瞼板腺癌組織p21、p53蛋白表達(dá)及臨床意義

馬宇，周利曉#，劉意

1鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院眼科，鄭州 450052

2鄭州鐵路職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院，鄭州 451460

瞼板腺癌也被稱為麥?zhǔn)舷侔?，是眼瞼惡性腫瘤之一，是一種源于瞼板腺和睫毛的皮脂腺癌，好發(fā)于60歲以上人群，且女性發(fā)病率略高于男性[1]。目前，瞼板腺癌的發(fā)病機(jī)制尚未被臨床完全了解，可能與種族及基因有關(guān)，好發(fā)于上、下眼瞼和淚阜，且以上眼瞼較為常見，但瞼板腺癌的臨床特征不典型，誤診率較高[2]。因瞼板腺癌的病變部位較為特殊，使其對放、化療的敏感性較差，手術(shù)是瞼板腺癌的主要治療方法，臨床對小病變且病變范圍在眼瞼內(nèi)的瞼板腺癌可實施局部手術(shù)切除，而出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的則需實施淋巴結(jié)清掃術(shù)，但因瞼板腺癌的病變部位相對隱匿，術(shù)后復(fù)發(fā)率居高不下[3]。隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，眼瞼部腫瘤的發(fā)病機(jī)制逐漸被闡明，瞼板腺癌作為其中之一，也逐漸受到關(guān)注。p21是一種細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，也是一種新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，其在細(xì)胞中表達(dá)水平降低可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，還可使正常細(xì)胞增生轉(zhuǎn)化為異常，增加細(xì)胞癌變風(fēng)險[4]。p53蛋白作為抑癌因子之一，是人體內(nèi)較為重要的細(xì)胞凋亡因子之一，其在細(xì)胞、組織中缺失或突變，細(xì)胞進(jìn)行惡性病變的關(guān)鍵步驟之一[5]。因此，本研究探討瞼板腺癌患者瞼板腺癌組織p21、p53蛋白表達(dá)及臨床意義，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年6月至2019年6月鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院收治的瞼板腺癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)病理學(xué)診斷為瞼板腺癌；②臨床資料完整；③入組前均未接受藥物治療、化療、放射治療等其他任何治療；④年齡≥18歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤、心腦血管疾病、肝腎功能不全和自身免疫疾病等；②合并嚴(yán)重感染性疾??；③妊娠期或哺乳期婦女。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入80例瞼板腺癌患者，其中男44例，女36例；年齡18～82歲，平均（57.83±15.36）歲，＞50歲43例，≤50歲37例；病變部位：上眼瞼48例，下眼瞼32例；分化程度：低分化35例，中分化26例，高分化19例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移10例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移70例；局部浸潤8例，無局部浸潤72例；復(fù)發(fā)28例，無復(fù)發(fā)52例。取80例瞼板腺癌患者的瞼板腺癌組織，均為1 cm×1 cm×0.5 cm，取材時需避開壞死部位，取其中40例患者所對應(yīng)的癌旁組織，需距瞼板腺癌組織3～5 cm。

1.2 免疫組化法檢測p21、p53蛋白的陽性表達(dá)率

取瞼板腺癌組織正常瞼板組織脫蠟，二甲苯、乙醇、蒸餾水沖洗，置于0.01%枸櫞酸緩沖液中進(jìn)行抗原修復(fù)液，冷卻至室溫后磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）沖洗，3%過氧化氫避光孵育10 min，PBS沖洗。山羊血封閉，滴加一抗，4℃冰箱過夜，次日取出后室溫下靜置30 min，PBS沖洗，滴加二抗，室溫20 min，PBS沖洗。滴加鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶（streptavidin-peroxidase，SP），室溫10 min，PBS沖洗，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色染色，蘇木素復(fù)染，乙醇梯度洗脫干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片。全部操作完成后采用Olympus cx31顯微攝像系統(tǒng)觀察，選取5個視野清晰區(qū)域進(jìn)行結(jié)果判定，5%的PBS代替一抗作為空白對照。

1.3 結(jié)果判定

p21、p53蛋白主要定位于細(xì)胞核，細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或褐色顆粒為陽性。由2名及以上高年資病理科醫(yī)師，在顯微鏡下進(jìn)行雙盲閱片，再將有爭議結(jié)果協(xié)商一致后采納。對染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞比例進(jìn)行評分[6]。染色強(qiáng)度評分：無染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細(xì)胞所占比例評分：0～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，＞50%為3分。將染色強(qiáng)度評分與陽性細(xì)胞比例評分相乘，0～1分為陰性，2～3分為弱陽性，4～5分為中陽性，6分為強(qiáng)陽性。≥2分為陽性，＜2分則為陰性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采取SPSS 17.0軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；相關(guān)性分析采用Spesrman相關(guān)性分析，瞼板腺癌患者瞼板腺癌組織p21、p53蛋白表達(dá)情況影響因素的多因素分析采用Logistic回歸分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 p21、p53蛋白的陽性表達(dá)率比較

瞼板腺癌組織p21、p53蛋白陽性表達(dá)率均明顯高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。（表1）

表1 瞼板腺癌組織及癌旁組織中p21、p53蛋白陽性表達(dá)率的比較[n（%）]

2.2 瞼板腺癌患者瞼板腺癌組織p21、p53蛋白表達(dá)情況影響因素的單因素分析

不同性別、年齡、病變部位瞼板腺癌患者瞼板腺癌組織中p21、p53蛋白陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。不同分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、局部浸潤情況和復(fù)發(fā)情況瞼板腺癌患者瞼板腺癌組織p21、p53蛋白陽性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（表2）

2.3 瞼板腺癌患者瞼板腺癌組織p21、p53蛋白表達(dá)情況影響因素的多因素分析

將單因素分析中差異有統(tǒng)計學(xué)意義的因素（分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、局部浸潤情況和復(fù)發(fā)）作為自變量，瞼板腺癌患者瞼板腺癌組織p21、p53蛋白表達(dá)情況作為因變量納入多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、局部浸潤和復(fù)發(fā)是瞼板腺癌患者瞼板腺癌組織p21蛋白陽性表達(dá)的獨立危險因素（P＜0.05）；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、局部浸潤是瞼板腺癌患者瞼板腺癌組織p53蛋白陽性表達(dá)的獨立危險因素（P＜0.05）。（表3、表4）

表2 瞼板腺癌患者瞼板腺癌組織p21、p53蛋白表達(dá)情況影響因素的單因素分析（n=80）

表3 瞼板腺癌患者瞼板腺癌組織p21蛋白表達(dá)情況影響因素的多因素Logistic回歸分析

表4 瞼板腺癌患者瞼板腺癌組織p53蛋白表達(dá)情況影響因素的多因素Logistic回歸分析

2.4 瞼板腺癌組織中p21蛋白與p53蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，瞼板腺癌組織中p21蛋白與p53蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.413，P＜0.01）。

3 討論

瞼板腺癌主要指人體眼皮上油脂分泌結(jié)構(gòu)瞼板腺出現(xiàn)的腫瘤，其主要表現(xiàn)形式為麥粒腫、霰粒腫，發(fā)病率僅次于基底細(xì)胞癌，但惡性程度遠(yuǎn)超基底細(xì)胞癌，可經(jīng)患者血液和淋巴系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)移，故病死率也較高[7]。瞼板腺癌臨床特點多變，易與瞼板腺囊腫、基底細(xì)胞癌、磷狀細(xì)胞癌等混淆，誤診率和復(fù)發(fā)率均較高[8]。隨著近年對眼部疾病重視程度逐漸提升，部分學(xué)者已逐步將其研究轉(zhuǎn)向瞼板腺癌發(fā)病機(jī)制，并不斷將其向蛋白質(zhì)、基因方向轉(zhuǎn)變，進(jìn)一步為疾病早期診斷、復(fù)發(fā)等提供參考依據(jù)。

p21作為細(xì)胞周期依賴性激酶抑翩蛋白家族成員之一，可負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞周期G1期，主要是通過將細(xì)胞周期停留在G1階段，阻止DNA復(fù)制。p21在受損DNA中作用機(jī)制也有一定差異，p21可在DNA損傷S期前通過與其他蛋白結(jié)合后抑制其功能，進(jìn)而使細(xì)胞停滯于G1周期；當(dāng)DNA損傷處于S期時，可通過讓其他物質(zhì)失活，抑制DNA合成，進(jìn)而修復(fù)細(xì)胞[9-10]。正常細(xì)胞功能協(xié)調(diào)是通過細(xì)胞周期和DNA復(fù)制完成的，當(dāng)其出現(xiàn)p21減少、缺失時會打破該平衡，使得DNA復(fù)制出現(xiàn)異常，可導(dǎo)致正常細(xì)胞周期功能控制出現(xiàn)紊亂[11]。多研究證實，p21表達(dá)缺失與腫瘤細(xì)胞迅速生長密切相關(guān)，且已在胃癌、肺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中證實[12-15]，且本研究對瞼板腺癌組織中p21蛋白陽性表達(dá)率進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，瞼板腺癌組織中p21蛋白陽性表達(dá)率高于癌旁組織。相關(guān)研究顯示，p21是現(xiàn)階段發(fā)現(xiàn)的抑癌基因之一，其在腫瘤組織中高表達(dá)可能是機(jī)體對腫瘤的一種抵抗措施[16]。姜素等[17]研究證實，p21表達(dá)水平與腫瘤分化、增生、轉(zhuǎn)移有關(guān)，且對患者預(yù)后有一定預(yù)測價值，與本研究結(jié)果基本一致。本研究結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、局部浸潤和復(fù)發(fā)是瞼板腺癌患者瞼板腺癌組織p21蛋白陽性表達(dá)的獨立危險因素，表明p21蛋白可能參與瞼板腺癌形成，其表達(dá)水平增加可能意味著瞼板腺腫瘤出現(xiàn)惡化，且與預(yù)后間可能存在一定關(guān)系。

p53是目前人類腫瘤蛋白中發(fā)現(xiàn)的相關(guān)性較高蛋白之一，其基因與編碼蛋白均參與細(xì)胞周期調(diào)控，并參與到細(xì)胞生長、凋亡、分裂，具有一定防止癌變和修改缺陷作用[18]。野生型p53是抑癌基因，其中突變型p53對正常p53蛋白具有一定抑制作用[19]。突變型p53是致癌基因之一，且突變后的細(xì)胞相對較穩(wěn)定，可對異常細(xì)胞惡性增殖、癌變等起到一定促進(jìn)作用，同時易在體內(nèi)聚積[20]。盧洪勝等[21]研究結(jié)果顯示，p53蛋白在胃癌中呈異常增多狀態(tài)，這與本研究內(nèi)容相似。本研究結(jié)果顯示，瞼板腺癌組織中p53蛋白陽性表達(dá)率明顯高于癌旁組織，表明p53基因在瞼板腺癌組織中突變率較高；本研究還將p53蛋白表達(dá)水平與患者臨床病理因素間關(guān)系進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、局部浸潤是瞼板腺癌患者瞼板腺癌組織p53蛋白陽性表達(dá)的獨立危險因素，證明p53蛋白在瞼板腺癌早期有一定影響。

p21基因上有2處p53結(jié)合位點，其表達(dá)水平高低可能是受上游基因p53的調(diào)控，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞周期G1期生長限制性位點[22]。為此，本研究對兩種蛋白間相關(guān)性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)兩種蛋白在瞼板腺癌組織中表達(dá)呈正相關(guān)，證明p21、p53蛋白在瞼板腺癌組織發(fā)生、生長、浸潤、轉(zhuǎn)移等過程中存在一定協(xié)同作用，在一定程度上為瞼板腺癌早期診斷、預(yù)后評估等具有積極意義。

綜上所述，p21、p53蛋白在瞼板腺癌組織表達(dá)水平明顯較高，其中p21蛋白對早期疾病和預(yù)后均存在一定影響，而p53蛋白僅對疾病早期有一定影響，且兩蛋白在瞼板腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中具有協(xié)同作用。