云南省芒市草地貪夜蛾幼蟲腸道可培養(yǎng)細菌種類及對抗生素的敏感性

張志紅 張凌英 趙英杰 蘇造堂 陳思穎 肖關(guān)麗 李維薇 陳斌

摘要：【目的】明確云南省芒市草地貪夜蛾幼蟲腸道可培養(yǎng)細菌種類及優(yōu)勢種細菌對抗生素的敏感性，為草地貪夜蛾的綠色防控提供參考?！痉椒ā坎捎贸Ｒ?guī)分離培養(yǎng)法對云南省芒市玉米田草地貪夜蛾5齡幼蟲腸道可培養(yǎng)細菌進行分離培養(yǎng)，采用形態(tài)特征和16S rDNA技術(shù)對細菌種類進行鑒定;采用紙片擴散法測定優(yōu)勢種細菌對10種抗生素的敏感性?！窘Y(jié)果】云南省芒市玉米田草地貪夜蛾5齡幼蟲腸道內(nèi)可培養(yǎng)細菌有3門5科5屬6種，分別為變棲克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）、蒙氏腸球菌（Enterococcus mundtii）、鶉雞腸球菌（E. gallinarum）、普羅威登斯菌（Providencia vermicola）、金黃微桿菌（Chryseomicrobium aureum）和Kocuria himachalensis，其中變棲克雷伯氏菌是草地貪夜蛾幼蟲腸道的優(yōu)勢種細菌。變棲克雷伯氏菌對10種抗生素的敏感性測定結(jié)果表明，變棲克雷伯氏菌對諾氟沙星、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明、氯霉素和頭孢唑林敏感，表現(xiàn)為低耐藥性;對慶大霉素和阿米卡星中等敏感，表現(xiàn)為中等耐藥性;對青霉素、紅霉素和氨芐西林的敏感性較弱，表現(xiàn)為強耐藥性?！窘Y(jié)論】云南省芒市草地貪夜蛾幼蟲腸道可培養(yǎng)細菌組成具有多樣性，其中變棲克雷伯氏菌為優(yōu)勢種細菌，該優(yōu)勢種細菌對青霉素、紅霉素和氨芐西林存在明顯的耐藥性。

關(guān)鍵詞： 草地貪夜蛾;腸道細菌;抗生素敏感性;云南省芒市

Abstract：【Objective】To determine the species of culturable bacteria in the intestine of larvae of Spodoptera frugiperda in Mangshi in Yunnan and the sensitivity of dominant bacteria to antibiotics， and provide reference for biocontrol of S. frugiperda. 【Method】Bacteria in the intestine of the 5th instar larvae of S. frugiperda in the corn field of Mangshi was isolated and cultured using routine isolation and culture method. The species were identified using the morphological characterisitics and 16S rDNA molecular techniques. The sensitivity of dominant bacteria to 10 antibiotics was determined using the paper diffusion method. 【Result】The culturable bacteria in the intestine of the 5th instar larvae of S. frugiperda in the corn field of Mangshi belonged to 3 phyla， 5 families， 5 genera and 6 species， they were Klebsiella variicola， Enterococcus mundtii，E. gallinarum，Providencia vermicola，Chryseomicrobium aureum and Kocuria himachalensis. Among them， K. variicola was the dominant bacteria species. The sensitivity of K. variicola to 10 antibiotics demonstrated that K. variicola showed a low resistance to norfloxacin， ciprofloxacin， cotrimoxazole， chloramphenicol and cefazolin， moderate resistance to gentamicin and amikacin， and high resistance to penicillin， erythromycin and ampicillin. 【Conclusion】The composition of culturable bacteria in the intestinal tract of larvae of S. frugiperda in Mangshi， Yunnan shows diversity， K. variicola is the dominant bacteria species， it shows an evident resistant to penicillin， erythromycin and ampicillin.

Key words： Spodoptera frugiperda; gut bacteria; antibiotic sensitivity; Mangshi， Yunnan

0 引言

【研究意義】昆蟲腸道細菌被稱為昆蟲的第二套遺傳密碼（Zilber-Rosenberg and Rosenberg，2008），在昆蟲生理和生態(tài)功能中發(fā)揮著重要作用（張振宇等，2017），食物種類和環(huán)境等均會影響昆蟲腸道細菌的種類組成（McFrederick et al.，2017;高珊珊，2018）。草地貪夜蛾[Spodoptera frugiperda（J.E.Smith）]隸屬于鱗翅目夜蛾科灰翅夜蛾屬，是一種原產(chǎn)于美洲熱帶和亞熱帶地區(qū)的多食性害蟲（郭井菲等，2019）。該蟲于2019年1月首次入侵云南省普洱市江城縣（楊學(xué)禮等，2019），到2019年10月已蔓延至我國26個?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）（姜玉英等，2019），并成為影響我國玉米生產(chǎn)的重要因素。因此，對草地貪夜蛾腸道細菌種類組成及其對抗生素敏感性的研究，不僅有利于草地貪夜蛾腸道細菌資源的開發(fā)利用，還能為該蟲的綜合防治提供依據(jù)?！厩叭搜芯窟M展】草地貪夜蛾腸道內(nèi)含有豐富的細菌種類，且隨采集地的不同而存在差異。當前，有關(guān)草地貪夜蛾腸道細菌的研究已有一些報道。美國學(xué)者Acevedo等（2017）采用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法從草地貪夜蛾3齡幼蟲腸道中分離出細菌，其主要種類為菠蘿泛菌（Pantoea ananatis）、德維希腸桿菌（Enterobacter ludwigii）、奎尼沃納沙雷氏菌（Serratia quinivo-rans）、解鳥氨酸拉烏爾菌（Raoultella ornithinolytica）、產(chǎn)酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）和分散泛菌（P. dispersa）; Almeida等（2017）采用分離培養(yǎng)法從巴西草地貪夜蛾腸道中發(fā)現(xiàn)7屬10種細菌，其中鉛黃腸球菌（Enterococcus casselifavus）和蒙氏腸球菌（E. mundtii）為優(yōu)勢種;顧偌鋮等（2019）、唐運林等（2019）運用傳統(tǒng)培養(yǎng)法分離重慶市巫山和巫溪地區(qū)的草地貪夜蛾幼蟲腸道細菌，并通過16S rDNA測序鑒定出8個屬的細菌，其中克雷伯氏菌屬（Klebsiella）豐度最高，且多樣性水平較高;李青晏等（2020）對采自云南蒙自的草地貪夜蛾的幼蟲和成蟲中腸細菌進行分離培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)草地貪夜幼蟲與成蟲腸道中主要優(yōu)勢菌存在差異，其中幼蟲腸道中克雷伯氏菌屬（Klebsiella）豐度最高，成蟲腸道中不動桿菌屬（Acinetobacter）豐度最高;張凌英等（2020）從云南省江城縣玉米田中采集的草地貪夜蛾幼蟲腸道中分離出8屬12種內(nèi)生菌，其中以腸球菌屬（Enterococcus）為優(yōu)勢屬、蒙氏腸球菌為優(yōu)勢種。【本研究切入點】云南省芒市周年種植玉米，為草地貪夜蛾周年繁殖提供了便利條件，然而，對于該區(qū)域草地貪夜蛾幼蟲腸道內(nèi)可培養(yǎng)細菌種類組成及其對抗生素的敏感性尚不清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用常規(guī)分離培養(yǎng)法對云南省德宏州芒市玉米田草地貪夜蛾5齡幼蟲腸道可培養(yǎng)細菌進行分離培養(yǎng)，利用16S rDNA對細菌種類進行分子鑒定，明確該地區(qū)草地貪夜蛾幼蟲腸道細菌種類，并測定優(yōu)勢種細菌對10種抗生素的敏感性，以期為草地貪夜蛾的綠色防控提供參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試蟲源：2019年8月26日于云南省德宏州芒市德宏經(jīng)濟作物技術(shù)推廣站旁玉米田（東經(jīng)98°34′30.31″，北緯24°25′41.6″，海拔915 m）采集草地貪夜蛾5齡幼蟲。

主要試劑：2×Taq PCR MasterMix（北京全式金生物科技有限公司），Goldview核酸染料（上海賽百盛基因技術(shù)有限公司），引物Prime1（27F：5'-AGAG TTTGATCCTGGCTCAG-3'）和Prime2（1492R：5'-C GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）[由英濰基（上海）貿(mào)易有限公司合成]，瓊脂糖[基因科技（上海）有限公司]，抗生素藥敏片10種[青霉素G紙片（10 μg/片）、諾氟沙星（10 μg/片）、紅霉素（15 μg/片）、慶大霉素（10 μg/片）、環(huán)丙沙星（5 μg/片）、復(fù)方新諾明（23.75/1.25 μg/片）、氯霉素（30 μg/片）、阿米卡星（30 μg/片）、頭孢唑林（30 μg/片）和氨芐西林（10 μg/片），均由杭州微生物試劑有限公司生產(chǎn)]。

LB培養(yǎng)基：胰化蛋白胨1.0 g，酵母提取物0.5 g，NaCl 1.0 g，瓊脂2.0 g，蒸餾水100 mL，pH 7.0 （符運會等，2018）。

1. 2 草地貪夜蛾腸道細菌的分離及形態(tài)鑒定

選取草地貪夜蛾5齡幼蟲5頭，在滅菌處理過的指形管中饑餓處理24 h，用無菌水清洗1 min，再置于75%酒精中消毒3 min，最后于無菌水中清洗。用鑷子從蟲體尾部取出腸道，小心去除前腸、后腸和馬氏管，然后置于1.5 mL離心管中，加入少量生理鹽水，用槍頭小心研磨至勻漿，后加水定容至1 mL（鄭亞強等，2017），以此為原液備用。將原液離心1 min （2000 r/min），取上清液稀釋至10-3、10-4、10-5和10-6濃度梯度，用移液槍分別取100 ?L溶液，分別加入LB培養(yǎng)基中用稀釋涂布平板法涂布均勻，每個濃度重復(fù)3次，置于溫度（25±1）℃、光周期L∶D=16 h∶8 h的光照培養(yǎng)箱[恒立（中國）實驗室設(shè)備科技有限公司，型號RG-300]中培養(yǎng)48 h（孫博通等，2017）。統(tǒng)計各培養(yǎng)基上菌落顏色、形態(tài)和細菌菌落數(shù)量，挑取單菌落到新的LB培養(yǎng)基上，用平板劃線法將其分離形成純化單菌株。采用革蘭氏染色法對細菌進行染色，在顯微鏡下觀察純化菌落的細胞形態(tài)。

1. 3 分離菌株的分子鑒定

向滅菌的1.5 mL PCR管中分別加入500 ?L無菌水，用滅菌接種針挑取已純化的單個菌株于無菌水中，將菌液在快速振蕩器上振蕩至渾濁，于液氮冰凍10 min，沸水中水浴5 min，再離心2 min（12000 r/min，4 ℃），最后取出上清液于1.5 mL PCR管作為PCR模板備用。使用細菌通用引物（27F和1492R）擴增16S rDNA基因。PCR反應(yīng)體系25.0 ?L： Template DNA 1.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL、ddH2O 9.5 μL。擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 1 min，53 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，進行32個循環(huán);72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。將擴增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將測序所得的16S rDNA序列提交至NCBI（GenBank）數(shù)據(jù)庫與已登錄基因序列進行BLAST比對。

1. 4 抗生素敏感性試驗

將鑒定得到的優(yōu)勢細菌按2%接種量接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)好的菌液8000 r/min離心10 min，取上清液5 mL作為待測液（陳雅茜，2018）。吸取100 μL待測液均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上，加蓋后室溫下放置10 min，用無菌鑷子將藥敏紙片輕輕貼于培養(yǎng)基上，每種藥敏片重復(fù)3次，置于溫度（25±1）℃，光周期L∶D=16 h∶8 h的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，十字交叉法測抑菌圈直徑，根據(jù)如下標準判定細菌的抗生素敏感性水平（李文紅等，2015）：抑菌圈直徑<10.00 mm為強耐藥性，記為R;10.00 mm≤抑菌圈直徑<15.00 mm為中等耐藥性，記為I;抑菌圈直徑≥15.00 mm為低耐藥性，記為S。

1. 5 統(tǒng)計分析

觀察和記錄各培養(yǎng)基上菌落顏色、形態(tài)和大小各異細菌菌落的數(shù)量，利用DPS 16.05數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)中多重比較Duncans法對各種菌落數(shù)量進行差異顯著性分析（唐啟義，2010）。根據(jù)培養(yǎng)基上各菌株的培養(yǎng)情況，計算各菌株的相對多度。

相對多度（%）=某種菌的菌落數(shù)/總菌落數(shù)×100

2 結(jié)果與分析

2. 1 草地貪夜蛾5齡幼蟲腸道中可培養(yǎng)細菌的培養(yǎng)性狀及形態(tài)

從LB培養(yǎng)基上得到8株細菌，其中共有6種顏色、形狀、大小各異的細菌菌落（表1）。菌落形態(tài)基本為圓形且邊緣整齊;顏色有乳白色、姜黃色和橙色;有3株菌株呈半透明狀，4株呈不透明狀，1株菌株中央不透明邊緣半透明，均有光澤;革蘭氏染色發(fā)現(xiàn)有4株呈陰性，4株為陽性。菌體形態(tài)有2種，其中桿狀有3株，球形有5株。

2. 2 草地貪夜蛾5齡幼蟲腸道細菌的16S rDNA鑒定結(jié)果

將從草地貪夜蛾腸道中分離出的8株可培養(yǎng)細菌，運用16S rDNA序列分析法進行鑒定，將拼接好的16S rDNA序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST同源性比對，同源性大于97%的聚為統(tǒng)一單元（何彩，2012）。由表2可看出，有2株菌與鶉雞腸球菌（E. gallinarum）的相似性在98.00%以上，1株菌與蒙氏腸球菌（E. mundtii）的相似性為99.38%，1株菌與金黃微桿菌（Chryseomicrobium aureum）的相似性為99.15%，2株菌與變棲克雷伯氏菌（K. variicola）的相似性在99.05%以上，1株菌與普羅威登斯菌（Providencia vermicola）的相似性為99.28%，1株菌與Kocuria hima-chalensis的相似性為99.00%。綜合形態(tài)學(xué)和16S rDNA鑒定結(jié)果，草地貪夜蛾5齡幼蟲腸道細菌隸屬于3門5科5屬6種，分別為變棲克雷伯氏菌、普羅威登斯菌、鶉雞腸球菌、蒙氏腸球菌、金黃微桿菌和K. hi-machalensis。

2. 3 草地貪夜蛾5齡幼蟲腸道中可培養(yǎng)細菌種類的相對多度

從各分離菌株在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)生長的相對多度來看，以變棲克雷伯氏菌的相對多度最高，為44.00%，K. himachalensis最低，為6.67%，變棲克雷伯氏菌是草地貪夜蛾5齡幼蟲腸道中的優(yōu)勢種（表3）。6種菌株在LB培養(yǎng)基上的數(shù)量不同，存在顯著差異（F=8.728，P<0.01）。

2. 4 變棲克雷伯氏菌對10種抗生素的敏感性測定結(jié)果

由表4和圖1可知，供試10種抗生素對變棲克雷伯氏菌的抑菌圈直徑大小依次為環(huán)丙沙星>諾氟沙星>頭孢唑林>氯霉素>復(fù)方新諾明>慶大霉素>阿米卡星>紅霉素>青霉素>氨芐西林。根據(jù)敏感性判定標準，變棲克雷伯氏菌對諾氟沙星、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明、氯霉素和頭孢唑林敏感，表現(xiàn)為低耐藥性;對慶大霉素和阿米卡星中等敏感，即中等耐藥性;對青霉素、紅霉素和氨芐西林的敏感性較弱，表現(xiàn)為強耐藥性。

3 討論

昆蟲腸道細菌組成及結(jié)構(gòu)受多方面因素的影響，其中昆蟲的取食對昆蟲腸道細菌的影響最大（楊云秋等，2018）。本研究運用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法從云南省德宏州芒市玉米田草地貪夜蛾5齡幼蟲腸道中分離得到8株細菌，隸屬于3門5科5屬6種，其中克雷伯氏菌屬細菌為優(yōu)勢屬細菌。已有眾多研究從草地貪夜蛾幼蟲腸道中分離到克雷伯氏菌屬（Acevedo et al.，2017;顧偌鋮等，2019;唐運林等，2019;張凌英等，2020）?？死撞暇毡榇嬖谟谟衩浊o葉、根部及土壤中，對植物生長及代謝具有促進作用（李夢嬌等，2014;韋俊宏等，2019;徐淑霞等，2019）。Dantur等（2015）證明小蔗桿草螟（Diatraea saccha-ralis）腸道內(nèi)變棲克雷伯氏菌屬具有較強的水解能力，能降解甘蔗渣和其他甘蔗殘余廢物。草地貪夜蛾幼蟲腸道內(nèi)克雷伯氏菌是否來源于所取食的玉米，以及是否在草地貪夜蛾對取食玉米的降解中發(fā)揮重要功能值得進一步探究。此外，本研究分離到的金黃微桿菌和K. himachalensis兩種細菌在已有報道的文獻中并未分離到，究其原因可能與地理位置、宿主植物、培養(yǎng)基種類及昆蟲齡期等差異有關(guān)，但具體原因有待進一步探究。本研究僅利用培養(yǎng)法研究了云南省芒市草地貪夜蛾5齡幼蟲腸道可培養(yǎng)細菌種類，因而對于不可培養(yǎng)細菌種類尚不清楚。因此，為了弄清該地區(qū)草地貪夜蛾幼蟲腸道內(nèi)細菌多樣性，有必要采用高通量測序法對不可培養(yǎng)細菌種類進行研究。本研究中分離培養(yǎng)的腸道優(yōu)勢細菌對主要抗生素藥敏測定結(jié)果表明，變棲克雷伯氏菌對諾氟沙星、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明、氯霉素和頭孢唑林敏感，對慶大霉素和阿米卡星中等敏感，對青霉素、紅霉素和氨芐西林敏感性較弱，存在天然耐藥現(xiàn)象。腸桿菌科細胞能產(chǎn)生大環(huán)內(nèi)酯2'?磷酰轉(zhuǎn)移酶及紅霉素酯酶破壞紅霉素的結(jié)構(gòu)，從而產(chǎn)生耐藥性（韋立志等，2019）。導(dǎo)致腸桿菌科細菌對屬于β?內(nèi)酰胺類抗生素的青霉素耐藥的主要原因是腸桿菌科細菌能產(chǎn)生碳青霉烯酶，可將β-內(nèi)酰胺類的抗生素進行水解（李想等，2020）。而腸桿菌科細菌對同屬于β?內(nèi)酰胺類抗生素的頭孢唑林敏感，推測該菌產(chǎn)生的碳青霉烯酶為D類碳青霉烯酶，該酶不能水解頭孢菌素類抗生素，但對苯唑西林等青霉素類抗生素的水解活性很強（鄂心蕊等，2019）。腸道天然耐藥性菌株為進一步研究草地貪夜蛾所攜帶的天然耐藥性基因及該基因的解毒抗性機制提供了良好的研究素材。

4 結(jié)論

云南省芒市草地貪夜蛾幼蟲腸道可培養(yǎng)細菌種類組成多樣，主要包括變棲克雷伯氏菌、蒙氏腸球菌、鶉雞腸球菌、普羅威登斯菌、K. himachalensis和金黃微桿菌，其中變棲克雷伯氏菌為優(yōu)勢種。優(yōu)勢細菌變棲克雷伯氏菌對諾氟沙星、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明、氯霉素和頭孢唑林敏感，表現(xiàn)為低耐藥性;對慶大霉素和阿米卡星中等敏感，表現(xiàn)為中等耐藥性;對青霉素、紅霉素和氨芐西林的敏感性較弱，表現(xiàn)為強耐藥性。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）