影響宮頸癌預(yù)后的危險(xiǎn)因素，E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)是宮頸癌預(yù)后的保護(hù)因素。（表4）

3 討論

宮頸癌是婦科常見腫瘤，目前其發(fā)病率呈年輕化趨勢(shì)，危及患者的生命安全。早期發(fā)現(xiàn)高危人群，并開展針對(duì)性的重點(diǎn)預(yù)防工作能夠一定程度降低其發(fā)生率與病死率[7]。宮頸癌的發(fā)病機(jī)制目前尚無準(zhǔn)確定論，準(zhǔn)確評(píng)估其生物學(xué)行為與預(yù)后情況，對(duì)臨床治療的指導(dǎo)及生活質(zhì)量的改善有重要價(jià)值[8]。國(guó)外研究認(rèn)為，細(xì)胞癌變?yōu)槎嘁蛩?、多階段過程，與系列基因異常表達(dá)相關(guān)[9]。

表3 宮頸癌預(yù)后影響因素的單因素分析（n=68）

表4 宮頸癌預(yù)后影響因素的多因素分析

RACK1的結(jié)構(gòu)特殊，能夠與人類免疫缺陷病毒1型基因、蛋白激酶C等結(jié)合，參與細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[10]。同時(shí)其作為核糖體的重要成分，可調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)產(chǎn)生。既往研究發(fā)現(xiàn)，RACK1于新生血管中高度表達(dá)，可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞對(duì)凋亡的抵抗，利于凋亡基因的降解及活化[11-12]。動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RACK1過表達(dá)組裸鼠腫瘤生長(zhǎng)速度明顯快于未經(jīng)處理的裸鼠[13]。本研究顯示，宮頸癌組織中RACK1陽(yáng)性表達(dá)率高于CIN組織，且其高表達(dá)與臨床分期、肌層浸潤(rùn)、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與臨床研究報(bào)道[14]相似，說明其可一定程度反映宮頸癌的分化程度與侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性特征。經(jīng)Cox回歸分析顯示RACK1陽(yáng)性表達(dá)是影響宮頸癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可作為預(yù)后判斷的觀察指標(biāo)。

HSF1為熱休克反應(yīng)中的主要調(diào)節(jié)因子，可維持細(xì)胞內(nèi)平衡，并參與機(jī)體老齡化、癌癥等生理病理反應(yīng)[15]。近年來，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)其不僅調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞存活基因，且可誘導(dǎo)侵襲轉(zhuǎn)移、細(xì)胞增殖[16]。余少敏等[17]研究認(rèn)為，蛋白質(zhì)翻譯率和HSF1轉(zhuǎn)錄激活聯(lián)系緊密，說明其可通過調(diào)控惡性代謝程序以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞蛋白生成，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。宮頸癌體外實(shí)驗(yàn)顯示，通過影響RNA抑制HSF1表達(dá)，可降低熱休克反應(yīng)通路的相關(guān)熱休克蛋白，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，HSF1在正常宮頸組織、CIN組織及宮頸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率逐步升高，提示HSF1可能參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，此外HSF1在高臨床分期、深肌層浸潤(rùn)、低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移宮頸癌患者宮頸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率高于低臨床分期、淺肌層浸潤(rùn)、中高分化及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，說明HSF1可能與宮頸癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移及惡性程度有關(guān)，有望成為評(píng)估其進(jìn)展程度的新型標(biāo)志物。預(yù)后分析顯示，HSF1表達(dá)與宮頸癌患者預(yù)后有關(guān)，其高表達(dá)可提示預(yù)后不良，由此可推測(cè)HSF1的高表達(dá)可能參與宮頸癌癌基因的激活，影響預(yù)后。

E-cadherin作為一種抑癌基因，可于正常上皮細(xì)胞膜中穩(wěn)定表達(dá)，系列因素可導(dǎo)致其表達(dá)減少或者缺失，引起復(fù)合體解散，并激活多條信號(hào)途徑，減弱細(xì)胞間黏附能力，從而促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)與侵襲[19]。臨床研究報(bào)道，多種腫瘤組織中的E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)率均明顯低于正常組織，并認(rèn)為E-cadherin的表達(dá)下降或者缺失能夠改變細(xì)胞黏附活動(dòng)性及動(dòng)力學(xué)，影響上皮細(xì)胞連接，進(jìn)而參與腫瘤的發(fā)生[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn)，E-cadherin在宮頸癌組織中呈低表達(dá)，其在臨床分期為Ⅲ期、深肌層浸潤(rùn)、低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移宮頸癌患者的宮頸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率更低，說明通過監(jiān)測(cè)E-cadherin表達(dá)情況不僅能夠利于宮頸癌的篩查及診斷，且可反映癌變惡性程度。同時(shí)根據(jù)E-cadherin表達(dá)分析患者預(yù)后可見，其陽(yáng)性表達(dá)者預(yù)后相對(duì)較好，是宮頸癌患者預(yù)后的保護(hù)因素。

綜上所述，RACK1、HSF1、E-cadherin可作為宮頸癌患者臨床特征與預(yù)后的參考指標(biāo)。但本研究樣本量較少，存在一定的抽樣誤差，有待更多累計(jì)研究考評(píng)。