snoRNA87在原發(fā)性肝癌中的表達(dá)及意義

孫菲，張金仿，王克迪，蘇建榮

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100050

原發(fā)性肝癌是一種較為常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，目前研究顯示，生物學(xué)標(biāo)志物診斷原發(fā)性肝癌的靈敏度和特異度均較低，不能對(duì)原發(fā)性肝癌做出準(zhǔn)確診斷[1-2]。小核仁RNA（small nucleolar RNA，snoRNA）是一種非編碼RNA，是人類最早發(fā)現(xiàn)非編碼RNA，snoRNA定位于細(xì)胞核。隨著對(duì)snoRNA的不斷探索和深入研究，目前已知的snoRNA多達(dá)400余種，認(rèn)為snoRNA其基礎(chǔ)作用和對(duì)核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）的修飾、功能的發(fā)揮有關(guān)[3-4]。研究認(rèn)為，snoRNA與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，并參與細(xì)胞周期調(diào)控，在細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用，為研究調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的相關(guān)機(jī)制提供新的研究方向[5-6]。因此，尋找診斷原發(fā)性肝癌的診斷價(jià)值較高的腫瘤標(biāo)志物對(duì)患者尤為重要，本研究探討snoRNA87在原發(fā)性肝癌患者肝癌組織中的表達(dá)及意義，為原發(fā)性肝癌的診治提供新方向，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2014年1月至12月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院收治的100例原發(fā)性肝癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：均經(jīng)病理學(xué)診斷確診為原發(fā)性肝癌，均接受原發(fā)性肝癌手術(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往接受過(guò)化療，合并其他腫瘤、精神障礙或其他嚴(yán)重內(nèi)科疾病患者，妊娠期婦女。100例原發(fā)性肝癌患者中男53例，女47例；年齡35～75歲，＞50歲56例，≤50歲44例；腫塊個(gè)數(shù)：1個(gè)53例，≥2個(gè)47例；腫瘤直徑：＞5 cm 45例，≤5 cm 55例；合并肝硬化35例，未合并肝硬化65例；乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBⅤ）感染：乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）陽(yáng)性（HBsAg+）42例，HBsAg-58例；分化程度：低分化10例，中分化36例，高分化54例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期32例，Ⅲ～Ⅳ期68例，血清甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）濃度：＞200 ng/ml 29例，≤200 ng/ml 71例。取100例原發(fā)性肝癌患者的肝癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁組織，多聚甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片待檢。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免疫組化法檢測(cè)snoRNA87陽(yáng)性表達(dá)情況將肝癌組織及癌旁組織標(biāo)本置于二甲苯中脫蠟處理10 min，梯度乙醇水化；蛋白酶修復(fù)液37℃的恒溫孵化30 min，棄抗原修復(fù)液；切片移入濕盒中加入濃度為3%的過(guò)氧化氫，去過(guò)氧化物酶封閉液，恒溫冰箱孵育10 min，采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）沖洗；加入適量的山羊血清，室溫環(huán)境下封閉30 min；用濾紙將封閉液吸取，加入一抗，放入濕盒，然后再加入二抗，室溫孵育1 h，采用PBS沖洗；二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色處理10 min，顯微鏡下觀察，依據(jù)著色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)算snoRNA87陽(yáng)性表達(dá)率。

1.2.2 熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RTPCR）檢測(cè)snoRNA87的相對(duì)表達(dá)量 依據(jù)試劑盒說(shuō)明書提取總RNA，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增：94℃ 3 min，94℃ 1 min，55℃1 min，72℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)，4℃環(huán)境中保存12 h。以U6為內(nèi)參，采用 2-△△Ct法計(jì)算snoRNA87的相對(duì)表達(dá)量。snoRNA87上游引物：5'-ACCCAGCTGAGGTTGTCTTT-3'，下游引物 ：5'-GGTGGCTTATGTTTGTAATCCC-3'；U6上游引物：5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，下游引物：5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'。

1.2.3 隨訪方法 采用上門、電話回訪及其他通訊方法對(duì)100例患者進(jìn)行為期5年的隨訪，隨訪截止2019年1月。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存率的比較采Log-rank檢驗(yàn)，以受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析各指標(biāo)診斷效能。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 snoRNA87陽(yáng)性表達(dá)率的比較

肝癌組織中snoRNA87的陽(yáng)性表達(dá)率為91%（91/100），明顯高于癌旁組織的14%（14/100），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=118.877，P＜0.01）。

2.2 不同基線特征原發(fā)性肝癌患者肝癌組織中snoRNA87表達(dá)情況的比較

不同性別、年齡、腫瘤直徑、腫塊個(gè)數(shù)、肝硬化情況和HBⅤ感染情況原發(fā)性肝癌患者肝癌組織中snoRNA87陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。不同分化程度、TNM分期、血清AFP濃度原發(fā)性肝癌患者肝癌組織中snoRNA87陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表1）

2.3 RT-PCR檢測(cè)snoRNA87的相對(duì)表達(dá)量

將肝癌組織中snoRNA87相對(duì)表達(dá)量＞10.00的原發(fā)性肝癌患者作為高表達(dá)組（n=62），將肝癌組織中snoRNA87相對(duì)表達(dá)量≤10的原發(fā)性肝癌患者作為低表達(dá)組（n=38），結(jié)果顯示，高表達(dá)組患者snoRNA87的相對(duì)表達(dá)量為（15.35±3.16），明顯高于低表達(dá)組患者的（3.82±1.68），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=19.081，P＜0.01）。

表1 不同基線特征原發(fā)性肝癌患者肝癌組織中snoRNA87表達(dá)情況的比較（n=100）

2.4 生存情況的比較

采用Kaplan-Meier繪制生存曲線，生存率的比較采Log-rank檢驗(yàn)，同時(shí)比較高表達(dá)組和低表達(dá)組患者平均生存時(shí)間、中位無(wú)進(jìn)展生存期（progress free survive，PFS）和總生 存期（overall survival，OS），結(jié)果顯示，高表達(dá)組患者的5年生存率為14.52%（9/62），明顯低于低表達(dá)組患者的42.11%（16/38），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.564，P＜0.01）；高表達(dá)組患者的5年平均生存時(shí)間為（2.13±0.50）年，明顯短于低表達(dá)組患者的（3.56±1.01）年，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.439，P＜0.01）。高表達(dá)組患者的中位PFS為10.6個(gè)月，長(zhǎng)于低表達(dá)組患者的4.5個(gè)月；中位OS為20.4個(gè)月，短于低表達(dá)組患者的32.2個(gè)月。

2.5 snoRNA87對(duì)原發(fā)性肝癌的診斷價(jià)值

snoRNA87診斷原發(fā)性肝癌的ROC曲線下面積（area under the curve，AUC）為 0.734（0.577～0.980），當(dāng)截?cái)嘀禐?8.12時(shí)，診斷靈敏度為93.12%，特異度為94.25%；當(dāng)截?cái)嘀禐?7.59時(shí)，診斷靈敏度為97.58%，特異度為91.32%。（圖1）

圖1 snoRNA87診斷原發(fā)性肝癌的ROC曲線

3 討論

snoRNA是一種非編碼RNA，是人類最早發(fā)現(xiàn)非編碼RNA，主要定位在細(xì)胞核，在對(duì)微小RNA（micro RNA，miRNA）測(cè)序過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，snoRNA在細(xì)胞內(nèi)可經(jīng)過(guò)切割形成不同長(zhǎng)度的RNA片段，且部分snoRNA結(jié)構(gòu)和功能與miRNA相同，生理狀態(tài)下，這部分具有miRNA結(jié)構(gòu)和功能的snoRNA在細(xì)胞核內(nèi)可同時(shí)發(fā)揮其自身功能和miRNA功能。目前研究發(fā)現(xiàn)，部分snoRNA可參與腫瘤發(fā)生和發(fā)展[7-8]。但目前snoRNA與原發(fā)性肝癌的關(guān)系的研究報(bào)道較少，因此，本研究探討snoRNA87在原發(fā)性肝癌患者肝癌組織中的表達(dá)及意義，為臨床上原發(fā)性肝癌的診斷提供新方向。

目前，臨床根據(jù)基因序列、結(jié)構(gòu)、結(jié)合蛋白組分、修飾rRNA的功能不同，可將snoRNA分為boxC/D snoRNA、boxH/ACA snoRNA、孤兒型snoRNA、特異性小卡扎爾體snoRNA，但目前研究最為廣泛的為boxC/D snoRNA和boxH/ACA snoRNA[9-11]。張燕等[12]對(duì)snoRNA及其衍生RNA的研究進(jìn)展進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，snoRNA在正常細(xì)胞功能中發(fā)揮重要作用，其可在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中同時(shí)存在，但處于不同位置的snoRNA功能、轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制仍不明確，還需進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)。國(guó)內(nèi)外有大量研究認(rèn)為，snoRNA與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，并參與調(diào)控細(xì)胞周期，在細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用，為研究調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的相關(guān)機(jī)制提供新的研究方向[13-16]。本研究結(jié)果顯示，肝癌組織中snoRNA87的陽(yáng)性表達(dá)率為91%，明顯高于癌旁組織的14%，且snoRNA87的表達(dá)可能與原發(fā)性肝癌患者的分化程度、TNM分期、血清AFP濃度有關(guān)，表明snoRNA87在原發(fā)性肝癌患者肝癌組織中表達(dá)水平較高，且可能與患者腫瘤分化程度、TNM分期、血清AFP濃度相關(guān)，參與原發(fā)性肝癌的發(fā)生與發(fā)展。研究結(jié)果顯示，snoRNA參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，可作為腫瘤診斷的特異性指標(biāo)[17-20]。本研究對(duì)100例原發(fā)性肝癌患者進(jìn)行為期5年的隨訪，結(jié)果顯示，高表達(dá)組患者的5年生存率為14.52%，明顯低于低表達(dá)組患者的42.11%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且snoRNA87對(duì)原發(fā)性肝癌的診斷靈敏度、特異度均較高，表明snoRNA87對(duì)原發(fā)性肝癌的診斷價(jià)值較高且可對(duì)患者的預(yù)后生存周期進(jìn)行評(píng)價(jià)，但目前尚未有關(guān)于原發(fā)性肝癌患者肝癌組織中snoRNA87高表達(dá)與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究，尚需進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，snoRNA87在原發(fā)性肝癌患者肝癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率較高，且可能與原發(fā)性肝癌患者的分化程度、TNM分期和血清AFP濃度有關(guān)，對(duì)原發(fā)性肝癌的診斷價(jià)值較高。