• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    白酒糟纖維素降解菌的優(yōu)選及酒糟降解工藝

    2020-08-12 15:01:48楊第芹曹文濤王曉丹
    關(guān)鍵詞:酒糟芽孢纖維素

    陽 剛,楊第芹,曹文濤,2,王曉丹

    白酒糟纖維素降解菌的優(yōu)選及酒糟降解工藝

    陽 剛1,楊第芹1,曹文濤1,2※,王曉丹1

    (1. 貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院,貴陽 550025;2. 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴陽 550025)

    白酒釀造行業(yè)產(chǎn)生的酒糟含有大量纖維素,不僅原料利用率低,而且丟棄的酒糟會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生污染。為了獲得酒糟纖維素降解能力強(qiáng)的微生物并進(jìn)行應(yīng)用,從醬香型酒醅、清香型酒醅、濃香型大曲、竹林里的土壤腐殖質(zhì)中分離篩選酒糟纖維素降解菌,并對(duì)菌種分類、理化特征和降解酒糟的特性進(jìn)行研究。pH值、溫度和酒精脅迫性試驗(yàn)進(jìn)一步確定了最佳酒糟纖維素降解菌為B2菌株,該菌株在pH值3.0、溫度44 ℃、酒精含量為體積分?jǐn)?shù)4%環(huán)境中生長(zhǎng)良好。基于形態(tài)學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)分析,鑒定B2菌株為枯草芽孢桿菌()。在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,采用Box-Benhnken響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化,確定了B2菌株降解酒糟的最佳工藝條件為酒糟添加量71 g/L、溫度37 ℃、pH值6.4、接種量8%,此時(shí)酒糟降解率為15.23%。該研究豐富了酒糟纖維素降解菌的微生物資源庫,同時(shí)為酒糟的資源化利用提供技術(shù)參考。

    纖維素;降解;廢棄物;白酒糟;纖維素酶;枯草芽孢桿菌;篩選;酒糟處理

    0 引 言

    白酒糟是糧谷物和糠殼等混合物經(jīng)固態(tài)發(fā)酵、蒸餾制得白酒后的副產(chǎn)物,并富含纖維素、蛋白質(zhì)等有機(jī)物[1]。中國(guó)每年能產(chǎn)生3 000萬t左右的白酒糟[2-4],由于缺乏有效的處理方法,不僅造成了酒糟浪費(fèi),而且丟棄的酒糟會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生污染[5-6]。目前,對(duì)白酒糟進(jìn)行資源化利用的主要方式是動(dòng)物飼料原料,但是對(duì)酒糟進(jìn)行脫毒等處理會(huì)使成本增加,也沒有直接證據(jù)表明酒糟飼料具有良好品質(zhì)。此外中國(guó)白酒釀造基地分布廣,也有很多是小作坊,對(duì)酒糟實(shí)現(xiàn)集中收集和處理尚存在難度。因此,開發(fā)酒糟處理方式,實(shí)現(xiàn)酒糟就地處理,提高經(jīng)濟(jì)和環(huán)境效益,顯得十分重要。

    白酒糟的纖維素含量占白酒糟干質(zhì)量的20%左右[1,7],酒糟中纖維素的降解成為了酒糟資源化利用的關(guān)鍵一步。纖維素是多個(gè)葡萄糖分子通過-1,4-糖苷鍵連接而成的一種多糖,廣泛存在植物中[8-9]。而纖維素酶是一種包括內(nèi)切葡聚糖酶(Endoglucanase)、外切葡聚糖酶(Exoglucanase)、-葡萄糖苷酶(-glucosidase)的復(fù)合酶,它可以將纖維素水解成葡萄糖供酵母菌等微生物利用。實(shí)際上微生物纖維素酶在造紙、紡織、生物燃料、食品與飼料工業(yè)、農(nóng)業(yè)等行業(yè)都有潛在的應(yīng)用前景[10]。然而,長(zhǎng)期以來,缺乏纖維素酶高產(chǎn)菌株是纖維素酶大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用的瓶頸[11]。

    目前,各國(guó)研究者已經(jīng)從溫泉[12]、牛糞[13]、土壤[14]、腐爛木材[15]等篩選產(chǎn)纖維素酶菌,結(jié)果表明產(chǎn)纖維素酶菌有細(xì)菌中的芽孢桿菌、熱桿菌、熱酸菌、纖維弧菌等,真菌中的木霉、黑曲霉、青霉等,放線菌中的小單孢菌、鏈霉菌等,古菌中的嗜熱菌等[10,16]。有學(xué)者從酒醅[17-18]、大曲[19]、白酒糟[20]中篩選產(chǎn)纖維素酶菌,但纖維素酶活不高??紤]到酒醅和大曲中的微生物,尤其是醬香型白酒中的,是經(jīng)過了高溫、高酸、高濃度酒精等因素脅迫,從中篩選到優(yōu)良菌株具有潛力,然而醬香型白酒作為重要的產(chǎn)纖維素酶菌生物資源庫,卻沒有相關(guān)研究報(bào)道。關(guān)于微生物降解白酒糟的研究,其中蘭小艷等[21]利用白腐菌使酒糟中的纖維素降解率達(dá)到了9.5%,從而提高酒糟的利用價(jià)值;何頌捷等[22]從酒醅和泥窖中篩選到一株羧甲基纖維素鈉酶活為49.31 U/mL的貝萊斯芽孢桿菌,經(jīng)固態(tài)發(fā)酵酒糟的降解率為22.1%,雖然指出該菌株存在潛在應(yīng)用價(jià)值,但是并沒有報(bào)道該菌株對(duì)環(huán)境的耐受性以及溫度、pH值等因素對(duì)降解酒糟的影響,尚不足指導(dǎo)菌株的實(shí)際應(yīng)用??傮w來看,目前研究集中在產(chǎn)纖維素酶菌篩選、鑒定與特性研究,對(duì)所篩選菌進(jìn)行白酒糟降解應(yīng)用研究較少,尚未有白酒糟降解工藝研究報(bào)道。

    本研究結(jié)合剛果紅染色與酶活力復(fù)篩試驗(yàn),從酒醅、大曲和土壤中分離篩選產(chǎn)纖維素酶菌,結(jié)合菌株鑒定結(jié)果和脅迫性試驗(yàn),最終確定酒糟降解微生物。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面法評(píng)價(jià)了酒糟降解處理?xiàng)l件,旨在獲得優(yōu)良菌株,為酒糟的無害化處理和資源化利用提供技術(shù)參考。

    1 材料與方法

    1.1 樣品來源

    醬香型酒醅、清香型酒醅、濃香型大曲分別于2019年3月從貴州省某酒廠、重慶某酒廠、四川某酒廠采集,土壤采集于貴陽市十里河灘風(fēng)景區(qū)的小竹林。

    1.2 培養(yǎng)基

    1)富集培養(yǎng)基:CMC-Na 10.0 g,蛋白胨1.0 g,NaCl 5.0 g,CaCl20.1 g,KH2PO41.0 g,(NH4)2SO42.0 g,MgSO4?7H2O 0.5 g,蒸餾水1 000 mL,pH值 6.8。

    2)分離培養(yǎng)基:CMC-Na 10.0 g,NaCl 5.0 g,CaCl20.1 g,KH2PO41.0 g,(NH4)2SO42.0 g,MgSO4?7H2O 0.5 g,瓊脂20.0 g,蒸餾水1 000 mL,pH值6.8。

    3)純化培養(yǎng)基:CMC-Na 10.0 g,NaCl 5.0 g,CaCl20.1 g,KH2PO41.0 g,(NH4)2SO42.0 g,MgSO4?7H2O 0.5 g,蛋白胨3.0 g,酵母浸粉3.0 g,瓊脂20.0 g,蒸餾水1 000 mL,pH值6.8。

    4)液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基:純化培養(yǎng)基不添加瓊脂。

    5)濾紙條液體培養(yǎng)基:(NH4)2SO41.0 g,MgSO4?7H2O 0.5 g,KH2PO41.0 g,酵母膏0.1 g,蒸餾水1 000 mL,另外在培養(yǎng)基中加入濾紙條(1 cm × 6 cm),每個(gè)三角瓶放3條。

    6)產(chǎn)酶培養(yǎng)基:CMC-Na10.0 g,蛋白胨3.0 g,酵母膏0.2 g,(NH4)2SO44.0 g,KH2PO44.0 g,MgSO4?7H2O 0.3 g,蒸餾水1 000 mL,pH值 6.8。

    7)酒糟降解培養(yǎng)基:將產(chǎn)酶培養(yǎng)基的CMC-Na換為酒糟。

    以上培養(yǎng)基均采用濕熱滅菌方式,121 ℃,20 min。

    1.3 主要試劑與儀器

    羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、微晶纖維素、水楊苷、剛果紅均來自上海源葉生物公司;DNA提取試劑盒、瓊脂糖及引物,北京擎科生物技術(shù)公司;UV754N分光光度計(jì),上海儀電公司;離心機(jī),上海菲恰爾公司;恒溫水浴鍋,鞏義予華儀器公司;PCR儀,美國(guó)ABI公司;電泳儀,北京六一儀器廠;凝膠成像儀,上海培清科技公司。

    1.4 方法

    1.4.1 分離與純化

    1)樣品預(yù)處理

    分別稱取10.0 g樣品于裝有玻璃珠的100.0 mL無菌水中,搖床振蕩(150 r/min)30 min以獲得菌懸液。

    2)富集培養(yǎng)

    取5.0 mL菌懸液的上清液于盛有95.0 mL富集培養(yǎng)基的三角瓶中,搖床(28 ℃、150 r/min)培養(yǎng)48 h以獲得富集培養(yǎng)液。

    3)稀釋涂布

    用無菌水進(jìn)行10倍梯度稀釋富集液,分別取100L的10-3~10-7稀釋度的菌液涂布于分離培養(yǎng)基上,每個(gè)濃度重復(fù)3次,28 ℃培養(yǎng)5 d。

    4)純化與保藏

    從涂布平板上挑取單個(gè)菌落在純化培養(yǎng)基上進(jìn)行平板劃線,并把純化好的菌株置于4 ℃冰箱進(jìn)行斜面保藏。

    1.4.2 定性初篩

    1)水解圈試驗(yàn)(剛果紅染色試驗(yàn))

    將純化過的菌株點(diǎn)種在CMC-Na分離培養(yǎng)基上,28 ℃培養(yǎng)5 d。菌株培養(yǎng)結(jié)束后,將8~10 mL的1 g/L的剛果紅溶液從培養(yǎng)皿邊緣緩慢倒入,輕輕搖動(dòng)以使剛果紅溶液覆蓋整個(gè)平板,靜置30 min后,倒掉培養(yǎng)皿中液體,用4~5 mL的1 mol/L的NaCl溶液潤(rùn)洗平板一次,然后向培養(yǎng)皿加入8~10 mL的1 mol/L的NaCl溶液,靜置“脫色”30 min后倒掉培養(yǎng)皿中的液體,觀察并測(cè)量菌落和水解圈的直徑。

    2)濾紙條崩解試驗(yàn)

    將菌株接種到盛有10 mL液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基的試管中,28 ℃培養(yǎng)1 d以獲得種子液,再分別將5 mL種子液接種于裝有95 mL濾紙條液體培養(yǎng)基中,搖床(28 ℃、150 r/min)培養(yǎng)2 d,第3 天將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng),然后每天定期觀察并記錄濾紙條降解情況。

    1.4.3 酶活力復(fù)篩

    1)粗酶制備

    將菌株接種到液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中,在28 ℃、150 r/min的搖床中培養(yǎng)3 d后,取發(fā)酵液進(jìn)行離心處理(8 000 r/min、10 min),所得上清液為粗酶液。

    2)酶活力單位定義

    1個(gè)酶活力單位(1U)是在50 ℃、pH值 4.8的條件下,底物每分鐘被分解產(chǎn)生1mol葡萄糖所對(duì)應(yīng)的酶量[23]。

    3)酶活測(cè)定與計(jì)算

    分別以羧甲基纖維素鈉、微晶纖維素、水楊苷作為內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、-葡萄糖苷酶的分解底物,還原糖作為檢測(cè)指標(biāo),并采用DNS法[24]測(cè)定。酶活計(jì)算如式(1)所示:

    式中為酶活力,U/mL;為粗酶體積,mL;為酶解時(shí)間,min;為酶實(shí)際水解生成的還原糖量,mol;123分別為初始底物溶液中還原糖量、初始粗酶液中還原糖量、酶解后總體系還原糖量,mol。

    1.4.4 酒糟降解及降解率測(cè)定

    同1.4.2節(jié)中制備種子液,將種子液以5%接種量接種到酒糟降解培養(yǎng)基中作為試驗(yàn)組,對(duì)照組不接種,均設(shè)置3個(gè)平行,先于28 ℃、150 r/min的搖床中培養(yǎng)2 d,后于28 ℃靜置培養(yǎng)8 d。參照文獻(xiàn)[25-26]將發(fā)酵瓶中的樣品用蒸餾水全部洗滌出來,再做抽濾處理,最后將酒糟置于烘箱烘干至恒質(zhì)量。酒糟降解率的計(jì)算如式(2)所示:

    1.4.5 形態(tài)學(xué)與生理生化鑒定

    參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[27]和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[28]對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定。

    1.4.6 分子生物學(xué)鑒定

    根據(jù)細(xì)菌基因提取試劑盒方法提取菌株的DNA;細(xì)菌擴(kuò)增引物(27F:5'-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3';1492R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3');PCR擴(kuò)增條件:98 ℃預(yù)變性5 min,98 ℃變性10 s,55 ℃退火15 s,72 ℃延伸20 s,30個(gè)循環(huán),72 ℃再延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于4 ℃保存,并當(dāng)天送至成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序。測(cè)定的基因序列在GenBank中進(jìn)行BLAST相似性比對(duì),采用MEGA5.05中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,確定菌株的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)地位,并將序列提交至GenBank,獲得GenBank accession number(基因庫登入號(hào))。

    1.4.7 pH、溫度及酒精脅迫性試驗(yàn)

    pH脅迫性試驗(yàn):將菌濃度為1×102~2×102CFU/mL的菌懸液涂布于pH值不同的純化培養(yǎng)基平板上,28 ℃培養(yǎng)3 d,然后觀察菌的生長(zhǎng)情況,以pH值6.8的平板為對(duì)照,給出生長(zhǎng)良好、生長(zhǎng)一般、生長(zhǎng)弱或不生長(zhǎng)3個(gè)評(píng)價(jià)等級(jí),每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)平行,下同。溫度脅迫性試驗(yàn):將菌懸液涂布于純化培養(yǎng)基(pH值6.8)平板上,于不同溫度下培養(yǎng)3 d,以28 ℃的平板為對(duì)照。酒精脅迫性試驗(yàn):將菌懸液涂布于乙醇終濃度不同的純化培養(yǎng)基(pH值6.8)平板上,28 ℃培養(yǎng)3 d,以不添加乙醇的平板為對(duì)照;其中乙醇添加到平板中的方式是待培養(yǎng)基冷卻至50 ℃左右,后用過濾除菌方式把乙醇添加到培養(yǎng)基中。

    1.4.8 酒糟降解單因素試驗(yàn)

    根據(jù)酒糟添加量、培養(yǎng)溫度、pH值、接種量先后順序進(jìn)行試驗(yàn),靜置培養(yǎng)10 d,酒糟降解率為檢測(cè)指標(biāo)。經(jīng)過預(yù)試驗(yàn),初始條件設(shè)為:28 ℃,pH值 6,接種量為1%;進(jìn)行酒糟添加量單因素試驗(yàn)時(shí),在初始條件基礎(chǔ)上,酒糟添加量設(shè)為因變量(20、40、60、80、100、120 g/L);進(jìn)行溫度單因素試驗(yàn)時(shí),在酒糟添加量單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上(取最佳酒糟添加量),溫度設(shè)為因變量(23、28、31、34、37、40、43 ℃),以此類推,再分別考查pH值(4、4.5、5、6、7、8)和接種量(1%、2%、4%、6%、10%、15%)對(duì)酒糟降解率的影響。

    1.4.9 酒糟降解響應(yīng)面優(yōu)化

    利用Design -Expert 11軟件進(jìn)行響應(yīng)面法(RSM)中的Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì),以酒糟降解率為響應(yīng)值,并利用該軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合和方差分析,并得到多元回歸方程模型;最后利用該軟件對(duì)方程模型進(jìn)行求解,以確定最佳條件,預(yù)測(cè)最佳響應(yīng)值,根據(jù)實(shí)際試驗(yàn)結(jié)果對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證,以檢查模型準(zhǔn)確性。

    1.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)處理

    用R語言的ggplot2包(3.2.1版本)繪圖;基于R語言的agricolae包(1.3-2版本)中的LSD.test函數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(方差分析、多重比較),采用Bonferroni校正的LSD法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn);Design-Expert 11軟件(Statease, Inc., Minneapolis, MS,USA)用于響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)(Box–Behnken Design);Adobe illustrator CC 2014軟件用于矢量圖形處理。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 菌株分離與篩選

    2.1.1 分離與定性初篩

    從醬香型酒醅、清香型酒醅、濃香型高溫大曲、竹林里的土壤腐殖質(zhì)樣品中,共分離出39株疑似產(chǎn)纖維素酶的菌株,經(jīng)過剛果紅染色法檢測(cè),有19株菌能夠產(chǎn)生水解圈,其中A5、A9、B1、B2、C2、D12水解圈相對(duì)大且清晰(圖1a、1b)。剛果紅染色法檢測(cè)產(chǎn)纖維素酶菌原理是通過在培養(yǎng)基中添加纖維素或纖維素衍生物,若微生物能夠產(chǎn)生纖維素酶并能夠分解一定量底物,那么經(jīng)過剛果紅染色檢測(cè)就能在菌落周圍形成透明圈(水解圈或清除區(qū)),通常可以根據(jù)透明圈直徑大小或透明圈與菌落的直徑比來揭示微生物產(chǎn)纖維素酶能力相對(duì)強(qiáng)弱。然而,也有研究發(fā)現(xiàn)透明圈直徑大小可能與其所產(chǎn)生的CMC-Na酶活力無明顯的相關(guān)性[26],僅通過剛果紅染色法選擇以上6株菌作為最佳產(chǎn)纖維素酶?jìng)溥x菌存在一定風(fēng)險(xiǎn)。由于濾紙條崩解試驗(yàn)可以反映菌株所分泌各種纖維酶的綜合酶活力水平[29],因此結(jié)合濾紙崩解試驗(yàn)進(jìn)一步定性判斷19株菌產(chǎn)纖維素酶能力。濾紙崩解試驗(yàn)結(jié)果如表1所示,結(jié)果表明A5、A9、B1、B2、C2、D12菌株崩解濾紙形成段數(shù)較多,與剛果紅染色結(jié)果基本一致。C2菌株來自C系列樣品(濃香型高溫大曲),其在C系列中表現(xiàn)最好,所以暫時(shí)保留C2菌株進(jìn)行下一步研究。

    圖1 剛果紅染色定性篩選結(jié)果

    表1 菌株分解濾紙條情況

    綜上因素,選擇A5、A9、B1、B2、C2、D12菌株進(jìn)一步進(jìn)行酶活力復(fù)篩。

    2.1.2 酶活力復(fù)篩

    酶活力復(fù)篩結(jié)果如表2所示,B1、B2菌株的3種纖維素酶活均顯著高于其他菌株(<0.05),而C2菌株酶活顯著低于其他菌株,這與剛果紅染色定性結(jié)果基本一致。

    表2 復(fù)篩時(shí)6株菌纖維素酶活力值

    注:同列不同小寫字母表示差異顯著(<0.05),下同。

    Note: Different lowercase letters in the same column indicate significantdifferences (<0.05), and the following is the same.

    2.2 菌株鑒定

    2.2.1 形態(tài)學(xué)與生理生化鑒定

    形態(tài)學(xué)鑒定,如圖2所示。菌株A5、C2的菌落呈圓形,質(zhì)地光滑,C2菌落呈黃色;A9菌株的菌落呈放射狀,菌落表面濕潤(rùn); B1、B2菌株的菌落表面干燥帶有褶皺;D12菌株的菌落周圍形成“黑色素”,培養(yǎng)3 d后,明顯能聞到強(qiáng)烈的泥腥味。在1 000倍油鏡觀察下,A5、A9、B1、B2、C2菌株的細(xì)胞形態(tài)為桿狀,細(xì)胞長(zhǎng)約為1~6m,細(xì)胞寬約為0.5~2m,D12菌株與一般桿狀細(xì)菌相比,細(xì)胞長(zhǎng)度明顯偏長(zhǎng),細(xì)胞長(zhǎng)約為5~15m,D12菌株與霉菌相比細(xì)胞寬度偏短。革蘭氏染色結(jié)果顯示,A5、A9、B1、B2菌株為陽性,C2、D12菌株為陰性。生理生化鑒定,如圖3所示。參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》,初步鑒定A5、A9、B1、B2為芽孢桿菌屬,C2為鞘氨醇單胞菌屬,D12為放線菌中的鏈霉菌屬。

    圖2 6株菌的菌落和細(xì)胞形態(tài)

    圖3 6株菌的生理生化特征

    2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

    將菌株的16S rDNA序列測(cè)定結(jié)果提交至GenBank做BLAST比對(duì)(表3)。利用MEGA 5.05的鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,如圖4所示。

    表3 菌株相似性比對(duì)結(jié)果

    圖4 基于菌株16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

    結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定,A5菌株鑒定為(地衣芽孢桿菌),A9菌株初步鑒定為(臺(tái)中類芽孢桿菌),B1菌株初步鑒定為(解淀粉類芽孢桿菌),B2菌株初步鑒定為(枯草芽孢桿菌)、C2菌株鑒定為(嗜溫鞘氨醇桿菌),D12菌株鑒定為(暗產(chǎn)色鏈霉菌)。根據(jù)鑒定結(jié)果,將基因序列及相關(guān)信息提交至GenBank,獲得基因庫登入號(hào),見圖4括號(hào)中的編號(hào)。

    2.3 pH、溫度及酒精脅迫性分析

    為了篩選產(chǎn)纖維素酶能力強(qiáng),且具有良好耐受性的菌株,結(jié)合篩選試驗(yàn)和菌株鑒定結(jié)果,選取A9、B2、D12菌株進(jìn)行脅迫性分析,結(jié)果如圖5所示。因A5、C2菌株產(chǎn)纖維素酶能力較差,而B1與B2菌株來自同一個(gè)樣品,故本試驗(yàn)不考慮A5、B1、C2菌株。在pH脅迫性試驗(yàn)中,可以發(fā)現(xiàn)B2菌株在pH值4.0環(huán)境中生長(zhǎng)良好,考慮到白酒糟酸度高問題,雖然酸度與pH值并不能等同,但是對(duì)pH值具有良好耐受的菌株在酒糟中更容易生存和繁殖,這將利于微生物進(jìn)行分解代謝等活動(dòng)。在溫度脅迫性試驗(yàn)組中,3株菌在40 ℃下生長(zhǎng)良好,而B2菌株仍能在44 ℃下良好生長(zhǎng)。在乙醇耐受性試驗(yàn)中,3株菌在乙醇體積分?jǐn)?shù)為4%的培養(yǎng)基中,生長(zhǎng)已經(jīng)受到限制,體積分?jǐn)?shù)為2%的乙醇對(duì)B2和D12菌株的生長(zhǎng)沒有明顯限制。綜上分析,選擇B2菌株作為酒糟降解試驗(yàn)菌。

    圖5 菌株對(duì)pH值、溫度、乙醇的脅迫性

    2.4 單因素試驗(yàn)

    如圖6a所示,酒糟添加量對(duì)酒糟降解率影響顯著,酒糟添加量較少時(shí)或較高時(shí),酒糟降解率均偏低,這可能是培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)失衡造成的,在酒糟添加量為60 g/L時(shí),酒糟降解率達(dá)到最大值。如圖6b所示,在28~37 ℃內(nèi),溫度對(duì)酒糟降解率的影響差異不顯著,在溫度為34 ℃時(shí),酒糟降解率達(dá)到最大值。與Chang研究相似,Chang等在30 ℃培養(yǎng)條件下從土壤中篩選產(chǎn)纖維素酶的芽孢桿菌,結(jié)果表明在30~37 ℃內(nèi),芽孢桿菌對(duì)木質(zhì)纖維素降解率差異不明顯,在37 ℃時(shí)降解率最大[30]。如圖6c所示,較低pH值或較高pH值都不利于酒糟降解,pH值為6時(shí),酒糟降解達(dá)到最大值。如圖6d所示,接種量對(duì)酒糟降解率的影響隨接種量增加而呈現(xiàn)先增加后減少趨勢(shì),但是增加和減少的幅度均較小,在接種量為6%時(shí),酒糟降解率達(dá)到最大值。

    注:圖6a中,溫度28 ℃,pH值6,接種量1%;圖6b中,酒糟添加量60 g·L-1,pH值6,接種量1%;圖6c中,酒糟添加量60 g·L-1,溫度34 ℃,接種量1%;圖6d中,酒糟添加量60 g·L-1,溫度34 ℃,pH值6。

    Note: In fig.6a, temperature is 28 ℃, pH value is 6, inoculation size is 1%; In fig.6b, added amount of distiller's grains is 60 g·L-1, pH value is 6, inoculation size is 1%; In fig.6c,added amount of distiller's grains is 60 g·L-1, temperature 34 ℃, inoculation size 1%; In fig.6d, added amount of distiller's grains is 60 g·L-1, temperature 34 ℃, pH value is 6.

    圖6 B2菌株降解酒糟的單因素條件優(yōu)化

    Fig.6 Optimization of single factor conditions for lees degradation by strain B2

    2.5 響應(yīng)面優(yōu)化

    2.5.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,選擇最大響應(yīng)值及鄰近的水平,或拐點(diǎn)及鄰近水平作為響應(yīng)面分析的各因素的3個(gè)水平[31]。采用Box-Behnken設(shè)計(jì),響應(yīng)面試驗(yàn)的因素與水平設(shè)計(jì)見表4。

    2.5.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

    采用四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì),酒糟的的降解率作為響應(yīng)值,試驗(yàn)結(jié)果如表5所示。

    表4 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平

    表5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值

    2.5.3 模型構(gòu)建及分析

    利用Design-Expert 11軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸方程模型構(gòu)建,以編碼因子表示的方程(Coded Equation)為

    =13.920 0+0.335 8+0.264 2+2.070 0+

    0.285 8+0.122 5+0.295 0+0.810 0?

    0.237 5?0.087 5+0.025 0?0.819 02?

    0.061 52?2.900 02?0.801 52(3)

    式中各項(xiàng)系數(shù)的絕對(duì)值表示單因素對(duì)酒糟降解率的影響程度,正負(fù)反映影響方向。模型的方差分析結(jié)果,如表6所示。

    模型的值<0.001,說明該擬合模型極顯著。失擬項(xiàng)值為0.102 6(>0.05),表明失擬檢驗(yàn)不顯著,說明該模型可用于酒糟降解的優(yōu)化[32-33]?;貧w模型的決定系數(shù)2=0.971 9,說明此方程對(duì)試驗(yàn)擬合度結(jié)果比較好,誤差??;回歸模型的調(diào)整決定系數(shù)2Adj=0.943 8,說明該模型能解釋94.38%響應(yīng)值的變化[34]。變異系數(shù)CV=4.06%,表明試驗(yàn)的重復(fù)性好,試驗(yàn)結(jié)果可靠[35]。綜上所述,可以采用該模型的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè),以及確定酒糟降解的最優(yōu)參數(shù)條件。另一方面,由模型中的回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知,一次項(xiàng)對(duì)酒糟降解率影響顯著(<0.05),一次項(xiàng)對(duì)酒糟降解率影響極顯著(<0.001);交互項(xiàng)對(duì)酒糟降解率影響高度顯著(<0.01);二次項(xiàng)2、2和2對(duì)酒糟降解率影響極顯著(<0.001)。值可以反映各試驗(yàn)因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)的重要性,值越大,表明對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)的影響越大[31]。比較4個(gè)因素的值大小可知,>>>,進(jìn)而可知各因素對(duì)酒糟降解率的影響主次順序?yàn)? pH值、酒糟添加量、接種量、溫度,這與上文對(duì)模型方程各項(xiàng)系數(shù)分析結(jié)果一致。

    表6 響應(yīng)面模型方差分析

    注:* 差異顯著(<0.05);** 差異高度顯著(<0.01);*** 差異極顯著(<0.001)。2=0.971 9,2Adj=0.943 8,CV=4.06%。

    Note: * significant difference,<0.05; ** highly significant difference,<0.01;*** extremely significant difference,<0.001.2=0.971 9,2Adj=0.943 8, CV=4.06%.

    響應(yīng)面分析3D圖(圖7),可直觀地看出各因素之間的相互作用。各3D響應(yīng)曲面圖均表現(xiàn)出某2個(gè)因素對(duì)酒糟降解率的相對(duì)影響,其余因素均保持在0水平[32]。結(jié)合表6中交互項(xiàng)的顯著性分析,可知酒糟添加量與接種量的交互作用高度顯著。等高線是響應(yīng)面在水平方向的投影,在圖7a或7b或7c中做酒糟添加量所在軸的平行線,以方便分析,可以發(fā)現(xiàn)酒糟添加量對(duì)降解率的影響是:降解率先隨酒糟添加量增加而增加,后當(dāng)酒糟添加量繼續(xù)增加時(shí),降解率反而減少,但是變化的幅度不是很大,這與單因素試驗(yàn)結(jié)果大致相同。同理,分析溫度、pH值、接種量對(duì)降解率影響,結(jié)果均與單因素試驗(yàn)結(jié)果基本一致。

    圖7 各因素交互作用對(duì)降解率影響的響應(yīng)面圖

    2.5.4 最佳條件確定及RSM模型驗(yàn)證

    利用Design-Expert 11軟件且基于單因素編碼水平為[-1,1]定義域?qū)貧w方程求最大值,結(jié)果表明酒糟添加量為70.817 9 g/L,溫度為37.000 0 ℃,pH值為6.345 0,接種量為8.203 1%,此時(shí)酒糟降解率為14.600 4%。為驗(yàn)證RSM模型可靠性,采用上述條件作為酒糟降解最佳工藝條件,考慮到實(shí)際操作的便利,將工藝條件修正為酒糟添加量71 g/L、溫度37 ℃、pH值6.4、接種量8%。以修正過的工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),重復(fù)6次,實(shí)際測(cè)得的酒糟降解率平均值為15.23%,相對(duì)誤差為4.31%,表明該模型可以指導(dǎo)實(shí)踐。

    3 討 論

    目前關(guān)于白酒糟降解與利用的研究較少,很多酒糟被丟棄或是被填埋在地下,這對(duì)環(huán)境產(chǎn)生了一定污染[5]。雖然目前對(duì)酒糟進(jìn)行處理存在成本高問題,但是在綠色發(fā)展大背景下,實(shí)現(xiàn)白酒糟合理處理、保護(hù)環(huán)境與節(jié)約資源卻十分必要。

    由微生物生產(chǎn)的纖維素酶在工業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用,盡管前人已經(jīng)篩選出了較多的纖維素降解菌,但能真正用于酒糟處理的菌株卻很少。明紅梅等[20]從白酒糟中篩選出一株CMC-Na酶活為13.71 U/g的地衣芽孢桿菌和一株酶活為9.25 U/g的枯草芽孢桿菌;李永博等[18]從濃香型酒醅中篩選出一株枯草芽孢桿菌,產(chǎn)酶條件優(yōu)化后CMC-Na酶活為38.84 U/mL;何頌捷等[22]從酒醅和窖泥中篩選出1株CMC-Na酶活為49.31 U/mL的貝萊斯芽孢桿菌和一株CMC-Na酶活為31.81 U/mL解淀粉芽孢桿菌;宋麗麗等[11]從白酒糟中篩選出一株CMC-Na酶活為36.73U/mL的巨大芽孢桿菌。由于產(chǎn)酶條件不同,尤其是一些文獻(xiàn)的酶活測(cè)定方法不太合理,因此通過對(duì)比CMC-Na酶活來評(píng)價(jià)篩選出來的B2菌株產(chǎn)酶能力,并不太合理。纖維素水解是基于內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、-葡萄糖苷酶協(xié)同作用,一些研究者僅以CMC-Na為底物來測(cè)定內(nèi)切葡聚糖酶活,進(jìn)而來評(píng)價(jià)菌株的產(chǎn)纖維素酶能力,這種做法應(yīng)該值得商榷?;趩我蛩卦囼?yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果,發(fā)現(xiàn)控制體系中的pH值對(duì)酒糟降解十分重要,對(duì)指導(dǎo)酒糟降解或處理具有較大參考意義。

    真菌具有水解酶體系完善、纖維素酶分泌量大等優(yōu)點(diǎn)[25]。木霉菌屬與曲霉菌屬作為產(chǎn)纖維素酶真菌的主要代表,研究得比較多。關(guān)于酒糟降解或者是從釀酒環(huán)節(jié)中的樣品篩選產(chǎn)纖維素酶真菌的研究相對(duì)較少。蘭小艷等[21]采用白腐菌使酒糟纖維素含量降低了9.5%,提高酒糟的利用價(jià)值。洋河酒廠將從大曲中篩選的產(chǎn)纖維素酶霉菌進(jìn)行甲基磺酸乙酯(EMS)誘變處理,然后與糖化酶、活性干酵母混合使用,出酒率提高了3.89%[36]。細(xì)菌由于具有較高的生長(zhǎng)速度、對(duì)基因工程具有較高的相容性和可行性等優(yōu)點(diǎn)[8],產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌也受到了重視。然而,細(xì)菌水解纖維素效率低的問題也很突出,基于纖維素降解需要眾多酶協(xié)同作用的機(jī)制,構(gòu)建復(fù)合菌系降解纖維素成為了研究熱點(diǎn)。李靜等[26]構(gòu)建由3種菌組成的復(fù)合菌系,結(jié)果較單菌株秸稈降解率提高了50.71%。王海濱等[29]構(gòu)建由5種菌組成的復(fù)合菌系,結(jié)果顯著提高了濾紙酶活力和對(duì)苦參殘?jiān)暗径挼慕到庑ЧH毡緦W(xué)者Chang[30]用芽孢桿菌和乳酸菌聯(lián)合處理水稻秸稈,結(jié)果發(fā)現(xiàn)纖維素酶活性顯著提高,木質(zhì)素和半纖維素含量相應(yīng)降低。目前纖維素降解機(jī)制并不清楚,其中協(xié)同作用模型被更多學(xué)者接受。根據(jù)協(xié)同作用理論[37],纖維素的降解過程大致分為4個(gè)步驟,首先是纖維素酶分子吸附到纖維素表面,接著是內(nèi)切葡聚糖酶在葡聚糖鏈的隨機(jī)位點(diǎn)水解底物產(chǎn)生寡聚糖;然后是外切葡聚糖酶從葡聚糖鏈的非還原端進(jìn)行水解,形成纖維二糖主要水解產(chǎn)物;最后是-葡萄糖苷酶將纖維素二糖水解為葡萄糖。此外,真菌分泌的多為胞外纖維素酶,不用依附于纖維素表面后才降解纖維素[38]。一些研究表明植物中含有的木質(zhì)素會(huì)對(duì)纖維素酶產(chǎn)生不可逆吸附,使一部分酶失活[39]。綜上所述,本文后期可以通過構(gòu)建復(fù)合菌系來模擬真菌完善的酶體系和減少纖維素酶產(chǎn)生的不可逆吸附,為協(xié)同作用提供有利條件,進(jìn)而提高酒糟的降解效果。

    4 結(jié) 論

    1)采用剛果紅平板篩選法,從醬香型酒醅、清香型酒醅、濃香型大曲、竹林里的土壤腐殖質(zhì)中共分離出39株菌。結(jié)合菌株產(chǎn)生的內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、-葡萄糖苷酶的酶活,復(fù)篩出6株菌?;谛螒B(tài)學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)分析,6株產(chǎn)纖維素酶菌分別被鑒定為地衣芽孢桿菌、臺(tái)中類芽孢桿菌、解淀粉類芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、嗜溫鞘氨醇桿菌、暗產(chǎn)色鏈霉菌。pH、溫度和酒精脅迫性試驗(yàn)表明枯草芽孢桿菌(B2)具有良好的耐受性,在pH值3.0、溫度44 ℃、酒精體積分?jǐn)?shù)為4%環(huán)境中生長(zhǎng)良好。

    2)將枯草芽孢桿菌B2菌株應(yīng)用于酒糟降解工藝研究,在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,采用Box-Benhnken響應(yīng)面法進(jìn)行工藝優(yōu)化,確定了酒糟降解最佳工藝條件為:酒糟添加量71 g/L、溫度37 ℃、pH值 6.4、接種量8%;在此條件下,酒糟降解率為15.23%。

    [1] 劉志云,鐘曉霞,姚焰礎(chǔ),等. 白酒糟生物飼料及其在豬生產(chǎn)上的應(yīng)用現(xiàn)狀[J]. 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2020,32(1):15-20.

    Liu Zhiyun, Zhong Xiaoxia, Yao Yanchu, et al. Biological feed of white distiller's grains and its application status in swine production[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2020, 32(1): 15-20. (in Chinese with English abstract)

    [2] 裴久文,方勇,高學(xué)志,等.. X1固態(tài)發(fā)酵改善酒糟品質(zhì)[J]. 生物學(xué)雜志,2019,36(6):64-68.

    Pei Jiuwen, Fang Yong, Gao Xuezhi, et al. Improvement of distiller's grains quality by. X1 under solid-state fermentation[J]. Journal of Biology, 2019, 36(6): 64-68.(in Chinese with English abstract)

    [3] 高銘坤,溫廣宇,錢芳. 微生物對(duì)白酒酒糟的轉(zhuǎn)化利用研究進(jìn)展[J]. 食品與機(jī)械,2018,34(2):191-194.

    Gao Mingkun, Wen Guangyu, Qian Fang. Advances in microbial conversion and utilization of distiller grains[J]. Food & Machinery, 2018, 34(2): 191-194. (in Chinese with English abstract)

    [4] 馬霞,董炎炎,于海燕. 酒糟浸出液發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌纖維素工藝優(yōu)化[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2015,31(8):302-307.

    Ma Xia, Dong Yanyan, Yu Haiyan. Optimization of bacterial cellulose fermentation technology with distiller's grains[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2015, 31(8): 302-307. (in Chinese with English abstract)

    [5] Ao T, Li R, Chen Y, et al. Anaerobic thermophilic digestion of Maotai-Flavored distiller's grains: Process performance and microbial community dynamics[J]. Energy & Fuels, 2019, 33(9): 8804-8811.

    [6] 張黎驊,張文,呂珍珍,等. 響應(yīng)面法優(yōu)化酒糟微波間歇干燥工藝[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2011,27(3):369-374.

    Zhang Lihua, Zhang Wen, Lu Zhenzhen, et al. Optimization of intermittent microwave drying technology for lees by response surface methodology[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2011, 27(3): 369-374. (in Chinese with English abstract)

    [7] 李倩,裴朝曦,王之盛,等. 不同類型酒糟營(yíng)養(yǎng)成分組成差異的比較研究[J]. 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2018,30(6):2369-2376.

    Li Qian, Pei Chaoxi, Wang Zhisheng, et al. Comparative study on nutrients compositions of different types of distiller's grains[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2018, 30(6): 2369-2376. (in Chinese with English abstract)

    [8] Akhtar N, Aanchal, Goyal D, et al. Biodiversity of cellulase producing bacteria and their applications[J]. Cellulose Chemistry and Technology, 2016, 50(9/10): 983-995.

    [9] Ben Hmad I, Gargouri A. Neutral and alkaline cellulases: Production, engineering, and applications[J]. Journal of Basic Microbiology, 2017, 57(8): 653-658.

    [10] Kuhad R C, Gupta R, Singh A. Microbial cellulases and their industrial applications[J]. Enzyme Research, 2011, 2011: 280696.

    [11] 宋麗麗,聞格,霍姍浩,等. 白酒酒糟中產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌的分離篩選和酶學(xué)性質(zhì)研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2020,46(7):43-49.

    Song Lili, Wen Ge, Huo Shanhao, et al. Screening, identification and enzymatic property of a cellulase- producing bacterium in distiller's grains[J]. Food and Fermentation Industries, 2020, 46(7): 43-49. (in Chinese with English abstract)

    [12] Irfan M, Tayyab A, Hasan F, et al. Production and characterization of organic solvent-tolerant cellulase fromAK9 isolated from hot spring[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2017, 182(4): 1390-1402.

    [13] Croos A M B, Rajendran S, Ranganathan K. Isolation of a cellulase producingfrom cow dung and determination of the kinetic properties of the crude enzyme[J]. Journal of the National Science Foundation of Sri Lanka, 2019, 47(2): 261-267.

    [14] Reddy K V, Vijayalashmi T, Ranjit P, et al. Characterization of some efficient cellulase producing bacteria isolated from pulp and paper mill effluent contaminated soil[J]. Brazilian Archives of Biology and Technology, 2017, 60: e17160226

    [15] Paudel Y P, Qin W. Characterization of novel cellulase-producing bacteria isolated from rotting wood samples[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2015, 177(5): 1186-1198.

    [16] Acharya S, Chaudhary A. Bioprospecting thermophiles for cellulase production: A review[J]. Brazilian Journal of Microbiology, 2012, 43(3): 844-856.

    [17] 劉茂柯,唐玉明,熊洪,等. 白酒酒醅纖維素降解菌的多樣性分析及其分離篩選[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2018,44(4):35-41.

    Liu Maoke, Tang Yuming, Xiong Hong, et al. Characterization of the diversity and activity of cellulose-degrading bacteria in Zaopei used for Chinese Baijiu production [J]. Food and Fermentation Industries, 2018, 44(4): 35-41.(in Chinese with English abstract)

    [18] 李永博,暴金磊,萬敏,等. 酒醅中高產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選及其酶學(xué)性質(zhì)[J]. 食品工業(yè)科技,2017,38(24):109-113.

    Li Yongbo, Bao Jinlei, Wan Min, et al. Study on screening of high-yield cellulase strains in the fermented grains and its enzymatic properties[J]. Science and Technology of Food Industry, 2017, 38(24): 109-113. (in Chinese with English abstract)

    [19] 龔麗瓊,鄧朝霞,黃祖新,等. 高溫大曲中篩選產(chǎn)纖維素酶的耐高溫芽孢桿菌[J]. 福建師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2012,28(3):106-112.

    Gong Liqiong, Deng Chaoxia, Huang Zuxin, et al. Screening of a thermostable cellulase-secreting bacillus from high temperature Daqu[J]. Journal of Fujian Normal University (Natural Science Edition), 2012, 28(3): 106-112. (in Chinese with English abstract)

    [20] 明紅梅,鄒偉,陳曉旭,等. 白酒糟高溫纖維素分解菌的篩選、產(chǎn)酶分析與鑒定[J]. 飼料研究,2015(11):24-27.

    [21] 蘭小艷,陳雪玲,張敬慧,等. 酒糟中纖維素的降解及再利用研究[J]. 畜牧與飼料科學(xué),2018,39(4):21-22.

    Lan Xiaoyan, Chen Xueling, Zhang Jinghui, et al. Investigation on degradation and reuse of cellulose in distiller's grains [J]. Animal Husbandry and Feed Science, 2018, 39(4): 21-22.(in Chinese with English abstract)

    [22] 何頌捷,左勇,張?chǎng)危? 降解白酒酒糟中纖維素的細(xì)菌的分離鑒定[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2019,45(24):64-70.

    He Songjie, Zuo Yong, Zhang Xin, et al. Isolation and identification of bacteria degrading cellulose in distillers' grains[J]. Food and Fermentation Industries, 2019, 45(24): 64-70.(in Chinese with English abstract)

    [23] 鄒宗勝,王婧雅,趙運(yùn)英,等. 高產(chǎn)纖維素酶突變株的篩選及其產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J]. 食品科學(xué),2019,40(6):48-54.

    Zou Zongsheng, Wang Jingya, Zhao Yunying, et al. Screening ofand optimization of fermentation conditions for higher cellulase production[J]. Food Science, 2019, 40(6): 48-54. (in Chinese with English abstract)

    [24] Miller G L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar[J]. Analytical Chemistry, 1959, 31(3): 426-428.

    [25] 付麗,朱紅雨,杜明楠,等. 秸稈降解菌株的篩選、鑒定及生物學(xué)特性研究[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2018,23(12):39-49.

    Fu Li, Zhu Hongyu, Du Mingnan, et al. Screening, identification and biological characteristics of straw-degrading bacteria strains[J]. Journal of China Agricultural University, 2018, 23(12): 39-49.(in Chinese with English abstract)

    [26] 李靜,張瀚能,趙翀,等. 高效纖維素降解菌分離篩選、復(fù)合菌系構(gòu)建及秸稈降解效果分析[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào), 2016,22(4):689-696.

    Li Jing, Zhang Hanneng, Zhao Chong, et al. Isolation and screening of cellulose decomposing microbe and the straw decomposing effect of complex microbial system[J]. Chinese Journal of Applied and Environmental Biology, 2016, 22(4): 689-696. (in Chinese with English abstract)

    [27] 蔡妙英,東秀珠. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M]. 北京:科學(xué)出版社.

    [28] 布坎南,吉本斯. 伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M]. 北京:科學(xué)出版社,1984.

    [29] 王海濱,韓立榮,馮俊濤,等. 高效纖維素降解菌的篩選及復(fù)合菌系的構(gòu)建[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2015,23(4):421-431.

    Wang Haibin, Han Lirong, Feng Juntao, et al. Screening of highly efficient cellulose degradation microbes and construction of composite strains[J]. Journal of Agricultural Biotechnology, 2015, 23(4): 421-431. (in Chinese with English abstract)

    [30] Chang Y, Choi D, Takamizawa K, et al. Isolation ofstrains capable of decomposing alkali lignin and their application in combination with lactic acid bacteria for enhancing cellulase performance[J]. Bioresource Technology, 2014, 152: 429-436.

    [31] 陶陶,賀凡,姬小明,等. 響應(yīng)面法優(yōu)化閃式提取葫蘆巴多糖及其保潤(rùn)性能研究[J]. 精細(xì)化工,2016,33(6):666-673.

    Tao Tao, He Fan, Ji Xiaoming, et al. Response surface methodology for optimization of flash extraction for fenugreek (.) polysaccharides and research of its humectant properties [J]. Fine Chemicals, 2016, 33(6): 666-673. (in Chinese with English abstract)

    [32] Wang P, Chang J, Yin Q, et al. Effects of thermo-chemical pretreatment plus microbial fermentation and enzymatic hydrolysis on saccharification and lignocellulose degradation of corn straw[J]. Bioresource Technology, 2015, 194: 165-171.

    [33] 任天寶,馬孝琴,徐桂轉(zhuǎn),等. 響應(yīng)面法優(yōu)化玉米秸稈蒸汽爆破預(yù)處理?xiàng)l件[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2011,27(9):282-286.

    Ren Tianbao, Ma Xiaoqin, Xu Guizhuan, et al. Optimizing steam explosion pretreatment conditions of corn stalk by response surface methodology[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2011, 27(9): 282-286. (in Chinese with English abstract)

    [34] 王旭輝,徐鑫,山其米克,等. 玉米秸稈厭氧消化預(yù)處理方法及工藝優(yōu)化[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2018,34(23):246-253.

    Wang Xuhui, Xu Xin, Shan Qimike, et al. Optimization of pretreatment process for corn straw anaerobic digest[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering(Transactions of the CSAE), 2018, 34(23): 246-253. (in Chinese with English abstract)

    [35] 黃皓,王珍妮,李莉,等. 甘油水溶液提取米糠多酚綠色工藝優(yōu)化及多酚種類鑒定[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2019,35(4):305-312.

    Huang Hao, Wang Zhenni, Li Li, et al. Optimization of green extraction process and identification of polyphenols variety from rice bran using glycerol/water ystem[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2019, 35(4): 305-312. (in Chinese with English abstract)

    [36] 楊建梅,王曉慧,王永偉,等. 大曲中高產(chǎn)纖維素酶菌株的選育及其在綿柔型白酒丟糟中的應(yīng)用[J]. 釀酒科技,2016(8):71-75.

    Yang Jianmei, Wang Xiaohui, Wang Yongwei, et al. Breeding of a strain with high yield of cellulase from Daqu and its application in waste distiller's grains of Soft-Flavor Baijiu[J]. Liquor-Making Science & Technology, 2016(8): 71-75. (in Chinese with English abstract)

    [37] Jeoh T, Cardona M J, Karuna N, et al. Mechanistic kinetic models of enzymatic cellulose hydrolysis a review[J]. Biotechnology and Bioengineering, 2017, 114(7): 1369-1385.

    [38] Coughlan M P. The properties of fungal and bacterial cellulases with comment on their production and application[J]. Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, 1985, 3(1): 39-110.

    [39] 曲音波. 木質(zhì)纖維素降解酶與生物煉制[M]. 北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2011.

    Screening of cellulose degrading bacteria in distiller’s grains and degradation technology of distiller's grains

    Yang Gang1, Yang Diqin1, Cao Wentao1,2※, Wang Xiaodan1

    (1.,550025,; 2.,550025,)

    Distiller’s grains serve as the important by-products in ethanol production, particularly on white spirits in China. Normally, the key grain can be processed in a solid-state fermentation, thereby to distill a mixture of grains and bran husks. After the processing, the distiller's grains can be remained readily available rich in organic matter, such as cellulose and protein. China can produce about 30 million tons of distiller's grains every year, as the consumption of white spirits increases. The discarded distiller's grains have become the waste of raw materials, further to pollute the environment, due to the lack of effective treatment methods. It is necessary to explore much more efficient disposal of distiller's grains. This study aims to explore the decomposition of distiller's grains, in order to obtain microorganisms with strong capacity of cellulose degradation in distillates. 39 strains of bacteria were isolated from in Chinese maotai-flavor fermented grains, Chinese mild-flavor fermented grains, Chinese strong-flavor Daqu starter and the soil of bamboo forest, using sodium carboxymethyl cellulose as the only carbon source. Six strains were quantitatively screened using Congo red staining and filter paper strip disintegration experiments for qualitative preliminary screening, combined with the endoglucanase, exoglucanase, and-glucosidase enzyme activities produced by the strains. Based on morphological, physiological, biochemical, and molecular biological characterization, six cellulase-producing bacteria were identified as,,, and,,. The optimum lees cellulose-degrading strain was further determined the B2 strain () inthe tests of pH, temperature, and alcohol stress. Specifically,B2 strain has demonstrated a good tolerance, while grew well in an environment of pH value 3.0, at the temperature of 44 ℃, and the alcohol content of 4% by volume. According to the single-factor test, a Box-Benhnken response surface method was used to optimize the processing parameters in the treatments. The optimal process conditions were determined to be 71 g/L distiller's grains, the temperature of 37 ℃, pH value 6.4, and the inoculation size of 8%, for the degradation of distiller's grains. In addition, the degradation rate of distiller's grains can reach 15.23% in this case. The findings demonstrated that the selectedcan effectively decompose distiller's grains, and thereby be expected to provide a promising application potential in the disposal of distiller's grains.

    cellulose; degradation; wastes; distiller's grains; cellulase;; screening; vinasse processing

    陽剛,楊第芹,曹文濤,等. 白酒糟纖維素降解菌的優(yōu)選及酒糟降解工藝[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2020,36(13):212-221.doi:10.11975/j.issn.1002-6819.2020.13.025 http://www.tcsae.org

    Yang Gang, Yang Diqin, Cao Wentao, et al. Screening of cellulose degrading bacteria in distiller's grains and degradation technology of distiller's grains[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2020, 36(13): 212-221. (in Chinese with English abstract) doi:10.11975/j.issn.1002-6819.2020.13.025 http://www.tcsae.org

    2020-03-22

    2020-05-20

    貴州省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(黔科合支撐[2018]2314)

    陽剛,主要從事釀酒微生物及生物建模研究。Email:GZ_university_YG@163.com

    曹文濤,教授,主要從事白酒糟資源化利用及釀酒微生物應(yīng)用研究。Email:452794932@qq.com

    10.11975/j.issn.1002-6819.2020.13.025

    Q939.96; TS261.1

    A

    1002-6819(2020)-13-0212-10

    猜你喜歡
    酒糟芽孢纖維素
    豬酒糟中毒發(fā)生的原因、臨床表現(xiàn)、診斷及防治
    白酒糟在毛驢養(yǎng)殖中的運(yùn)用
    纖維素基多孔相變復(fù)合材料研究
    纖維素氣凝膠的制備與應(yīng)用研究進(jìn)展
    解淀粉芽孢桿菌Lx-11
    解淀粉芽孢桿菌的作用及其產(chǎn)品開發(fā)
    側(cè)孢短芽孢桿菌A60
    30L發(fā)酵罐培養(yǎng)枯草芽孢桿菌產(chǎn)高密度芽孢的研究
    酒糟綜合利用技術(shù)研究進(jìn)展
    巧用酒糟喂鵝
    亚洲情色 制服丝袜| 亚洲美女黄片视频| 亚洲第一青青草原| 黄频高清免费视频| 美女 人体艺术 gogo| 级片在线观看| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 丝袜在线中文字幕| 欧美黄色片欧美黄色片| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 久99久视频精品免费| 给我免费播放毛片高清在线观看| 一级作爱视频免费观看| 最近最新中文字幕大全电影3 | 国产亚洲欧美精品永久| 在线观看舔阴道视频| 久久香蕉精品热| 国产成人系列免费观看| 91成年电影在线观看| 亚洲精华国产精华精| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲情色 制服丝袜| 色老头精品视频在线观看| 成人av一区二区三区在线看| 午夜福利一区二区在线看| 久久久久久久午夜电影| 欧美成狂野欧美在线观看| 欧美中文日本在线观看视频| 亚洲av成人一区二区三| 亚洲专区中文字幕在线| 国产免费av片在线观看野外av| 91成年电影在线观看| 亚洲精品久久国产高清桃花| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 精品国内亚洲2022精品成人| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 乱人伦中国视频| 欧美黑人欧美精品刺激| 禁无遮挡网站| 精品国产乱子伦一区二区三区| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 国产成人欧美| 欧美+亚洲+日韩+国产| 悠悠久久av| 国产午夜福利久久久久久| 国产亚洲av高清不卡| 亚洲专区国产一区二区| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 日韩免费av在线播放| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产精品影院久久| 国产xxxxx性猛交| 丁香欧美五月| 国产一区在线观看成人免费| 久久中文看片网| 99热只有精品国产| 精品国产乱码久久久久久男人| 极品教师在线免费播放| av超薄肉色丝袜交足视频| cao死你这个sao货| 国产精品亚洲av一区麻豆| 一级毛片高清免费大全| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 天堂动漫精品| 国产熟女午夜一区二区三区| 精品国内亚洲2022精品成人| 成人国产一区最新在线观看| 欧美日本中文国产一区发布| 可以在线观看的亚洲视频| 我的亚洲天堂| 午夜福利高清视频| 天堂动漫精品| 久99久视频精品免费| 中文字幕久久专区| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 免费高清视频大片| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 一进一出抽搐动态| 久久青草综合色| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| av视频免费观看在线观看| 日韩av在线大香蕉| 欧美国产日韩亚洲一区| 亚洲三区欧美一区| 国产私拍福利视频在线观看| 制服诱惑二区| 亚洲午夜理论影院| 亚洲国产精品sss在线观看| 99国产综合亚洲精品| 一进一出抽搐动态| 精品高清国产在线一区| ponron亚洲| 一二三四社区在线视频社区8| 久久久久九九精品影院| 午夜免费鲁丝| 日韩精品青青久久久久久| 国产一区二区在线av高清观看| 真人一进一出gif抽搐免费| 正在播放国产对白刺激| 男男h啪啪无遮挡| 波多野结衣一区麻豆| 咕卡用的链子| x7x7x7水蜜桃| 国产精品精品国产色婷婷| 在线永久观看黄色视频| 欧美在线黄色| 男人舔女人下体高潮全视频| 精品人妻在线不人妻| 午夜免费成人在线视频| 丝袜在线中文字幕| ponron亚洲| 亚洲一区二区三区色噜噜| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 亚洲精品国产一区二区精华液| 欧美久久黑人一区二区| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 一级,二级,三级黄色视频| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国产亚洲av嫩草精品影院| 大陆偷拍与自拍| 国产私拍福利视频在线观看| 亚洲成人精品中文字幕电影| 国产99白浆流出| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产1区2区3区精品| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 国产伦一二天堂av在线观看| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲国产精品合色在线| 亚洲全国av大片| 97碰自拍视频| 18禁美女被吸乳视频| 成熟少妇高潮喷水视频| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 亚洲久久久国产精品| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国产99久久九九免费精品| 天天一区二区日本电影三级 | 一进一出抽搐动态| 桃色一区二区三区在线观看| 看免费av毛片| 国产午夜福利久久久久久| 久久精品国产清高在天天线| 一级片免费观看大全| 国产成人av教育| 纯流量卡能插随身wifi吗| 成人精品一区二区免费| 亚洲欧美精品综合久久99| 多毛熟女@视频| 久久精品国产综合久久久| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 韩国精品一区二区三区| 欧美+亚洲+日韩+国产| 乱人伦中国视频| 在线天堂中文资源库| 欧美日本中文国产一区发布| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 怎么达到女性高潮| 成人国产综合亚洲| 此物有八面人人有两片| 午夜福利一区二区在线看| 丝袜美腿诱惑在线| 日韩视频一区二区在线观看| 国产成人系列免费观看| 精品不卡国产一区二区三区| 亚洲电影在线观看av| 一区福利在线观看| 亚洲第一青青草原| 宅男免费午夜| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 在线观看日韩欧美| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 久久久久久久久中文| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 国产精品一区二区免费欧美| 久久 成人 亚洲| 亚洲中文字幕日韩| 此物有八面人人有两片| 精品乱码久久久久久99久播| 51午夜福利影视在线观看| 久久香蕉激情| 日韩欧美在线二视频| 欧美日本视频| 久久久久久免费高清国产稀缺| 男女午夜视频在线观看| 91精品三级在线观看| www.www免费av| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 亚洲精品国产色婷婷电影| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲欧美激情在线| 丁香欧美五月| 天天添夜夜摸| 真人一进一出gif抽搐免费| www.精华液| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 亚洲 国产 在线| 国产精品一区二区三区四区久久 | 一进一出好大好爽视频| 丝袜美腿诱惑在线| 夜夜爽天天搞| 制服诱惑二区| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 三级毛片av免费| 国产麻豆69| 成熟少妇高潮喷水视频| 99国产精品一区二区三区| 乱人伦中国视频| 日韩三级视频一区二区三区| 一a级毛片在线观看| 他把我摸到了高潮在线观看| 国产私拍福利视频在线观看| 少妇粗大呻吟视频| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 国产一卡二卡三卡精品| 嫩草影院精品99| 人成视频在线观看免费观看| 精品国产一区二区久久| xxx96com| 一级毛片高清免费大全| 久热爱精品视频在线9| 亚洲精品在线观看二区| АⅤ资源中文在线天堂| 亚洲一码二码三码区别大吗| 在线观看免费午夜福利视频| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 一级毛片女人18水好多| 九色国产91popny在线| 大码成人一级视频| 免费在线观看日本一区| 国产熟女xx| 欧美激情久久久久久爽电影 | 免费观看人在逋| 男人的好看免费观看在线视频 | 亚洲欧美日韩无卡精品| 深夜精品福利| av视频在线观看入口| 国产亚洲av嫩草精品影院| 正在播放国产对白刺激| 搡老岳熟女国产| 又大又爽又粗| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 91九色精品人成在线观看| 在线永久观看黄色视频| 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产精品免费视频内射| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 久久伊人香网站| 精品电影一区二区在线| 国产精品 国内视频| 亚洲中文日韩欧美视频| 在线观看免费视频日本深夜| 亚洲中文av在线| 欧美国产日韩亚洲一区| 丁香欧美五月| 日本vs欧美在线观看视频| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 国产伦人伦偷精品视频| 欧美一级a爱片免费观看看 | 精品不卡国产一区二区三区| 日韩视频一区二区在线观看| 窝窝影院91人妻| 午夜福利欧美成人| aaaaa片日本免费| 一区二区三区激情视频| 亚洲一码二码三码区别大吗| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 午夜免费观看网址| 亚洲avbb在线观看| 涩涩av久久男人的天堂| 女警被强在线播放| 在线观看www视频免费| 国产高清有码在线观看视频 | 在线观看免费日韩欧美大片| 国产精品一区二区精品视频观看| 精品国产乱码久久久久久男人| 淫妇啪啪啪对白视频| 美女午夜性视频免费| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 国产精品久久久人人做人人爽| 很黄的视频免费| 激情视频va一区二区三区| 黄频高清免费视频| 国产1区2区3区精品| 午夜免费观看网址| 午夜成年电影在线免费观看| 99re在线观看精品视频| 欧美黄色淫秽网站| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 成年人黄色毛片网站| www日本在线高清视频| 变态另类丝袜制服| 九色国产91popny在线| 男女午夜视频在线观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 最近最新中文字幕大全免费视频| 午夜福利影视在线免费观看| 亚洲熟妇熟女久久| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 他把我摸到了高潮在线观看| 成人亚洲精品av一区二区| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| av福利片在线| 欧美日韩黄片免| 亚洲黑人精品在线| 日韩国内少妇激情av| 欧美激情极品国产一区二区三区| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 精品乱码久久久久久99久播| 午夜久久久在线观看| 色在线成人网| 国产97色在线日韩免费| 神马国产精品三级电影在线观看 | 18禁美女被吸乳视频| 热re99久久国产66热| 精品乱码久久久久久99久播| 亚洲天堂国产精品一区在线| 久久婷婷人人爽人人干人人爱 | 日本 av在线| 国内精品久久久久久久电影| 久久久久久人人人人人| 亚洲成av人片免费观看| 国产视频一区二区在线看| 搡老妇女老女人老熟妇| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 亚洲av片天天在线观看| 国产三级黄色录像| 一级毛片女人18水好多| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 色尼玛亚洲综合影院| 国产一区在线观看成人免费| 精品午夜福利视频在线观看一区| 免费看a级黄色片| 久久午夜亚洲精品久久| 午夜两性在线视频| 午夜免费激情av| av免费在线观看网站| 欧美日韩乱码在线| 欧美乱色亚洲激情| 丝袜美腿诱惑在线| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 黑丝袜美女国产一区| 看片在线看免费视频| 亚洲男人天堂网一区| 日本三级黄在线观看| 国产不卡一卡二| 中文字幕色久视频| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 欧美日韩福利视频一区二区| 12—13女人毛片做爰片一| 一区二区三区精品91| 久久国产精品影院| 这个男人来自地球电影免费观看| 一边摸一边做爽爽视频免费| 亚洲精品久久国产高清桃花| 中文亚洲av片在线观看爽| 国产精品久久视频播放| 757午夜福利合集在线观看| 亚洲精品美女久久av网站| 后天国语完整版免费观看| 桃色一区二区三区在线观看| 精品第一国产精品| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 黑丝袜美女国产一区| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 成人欧美大片| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 免费看美女性在线毛片视频| 十分钟在线观看高清视频www| 精品福利观看| 欧美午夜高清在线| 在线观看免费午夜福利视频| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 满18在线观看网站| 一区在线观看完整版| 欧美日本视频| 黄片小视频在线播放| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 欧美一级a爱片免费观看看 | 国产亚洲欧美精品永久| 日韩精品青青久久久久久| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 窝窝影院91人妻| 午夜免费观看网址| 成人亚洲精品av一区二区| 999久久久精品免费观看国产| 免费看美女性在线毛片视频| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产不卡一卡二| 精品熟女少妇八av免费久了| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 99在线视频只有这里精品首页| 国产乱人伦免费视频| 午夜亚洲福利在线播放| 9191精品国产免费久久| 黄色 视频免费看| 黄片小视频在线播放| 欧美中文日本在线观看视频| 亚洲一区二区三区色噜噜| 亚洲精品粉嫩美女一区| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 国产精品国产高清国产av| 国产主播在线观看一区二区| 精品无人区乱码1区二区| 老司机靠b影院| 亚洲国产精品成人综合色| 香蕉久久夜色| 天堂√8在线中文| 久久久久精品国产欧美久久久| 一进一出抽搐gif免费好疼| 亚洲av电影在线进入| 久久精品91无色码中文字幕| 国产成人av激情在线播放| 丁香欧美五月| 操出白浆在线播放| 香蕉久久夜色| 午夜福利一区二区在线看| 国产亚洲精品久久久久5区| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 韩国精品一区二区三区| 大香蕉久久成人网| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 中文字幕av电影在线播放| 日韩欧美三级三区| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 国产av在哪里看| bbb黄色大片| ponron亚洲| 中文字幕人妻熟女乱码| 悠悠久久av| 一区在线观看完整版| 麻豆久久精品国产亚洲av| 香蕉国产在线看| 国产午夜福利久久久久久| 欧美日本亚洲视频在线播放| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 少妇的丰满在线观看| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 欧美激情高清一区二区三区| 中文字幕久久专区| 国产精品久久久人人做人人爽| 桃色一区二区三区在线观看| 国产成人欧美| 一边摸一边抽搐一进一小说| 天天一区二区日本电影三级 | 窝窝影院91人妻| 久久精品国产清高在天天线| 久久久久国产一级毛片高清牌| 欧美+亚洲+日韩+国产| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 一二三四在线观看免费中文在| 欧美激情高清一区二区三区| 国产1区2区3区精品| 亚洲,欧美精品.| √禁漫天堂资源中文www| 亚洲国产精品999在线| 无人区码免费观看不卡| 欧美亚洲日本最大视频资源| 欧美成狂野欧美在线观看| 999久久久国产精品视频| 国产区一区二久久| 午夜福利一区二区在线看| 91老司机精品| 视频区欧美日本亚洲| 中文字幕高清在线视频| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 又黄又爽又免费观看的视频| 嫁个100分男人电影在线观看| 一进一出抽搐gif免费好疼| 欧美色欧美亚洲另类二区 | 9色porny在线观看| 91成年电影在线观看| 天天一区二区日本电影三级 | 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 成人欧美大片| 精品免费久久久久久久清纯| 午夜日韩欧美国产| 变态另类丝袜制服| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 制服人妻中文乱码| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 好男人在线观看高清免费视频 | 国产99久久九九免费精品| 国产免费av片在线观看野外av| 成年女人毛片免费观看观看9| 97碰自拍视频| 久久午夜亚洲精品久久| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 国产高清有码在线观看视频 | 少妇被粗大的猛进出69影院| 国产激情久久老熟女| 亚洲国产看品久久| 精品欧美一区二区三区在线| 精品久久久久久,| 欧美黄色淫秽网站| 男女午夜视频在线观看| 国产麻豆69| 神马国产精品三级电影在线观看 | 美女免费视频网站| 99久久精品国产亚洲精品| 午夜视频精品福利| 午夜精品在线福利| 亚洲精品国产区一区二| 国产色视频综合| 国产一区二区三区视频了| a在线观看视频网站| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 青草久久国产| 国产精品电影一区二区三区| 美女午夜性视频免费| www国产在线视频色| 涩涩av久久男人的天堂| 国产成人精品久久二区二区91| 9191精品国产免费久久| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 黑人欧美特级aaaaaa片| 久久中文看片网| 国产精品 欧美亚洲| 男女做爰动态图高潮gif福利片 | 色av中文字幕| 搡老岳熟女国产| 精品日产1卡2卡| av在线播放免费不卡| 91麻豆av在线| av欧美777| 国产97色在线日韩免费| 人人妻人人澡欧美一区二区 | av天堂在线播放| tocl精华| 悠悠久久av| 99久久国产精品久久久| 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲欧美激情综合另类| 国产精品影院久久| 老司机午夜十八禁免费视频| 最好的美女福利视频网| 欧美色欧美亚洲另类二区 | 欧美色欧美亚洲另类二区 | 亚洲成a人片在线一区二区| 在线视频色国产色| 91老司机精品| 狠狠狠狠99中文字幕| 自线自在国产av| 美女扒开内裤让男人捅视频| 99在线人妻在线中文字幕| 色老头精品视频在线观看| 69精品国产乱码久久久| 久久久久久人人人人人| 校园春色视频在线观看| 国产亚洲欧美在线一区二区| 曰老女人黄片| 国产极品粉嫩免费观看在线| 精品国产一区二区三区四区第35| 国产精品电影一区二区三区| 久久久久久久精品吃奶| 亚洲精品中文字幕在线视频| 首页视频小说图片口味搜索| 91精品三级在线观看| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 国产av在哪里看| 制服人妻中文乱码| 免费看美女性在线毛片视频| 妹子高潮喷水视频| 老司机福利观看| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 99久久国产精品久久久| 国产欧美日韩一区二区三| 欧美日本视频| 91国产中文字幕| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产99久久九九免费精品| 亚洲国产精品成人综合色| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产片内射在线| 黑丝袜美女国产一区| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 中出人妻视频一区二区| 国产一区二区在线av高清观看| 精品福利观看| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 精品乱码久久久久久99久播| 欧美性长视频在线观看| av福利片在线| 欧美黑人精品巨大| 黑人欧美特级aaaaaa片| 90打野战视频偷拍视频| 成年版毛片免费区| 国产国语露脸激情在线看| 亚洲国产看品久久| 色综合婷婷激情| 视频在线观看一区二区三区| 亚洲自拍偷在线| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产精品九九99| 又黄又粗又硬又大视频| 成年人黄色毛片网站| 一a级毛片在线观看|