雷諾嗪對大鼠急性心肌梗死早期心室肌縫隙連接蛋白43的影響

鄭展雄 張祥宇 江力勤 張冉

雷諾嗪（raolazine，Ran）為晚鈉電流特異性阻滯劑，急性心肌缺血缺氧時可減少心肌細胞內鈉離子濃度，減緩心肌細胞內鈣超載，減輕心肌細胞損傷，為新型抗心絞痛藥物。大量研究表明，Ran具有濃度依賴性多種離子通道電流阻滯效應，可抗快速性室性心律失常，但對影響心肌細胞電傳導及小分子物質細胞間交換的縫隙連接蛋白43（connexin 43，Cx43）鮮有報道。本實驗通過結扎大鼠冠狀動脈左前降支制作大鼠急性心肌梗死模型，尾靜脈注射Ran，觀察Ran對急性心肌梗死早期心室肌Cx43的影響，并探討可能機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物50只清潔級健康雄性SD大鼠，體重250～350 g，由常州卡文斯實驗動物有限公司提供[許可證號SCXK（蘇）2001-0003]，實驗動物相關操作符合浙江省實驗動物管理辦法要求。大鼠按隨機數(shù)字表法分為5組，每組10只：假手術組，不結扎冠狀動脈左前降支，注射0.9%氯化鈉溶液2.5 mL/kg；對照組，結扎冠狀動脈左前降支，注射0.9%氯化鈉溶液2.5 mL/kg；Ran低濃度組、中濃度組及高濃度組，均結扎冠狀動脈左前降支，分別注射Ran 0.05 mg/kg、0.5 mg/kg、5 mg/kg。

1.2試劑及儀器 雷諾嗪（美國Sigma公司，批號：093M4708V），Cx43一抗（美國Santa公司，批號：D0313），p-Cx43一抗（美國Santa公司，批號：12811），戊巴比妥鈉（美國Sigma公司，批號：20141010），0.9%氯化鈉溶液（杭州民生制藥，批號：C1409252），肝素鈉注射液（上海信宜制藥，批號：110903），熒光抗體二抗試劑盒（上海哈靈生物科技有限公司，批號：H120141008），Western blot免疫印記套裝（上海哈靈生物科技有限公司，批號：017140yjj），膜蛋白提取試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司，批號：P0033）。精密手術器械一套（上海醫(yī)療器械廠），大鼠手術臺，6/0縫線，小型動物呼吸機（成都泰盟軟件有限公司，型號：HX-101E），BL-420/820生物機能實驗系統(tǒng)（成都泰盟軟件有限公司），臺式小型高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司，型號：5417R），組織高速分散器（寧波新芝生物科技股份有限公司，型號：XHF-D），蛋白電泳/轉印系統(tǒng)（美國Bio-RaD公司，型號：Mini-PROTEAN Tetra Cell），全波長讀數(shù)儀/酶標儀（美國Thermo Scientific公司，型號：Multiskan GO），正置熒光生物顯微系統(tǒng)（德國Zeiss公司，型號：Axio Imager2），電子分析天平（瑞士Mettler-Tloledo公司，型號：MS403s/MS204s），脫色搖床（江蘇金壇儀器廠，型號：TY-80B），-86℃超低溫冰箱（中國海爾集團，批號：DW-86L388），-25℃醫(yī)用冰箱（中國海爾集團，批號：DW-25W388）。

1.3方法

1.3.1 造模（1）麻醉：大鼠稱重，3%戊巴比妥鈉2.5 mL/kg腹腔注射，待大鼠腱反射消失后仰臥位固定，全身肝素化。（2）氣管插管連接呼吸機：備毛，分離氣管，從甲狀軟骨下氣管軟骨環(huán)切開氣管，用自制內徑2 mm、長5 cm的氣管導管從環(huán)狀軟骨下2～3個軟骨環(huán)下插入，深度1 cm。連接小動物呼吸機，潮氣量6 mL/kg，頻率80次/min，吸呼比1∶2。（3）結扎冠狀動脈左前降支：常規(guī)消毒，每組分別尾靜脈單次注射0.9%氯化鈉溶液2.5 mL/kg、Ran 0.05 mg/kg、0.5 mg/kg、5 mg/kg，10 min后，連接大鼠肢體導聯(lián)心電圖，沿左鎖骨中線縱行切開皮膚，在第4～5肋間鈍性分離肌層，打開胸腔，剪開心包，輕壓右側胸廓，擠出心臟。選擇在左心耳和肺動脈圓錐之間，距離冠狀動脈起始處2～3 mm，以6/0無損傷逢合針結扎冠狀動脈左前降支；將心臟回納入胸腔，閉合胸腔，觀察心電圖1～5 min，ST段明顯抬高，為造模成功[1-2]。

1.3.2 多導生物機能系統(tǒng)記錄大鼠心電圖 自制電極插入大鼠四肢皮下，連接肢體導聯(lián)電極，記錄2 h內Ⅱ導聯(lián)心電圖，參數(shù)設置：紙速250 mm/s，增益10 Hz，電壓0.05 V。用Lambeth規(guī)則分析心電圖，采用steaer SE評分系統(tǒng)對2 h內快速性室性心律失常發(fā)生情況進行評分，測量各組2 h內Ⅱ導聯(lián)心率、Tp-e間期、Q-Tc間期、Tp-e/Q-Tc比值。

1.3.3 免疫熒光染色和激光共聚焦掃描成像2 h后，處死大鼠，取心臟標本，每組隨機取4個標本，取結扎處近端心室肌組織石蠟包埋，切片，厚度2μm，75℃烤箱放置1 h，二甲苯脫蠟，經各級乙醇至水洗?？乖迯鸵?5～97℃水浴加熱20 min。自然冷卻后0.03%過氧化氫室溫孵育30 min。蒸餾水沖洗1次，PBS沖洗5 min×3次。3%大牛血清封閉液（PBS稀釋），室溫20 min。滴加一抗（1∶200）。4℃過夜，37℃復溫30 min，PBS沖洗5 min×3次。滴加熒光素標記的二抗（1∶200），37℃孵育1 h。PBS沖洗5 min×3次?？光缒z封片，光鏡下觀察Cx43分布情況，紅色熒光顆粒為Cx43表達陽性染色。每個標本連續(xù)取4張切片，每張切片隨機選取6個視野，采用免疫熒光半定量法檢測Cx43總表達量，觀察Cx43細胞表面分布情況。采用Image J圖像分析軟件測定光密度值。

1.3.4 Western-Blot法檢測心肌組織磷酸化Cx43（p-Cx43）含量 每組取6個標本，取冠狀動脈左前降支結扎處近端心室肌組織心臟剪碎片；20 mg/200μL裂解液勻漿20 min，12 000 r/min離心5 min，取上清液，BCA蛋白定量，100℃沸水煮沸5 min，冰上驟冷，3 000 r/min離心1 min。上樣，電泳，200 mA恒流轉膜70 min。5%BSA室溫封閉2 h，TBST洗膜5 min×3次。加入封閉液稀釋的p-Cx43（1∶200），GAPDH（1∶2 000），4℃孵育過夜。TBST洗膜5 min×3次，辣根過氧化物酶標記的兔抗山羊二抗（1∶2 000）和HRP標記的羊抗大鼠二抗（1∶2 000）室溫孵育2 h。TBST洗膜15 min×5次?；瘜W發(fā)光檢測試劑反應2 min。

1.4統(tǒng)計學處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1各組大鼠快速性室性心律失常評分結果比較見表1。

表1各組大鼠快速性室性心律失常評分結果比較

由表1可見，對照組大鼠較假手術組心律失常評分升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），低濃度組、中濃度組、高濃度組大鼠較對照組心律失常評分降低，中濃度組、高濃度組大鼠較低濃度組心律失常評分降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。

2.2各組大鼠心率、Tp-e間期及Tp-e/Q-Tc間期比較 見表2。

由表2可見，假手術組大鼠心率較對照組加快，Tp-e/Q-Tc降低，Tp-e間期、Q-Tc間期縮短，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。對照組大鼠Tp-e/Q-Tc較假手術組、低濃度組、中濃度組、高濃度組升高（均P＜0.05），后3組之間差異亦有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；對照組大鼠Q-Tc間期較低濃度組、中濃度組、高濃度組降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），但后3組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。2.3各組大鼠心肌組織p-Cx43/GAPDH、Cx43熒光半定量值及鈣離子濃度比較 見表3、圖1。

圖1 p-Cx43電泳條帶圖

由表3、圖1可見，對照組大鼠心肌組織p-Cx43/GAPDH、Cx43表達量與假手術組、低濃度組差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），但較中濃度組、高濃度組降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；對照組大鼠心肌組織鈣離子濃度較假手術組升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），與低濃度組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），中濃度組較低濃度組降低，高濃度組較中濃度組降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。

2.4各組大鼠心肌組織染色結果 見插頁圖2。

圖2各組大鼠心肌組織染色圖（A：假手術組，B：對照組，C：低度濃度組，D：中度濃度組，E：高度濃度組；HE染色，×40）

由圖2可見，假手術組心室肌細胞排列整齊、無變性、無間質無水腫。對照組心室肌細胞空泡樣變性、細胞核消失，細胞間排列紊亂、間質水腫、細胞間連接模糊不清或消失，部分細胞破裂。低濃度組心室肌細胞空泡樣變性較對照組無明顯改變、細胞核較對照組無明顯改變；細胞間排列紊亂較對照組無明顯改變，細胞間質水腫、連接模糊不清或消失較對照組無明顯改變，細胞破裂化較對照組無明顯改變。中濃度組心室肌細胞腫脹，無空泡樣變性，心室肌細胞核完整，心肌細胞排列稍紊亂、細胞間質水腫較輕、心室肌細胞連接可見，心肌細胞無破裂。高濃度組心室肌細胞腫脹較對照組明顯改變、細胞核完整，心肌細胞排列規(guī)則、間質輕度水腫。

表2各組大鼠心率、Tp-e/Q-Tc、Tp-e間期及Q-Tc間期比較

表3各組大鼠心肌組織p-Cx43/GAPDH、Cx43熒光半定量值及鈣離子濃度比較

2.5各組大鼠梗死區(qū)心室肌Cx43細胞表面分布見插頁圖3。

圖3各組大鼠梗死區(qū)心室肌Cx43表面分布（A：假手術組，B：對照組，C：低度濃度組，D：中度濃度組，E：高度濃度組；免疫熒光染色，×200）

由圖3可見，假手術組心室肌Cx43分布在細胞端-端連接處，排列規(guī)則。對照組心室肌Cx43表達量較假手術組明顯減少，細胞表面分布不均勻，較假手術組心室肌細胞側面分布明顯增多。低濃度組心室肌Cx43表達量較對照組未見差異，較假手術組明顯減少，分散在細胞兩側，心室肌細胞端-端連接處分布較少。中濃度組心室肌Cx43表達量較假手術組減少，細胞表面分布不均勻，表達量較對照組明顯上升。高濃度組心室肌Cx43表達量較假手術組減少，分布主要集中在細胞端-端，排列不規(guī)則，Cx43表達量較對照組、低濃度組明顯上升。

3 討論

NaV1.5是細胞表面主要的電-門控性鈉離子通道蛋白，在閏盤處選擇性存在，細胞缺血缺氧時，心肌細胞內鈣離子濃度增加，氧化損傷加重，NaV1.5損傷加重。晚鈉電流（late sodium current，INaL）主要存在于心室肌中層細胞，由Nav1.5通道蛋白介導，正常心室肌INaL只占鈉電流（INa）的0.1%～1%。病理條件下INaL增加，舒張期Na+-Ca2+交換增加，內質網(wǎng)Ca2+釋放，M細胞動作電位時程延長，產生遲后除極，導致嚴重的心律失常。Ran為INaL阻滯劑，在減輕心肌缺氧損傷的同時，可抗心律失常。

Pezhouman等[3]用特異性INaL通道阻滯劑阻滯心室肌INaL15min后室性心律失常的發(fā)生顯著減少，阻滯劑消耗后快速性室性心律失常發(fā)生率增加。Samue等[4]在索他洛爾誘導的兔尖端扭轉型室性心動過速模型中證實Ran對INaL阻滯效應具有濃度依賴性，低劑量時對兔離體心肌電生理影響不明顯，高劑量明顯延長心室肌動作電位時程，降低早后除極和尖端扭轉型室性心動過速的發(fā)生率。本實驗顯示，低劑量Ran對急性心肌梗死大鼠的快速性室性心律失常評分無顯著影響，中、高劑量Ran可明顯降低快速性室性心律失常評分，提示Ran的抗心律失常作用可能與Ran的有效血藥濃度相關。各組大鼠心率無顯著差異，與大量實驗報道的Ran對心率影響不顯著相符。Ran干預后Q-Tc間期無明顯變化，提示Ran不顯著延長Q-Tc間期，但本實驗觀察到Tp-e間期、Tp-e/Q-Tc比值不同濃度Ran組較對照組降低，且效應與Ran濃度呈正相關。

Ran可特異性抑制病理條件下M細胞的INaL，抑制心肌細胞的Na+-Ca2+交換，減緩心肌細胞缺氧時細胞內Ca2+濃度，減輕心肌細胞內鈣超載。本實驗顯示梗死區(qū)心室肌細胞內鈣離子濃度增加，高、中濃度組心肌細胞內鈣離子濃度降低，可能與Ran有效抑制INaL，降低心肌組織鈣離子濃度相關[5]。

大鼠心室肌主要表達Cx43，半衰期為1～1.5 h，主要分布于心室肌細胞之間的閏盤處，呈條帶狀規(guī)則排列，在心肌細胞膜側面分布極少。病理條件下Cx43發(fā)生異質性，表現(xiàn)為Cx43表達降低、去磷酸化、細胞表面排列非均勻化、側面化。Cx43表達降低合并細胞表面分部非均勻化，可導致心肌組織間電傳導的各向異性，降低心肌細胞間電傳導速度，Cx43去磷酸化后活性降低，細胞間電傳導速度降低。Sato等[6]研究證實Cx43重構可通過導致心肌動作電位時程的變化、各向異性傳導、傳導的減慢等，增加心律失常易感性。我們在前期實驗中證實，胺碘酮聯(lián)合Ran對急性心肌梗死大鼠心室肌細胞起到一定的電穩(wěn)定作用[7]。Indra等[8]通過轉染Cx43E42K基因到健康小鼠胚胎，制作小鼠無功能性表達Cx43猝死模型，觀察到胚胎期Cx43+/E42K小鼠心室肌電生理易被干擾，未觀察到胚胎的結構缺陷，但胚胎易死亡。Cx43和NaV1.5均為細胞膜表面的重要蛋白。Agullo-Pascual等[9]的研究提示鈉離子通道蛋白在細胞膜表面的分布依賴Cx43，Cx43和Nav1.5在細胞表面通過橋粒連接相互作用。Wang等[10]采用具有穩(wěn)定微管蛋白作用的紫杉醇干預心肌缺血再灌注的大鼠模型，發(fā)現(xiàn)紫杉醇可以顯著增加Cx43的表達，減少側面化，減少動作電位時程，減少缺血性室性心律失常的發(fā)生。Zhang等[11]敲除心房肌細胞（HL-1細胞）表面橋?；蚝驝x43/Nav1.5表達量降低，鈉離子電流減少，HL-1細胞的傳導電壓降低，致命性心律失常發(fā)生率降低。Waring等[12]敲除Cx43基因導致鈉離子電流的減少與Nav1.5的減少呈正相關，重新導入羧基端基因或敲除301位到361位之間的氨基酸序列后鈉離子電流恢復。證實Cx43與鈉離子電流密切相關。Luqia等[13]用Kir2.1、NaV1.5和Cx43基因編碼的病毒轉染心臟纖維母細胞后心臟纖維母細胞具有產生和傳播動作電位的能力。

本實驗顯示，與假手術組相比，對照組Cx43、p-Cx43表達量明顯下降，Ran干預后表達量較對照組上升，表明Ran對Cx43、p-Cx43具有保護作用，可延緩Cx43、p-Cx43的降解；Ran對Cx43細胞表面分布側面化具有延緩作用，這種作用與Ran濃度呈正相關。Ran減緩Cx43的降解，降低Cx43側面化程度，降低Cx43磷酸化，可能與Ran阻滯INaL，降低心肌細胞內鈣離子濃度，穩(wěn)定Nav1.5蛋白，穩(wěn)定Cx43和NaV1.5連接相關。具體機制還有待進一步實驗探究。