胎兒結(jié)節(jié)性硬化的病理特點及遺傳學分析

魯才娟 魯建央 詹欣 吳雅楓 翟洪波

結(jié)節(jié)性硬化癥（tuberous sclerosis complex，TSC）是一種累及多系統(tǒng)的常染色體顯性遺傳病，包括皮膚、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心臟、眼睛、腎臟和肺[1]。發(fā)病率為1/（6 000～10 000）。約90%的患者并發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀（癲癇、自閉癥和智力障礙），預后往往很差[2]。TSC1和TSC2基因突變與該疾病密切相關(guān)。在2012年國際TSC大會上，TSC1和TSC2基因突變被確定為獨立的診斷標準[3-4]。近年來，隨著二代測序（next generation sequencing，NGS）技術(shù)的廣泛，部分單基因病的產(chǎn)前診斷成為可能。在本研究中，我們綜合應(yīng)用產(chǎn)前診斷超聲、家系全外顯子檢測、病理檢查對超聲提示心臟橫紋肌瘤的胎兒進行了遺傳學分析，以明確其發(fā)病原因。

1 對象和方法

1.1對象 選擇2019年1月在本院遺傳咨詢門診的1例孕婦，27歲，孕26+4周。產(chǎn)前診斷超聲提示胎兒心臟多發(fā)橫紋肌瘤。對該胎兒及其父母行家系全外顯子檢測，同時對引產(chǎn)胎兒心臟組織行病理檢查。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準，所涉及引產(chǎn)胎兒及其父母的標本均經(jīng)胎兒父母知情并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1 產(chǎn)前超聲檢查 使用美國GE Voluson E8彩色多普勒超聲診斷儀，探頭頻率3.0～8.0 MHz。發(fā)現(xiàn)胎兒心臟腫塊后，探查腫塊形態(tài)、位置、數(shù)量及其與周邊關(guān)系，并對心臟結(jié)構(gòu)、功能等進行評價，同時隨診胎兒心率、心功能等變化。

1.2.2 家系全外顯子檢測 通過羊膜腔穿刺術(shù)采集羊水10 mL，4℃冰箱冷藏。父母外周血各5 mL（乙二胺四乙酸抗凝）。無菌條件下用DNA提取試劑盒（德國Qiagen公司)提取基因組DNA?；贗llumina二代測序平臺，采用Agilent SureSelectXTHuman All Exon V6 kit進行捕獲建庫，利用雙末端（150 bp×2）測序的方法，完成樣本的全外顯子組測序，并進行Sanger測序驗證。數(shù)據(jù)分析以GRCh37（hg19）基因組版本為依據(jù)，同時在1 000 Genomes Project，Genome Aggregation Database（gnomAD）；Exome Aggregation Consortium（ExAC）等數(shù)據(jù)庫進行比對，預測該位點突變的意義。

1.2.3 病理檢查 孕32周時，家系全外顯子檢測提示TSC2基因雜合突變，孕婦及家屬要求優(yōu)生引產(chǎn)。引產(chǎn)胎兒心臟組織標本用4%甲醛固定，常規(guī)石蠟制片，HE染色，行光鏡觀察，同時行免疫組化染色，抗體有Desmin、myoglobin、myogerdn、SMA，S-100。

2 結(jié)果

2.1產(chǎn)前超聲檢查結(jié)果 產(chǎn)前超聲提示胎兒右心房內(nèi)大小約3.6 cm×2.7 cm×2.7 cm的實質(zhì)性高回聲團（圖1A），左心室內(nèi)可見多個實質(zhì)性高回聲團，較大3個分別1.5 cm×0.9 cm×0.9 cm，1.1 cm×0.8 cm×0.9 cm，0.6 cm×0.5 cm×0.4 cm（圖1B-D），邊界清，回聲均勻，無活動性，血流動力學未見明顯改變。超聲均未發(fā)現(xiàn)顱內(nèi)、腎臟等其他部位結(jié)節(jié)性病變。

2.2家系全外顯子檢測結(jié)果 家系全外顯子檢測（封三圖2）提示胎兒TSC2基因雜合突變，c.1839+2_1839+9del8，經(jīng)典的mRNA剪接區(qū)域（外顯子±2bp區(qū)間），且核苷酸序列高度保守，較大概率導致氨基酸序列被改變，從而產(chǎn)生異常的蛋白質(zhì)。此變異未在相關(guān)臨床病例中報道過，亦未在OMIM、Clin-Var、1000 Genomes、ExAC及GnomAD數(shù)據(jù)庫中報道。父母檢測未攜帶該基因突變，為新發(fā)突變。

2.3病理結(jié)果 心臟經(jīng)甲醛固定后沿著大血管走形打開心腔，于右心房及左心室內(nèi)見灰白色腫塊，邊界清晰，表面光滑，無包膜，切面呈灰白色、實性，質(zhì)地較嫩（封三圖3）。HE染色后鏡下觀察，瘤細胞大小不一，呈不規(guī)則形狀，胞質(zhì)呈清亮空泡狀（封三圖4A）。有些瘤細胞的嗜酸性胞質(zhì)由細胞核向細胞膜方向伸展，似蜘蛛，多數(shù)空泡樣變性，僅見稀疏的肌絲，稱為“蜘蛛樣細胞”[5]。腫瘤細胞形態(tài)溫和，無明顯異型性，未見核分裂象。行免疫組化染色腫瘤細胞myoglobin、myogerdn和Desmin（+），SMA、S-100（-）（封三圖4B）。

3 討論

心臟橫紋肌瘤是胎兒最常見的心臟腫瘤，占所有胎兒心臟原發(fā)腫瘤的60%～86%[6]。產(chǎn)前超聲作為早期發(fā)現(xiàn)心臟橫紋肌瘤的首要診斷方式[7]，表現(xiàn)為心腔內(nèi)及心包腔內(nèi)實質(zhì)性強回聲塊，邊界清晰，內(nèi)部回聲均勻，隨著心動周期有一定活動性。腫塊較小者無明顯血流動力學改變，較大者可阻塞流入道或者流出道，阻塞處血流流速可明顯增高。通常，心臟橫紋肌瘤腫瘤對心臟功能的影響較小，只有少數(shù)胎兒表現(xiàn)出心臟并發(fā)癥。腫瘤可發(fā)生于心臟任何部位，以左心室和室間隔最常見，30%可累及心房和右心室[5]。橫紋肌瘤的檢出與孕周密切相關(guān)，孕中晚期檢出率明顯高于孕早期。本例孕婦在孕26+4周超聲發(fā)現(xiàn)。心臟橫紋肌瘤多發(fā)，最大者位于右心房，較一般的橫紋肌瘤大很多，左心室可見多個小腫塊。位置固定，活動幅度低，未引起血流動力學改變。該胎兒引產(chǎn)后，心臟組織行病理檢查。大體標本為無包膜灰白色腫塊，大小不等，鏡檢可見特征性的“蜘蛛樣細胞”，行免疫組化亦證實為橫紋肌瘤。

心臟橫紋肌瘤與TSC密切相關(guān)，尤其是多發(fā)性心臟橫紋肌瘤是TSC的強烈預測指標[8-9]。CHEN等[10]報道多發(fā)性橫紋肌瘤的胎兒中有93%具有TSC1或TSC2突變。而且單發(fā)性心臟橫紋肌瘤與TSC之間的相關(guān)性也很高，有71%的單發(fā)性心臟橫紋肌瘤胎兒TSC基因檢測呈陽性。本病例因超聲提示胎兒多發(fā)心臟橫紋肌瘤，行家系全外顯子檢測，提示TSC2基因c.1839+2_1839+9del8移碼突變。這個變異位于經(jīng)典的mRNA剪接區(qū)域（外顯子±2bp區(qū)間），且核苷酸序列高度保守，較大概率導致氨基酸序列被改變，從而產(chǎn)生異常的蛋白質(zhì)。根據(jù)美國ACMG變異分類指南標準，為PVS1證據(jù)。同時，這個變異未在人群基因數(shù)據(jù)庫中報道，即人群頻率極低，為PM2證據(jù)。同時，通過家系檢測，及父母驗證未攜帶該突變，考慮為新發(fā)突變，為PS2證據(jù)。但該位點在相關(guān)臨床病例中未見報道，也未行相關(guān)功能學實驗驗證。結(jié)合送檢者的臨床表現(xiàn)和家系分析，依據(jù)美國ACMG變異分類指南，考慮為可能致病（PVS1+PM2+PS2）。TSC基因突變率高，Shruthi[11]等對98例TSC患者進行TSC1和TSC2基因變異檢測，發(fā)現(xiàn)14種新的錯義變異,這些新變異的致病性均通過應(yīng)用不同的生物信息學工具，包括計算機輔助蛋白質(zhì)建模來確定。Lin等[12]對77例TSC患者的TSC1和TSC2基因進行分析，共檢測到63例（81.8%）的突變，包括18個TSC1突變和45個TSC2突變，其中新發(fā)突變占14例。

圖1超聲提示胎兒心腔內(nèi)實質(zhì)性高回聲團（A：右心房內(nèi)實質(zhì)性高回聲團；B-D：左心室內(nèi)實質(zhì)性高回聲團）

圖3引產(chǎn)胎兒的心臟解剖圖片（可見多個橫紋肌瘤）

圖4橫紋肌瘤組織病理圖[A：HE染色后；B：免疫組化腫瘤細胞表達Desmin（+）]

TSC是一種常染色體顯性遺傳性疾病，由位于染色體9q34和16p13.3的TSC1基因或TSC2抑癌基因突變，影響Hamartin-Tuberin復合體功能，導致雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路過度活化[13-14]，臨床表現(xiàn)為錯構(gòu)瘤導致的累及多系統(tǒng)的神經(jīng)皮膚病變。其中85%～95%的TSC患者可有腦損傷，存在室管膜下結(jié)節(jié)或室管膜下巨細胞星形細胞瘤；80%～90%可出現(xiàn)癲癇，約2/3為難治性癲癇，30%～40%有智力低下或自閉癥[15]。神經(jīng)和精神癥狀的發(fā)病率和死亡率最高[16]。TSC患者表現(xiàn)差異大，典型表現(xiàn)如面部血管纖維瘤、癲癇、智力低下等在患兒生后才會出現(xiàn)[17]。多數(shù)TSC患者如果不及時治療，預后不良。只有少數(shù)患者表現(xiàn)為輕癥并預后良好[18]。目前TSC尚缺乏有效的治療手段，也無法預測疾病的嚴重程度和病程。TSC在胎兒期的首要表現(xiàn)是心臟橫紋肌瘤[19]，而其他系統(tǒng)的異常在胎兒期表現(xiàn)不明顯或難以檢測，且檢測方法在胎兒期受到諸多限制。作為一種罕見病，全面的遺傳學分析，使我們能夠明確胎兒橫紋肌瘤與TSC之間的關(guān)系，這些信息可以幫助醫(yī)生制定圍生期管理策略并降低新生兒死亡率。心臟橫紋肌瘤胎兒的預后咨詢不僅應(yīng)包括腫瘤本身的預后，還應(yīng)包括橫紋肌瘤與TSC之間的關(guān)系以及TSC預后的信息，強調(diào)遺傳分析的重要性。該TSC2基因新的可能致病位點的發(fā)現(xiàn)，不僅豐富了TSC基因數(shù)據(jù)庫，為TSC的遺傳學研究提供了新的依據(jù)。