miR-140-5p靶向Nrf2對(duì)高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)作用△

張新霞 陸麗紅 狄文玉 王小敏 王保君

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病的主要微血管并發(fā)癥之一，最終可引起患者視力下降甚至失明[1]。然而，目前對(duì)該病病理發(fā)生機(jī)制的認(rèn)識(shí)仍十分有限，且現(xiàn)有的治療手段仍不能達(dá)到較為理想的效果，因此，深入探討該病的分子生物學(xué)機(jī)制仍具有重要意義。microRNAs(miRNAs)通過堿基互補(bǔ)配對(duì)同靶mRNA結(jié)合，抑制基因表達(dá)從而達(dá)到調(diào)節(jié)各項(xiàng)細(xì)胞功能的作用，miRNAs參與調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝和凋亡等過程[2-3]，研究表明，miR-140-5p在糖尿病患者中表達(dá)上調(diào)[4-5]。然而，miR-140-5p是否參與調(diào)控DR的發(fā)生發(fā)展及其潛在機(jī)制尚未明確。核因子-類胡蘿卜素2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)是腫瘤防御的一個(gè)重要因子[6]，在細(xì)胞對(duì)抗外來異物和氧化損傷中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[7]。本研究擬探討miR-140-5p是否通過靶向Nrf2，在高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelial，RPE)細(xì)胞氧化應(yīng)激過程中發(fā)揮調(diào)控作用，為 DR的臨床治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料ARPE-19細(xì)胞株購自廣州吉妮歐生物科技有限公司。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；青霉素、鏈霉素、SYBR-Green Real-Time PCR Master均購自美國Thermo Fisher Scientific公司；TRIzol、LipofectamineTM2000試劑購于美國Invitrogen公司；RT Master Mix(Perfect Real Time)及SYBR Premix Ex TaqTM檢測(cè)試劑盒均購自日本Takara Bio公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Applied Biosystems公司；基因引物購自中國GenScript公司；CCK-8試劑盒購自德國Roche公司；1×binding緩沖液購于美國Sigma-Aldrich公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)酶活性試劑盒購于南京建成生物工程研究所；熒光素酶檢測(cè)報(bào)告試劑盒購于中國碧云天公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及高糖處理在含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清(FBS)、100 U·mL-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)ARPE-19細(xì)胞，并置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。培養(yǎng)基每周更換2～3次。高糖處理：細(xì)胞培養(yǎng)基中分別加入5 mmol·L-1、10 mmol·L-1、20 mmol·L-1、30 mmol·L-1、50 mmol·L-1的葡萄糖，48 h后收獲細(xì)胞，CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞存活率，RT-qPCR檢測(cè)各組細(xì)胞miR-140-5p和Nrf2 mRNA的表達(dá)情況。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組處理使用LipofectamineTM2000質(zhì)粒，按照說明書流程，將miR-140-5p inhibitor、miR-140-5p-NC、miR-140-5p-mimic、si-Con或si-Nrf2轉(zhuǎn)染入ARPE-19細(xì)胞，根據(jù)轉(zhuǎn)染物不同，分為空白對(duì)照組(轉(zhuǎn)染miR-140-5p-NC)、過表達(dá)組(轉(zhuǎn)染miR-140-5p-mimic)、干擾組(轉(zhuǎn)染miR-140-5p-inhibitor)；轉(zhuǎn)染48 h后，RT-qPCR檢測(cè)3組miR-140-5p和Nrf2 mRNA的表達(dá)，熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Nrf2相對(duì)熒光素酶活性。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，再經(jīng)不同濃度葡萄糖處理48 h，根據(jù)轉(zhuǎn)染物和葡萄糖濃度不同隨機(jī)分為對(duì)照組(5 mmol·L-1葡萄糖+miR-140-5p-NC)、高糖對(duì)照組(50 mmol·L-1葡萄糖+miR-140-5p-NC)、高糖抑制組(50 mmol·L-1葡萄糖+miR-140-5p-inhibitor)、高糖空白組(50 mmol·L-1葡萄糖+miR-140-5p-NC+si-Con)、高糖miR干預(yù)組(50 mmol·L-1葡萄糖+miR-140-5p-inhibitor+si-Con)、高糖Nrf2逆轉(zhuǎn)組(50 mmol·L-1葡萄糖+miR-140-5p-inhibitor+si-Nrf2)，收集各組細(xì)胞后，檢測(cè)細(xì)胞存活率及細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量和SOD活性，同時(shí)RT-qPCR檢測(cè)高糖空白組、高糖miR干預(yù)組和高糖Nrf2逆轉(zhuǎn)組Nfr2 mRNA的表達(dá)。

1.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率采用CCK-8試劑盒檢測(cè)不同處理后的ARPE-19細(xì)胞存活率。細(xì)胞以每孔5×103個(gè)接種于96孔板，孵育48 h后將CCK-8溶液按每孔10 μL添加入培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，使用微孔板讀數(shù)器在450 nm處測(cè)量光密度值。

1.5 RT-qPCR檢測(cè)應(yīng)用TRIzol試劑提取不同處理后各組ARPE-19細(xì)胞RNA。使用RT Master Mix(Perfect Real Time)檢測(cè)試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒行RT-qPCR，所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。qPCR為500 ng cDNA和SYBR-Green Real-Time PCR Master混合液，設(shè)定PCR程序：94 ℃預(yù)變性4 min，94℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72℃ 30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。使用2-ΔΔCt方法定量表達(dá)水平，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列為：miR-140-5p 上游引物： 5-’TGCGGCAGTGGTTTTACCCTATG- 3’ ，下游引物：5’- CCAGTGCAGGGTCCGAGGT -3’；U6 上游引物： 5-’TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3’ ，下游引物： 5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’； Nrf2 上游引物： 5’-TGAGGTTTCTTCGGCTACGTT-3’ ，下游引物：5’-CTTCTGTCAGTTTGGCTTCTGG-3’；β-actin 上游引物： 5’-CCACACCTTCTACAATGAGC-3’，下游引物：5’-GGTCTCAAACATGATCTGGG-3’。

1.6 細(xì)胞ROS含量檢測(cè)使用DCFH-DA熒光探針檢測(cè)不同處理后ARPE-19細(xì)胞內(nèi)ROS含量。ARPE-19細(xì)胞同10 μmol·L-1DCFH-DA在黑暗條件下于37 ℃孵育20 min。PBS洗滌后重懸，將濃度調(diào)整為106個(gè)·mL-1。使用流式細(xì)胞儀(激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)521 nm)檢測(cè)具有熒光標(biāo)記的細(xì)胞后，進(jìn)一步使用FlowJo軟件分析熒光強(qiáng)度，并計(jì)算細(xì)胞ROS含量。

1.7 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)使用SOD酶活性試劑盒檢測(cè)各組SOD酶活性，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行。

1.8 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)將含有Nrf2啟動(dòng)子的假定結(jié)合位點(diǎn)同潛在miR-214-3p結(jié)合位點(diǎn)或Nrf2 3’-UTR突變體克隆到質(zhì)粒中。ARPE-19細(xì)胞于含體積分?jǐn)?shù)10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)并用熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，48 h后，通過雙重?zé)晒馑孛笢y(cè)定系統(tǒng)(Promega)測(cè)量相對(duì)熒光素酶活性。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 20.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,行t檢驗(yàn)或One-Way ANOVA檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 高糖對(duì)細(xì)胞存活率及miR-140-5p表達(dá)情況的影響CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)5 mmol·L-1、10 mmol·L-1、20 mmol·L-1、30 mmol·L-1、50 mmol·L-1葡萄糖處理后，ARPE-19細(xì)胞的存活率分別為(100.0±2.1)%、(98.9±3.5)%、(96.9±3.8)%、(82.3±3.9)%、(43.7±2.6)%；經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，與5 mmol·L-1葡萄糖處理后相比，30 mmol·L-1、50 mmol·L-1葡萄糖處理后ARPE-19細(xì)胞存活率均顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05、P<0.001)，其余濃度組間兩兩相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。經(jīng)5 mmol·L-1、10 mmol·L-1、20 mmol·L-1、30 mmol·L-1、50 mmol·L-1葡萄糖處理后，ARPE-19細(xì)胞miR-140-5p相對(duì)表達(dá)量分別為1.0±0.1、1.2±0.1、1.3±0.1、2.5±0.3、5.4±0.2；經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，與5 mmol·L-1葡萄糖處理后相比，30 mmol·L-1、50 mmol·L-1葡萄糖處理后ARPE-19細(xì)胞miR-140-5p相對(duì)表達(dá)量均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05、P<0.001)，其余濃度組間兩兩相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。

2.2 抑制miR-140-5p對(duì)高糖狀態(tài)下細(xì)胞存活率及氧化應(yīng)激水平的影響RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、過表達(dá)組、干擾組miR-140-5p相對(duì)表達(dá)量分別為100.0%±8.2%、351.1%±9.2%、25.3%±5.2%；經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，與空白對(duì)照組相比，過表達(dá)組miR-140-5p相對(duì)表達(dá)量顯著增加，干擾組則顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.001)。轉(zhuǎn)染并給予不同濃度葡萄糖處理后，相較于對(duì)照組，高糖對(duì)照組細(xì)胞存活率顯著降低，ROS含量顯著增加，SOD活性顯著降低(均為P<0.001)；相較于高糖對(duì)照組，高糖抑制組細(xì)胞存活率顯著增加，ROS含量顯著降低，MDA活性顯著增加(均為P<0.01)。見表1。

表1 各組細(xì)胞存活率、ROS含量、SOD活性

2.3 miR-140-5p靶向基因 Nrf2的表達(dá)5 mmol·L-1、10 mmol·L-1、20 mmol·L-1、30 mmol·L-1、50 mmol·L-1葡萄糖處理后的ARPE-19細(xì)胞，Nrf2 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為100.0%±1.5%、97.5%±2.1%、93.2%±2.4%、46.3%±1.9%、31.3%±2.1%；經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，與5 mmol·L-1葡萄糖處理后相比，30 mmol·L-1、50 mmol·L-1葡萄糖處理后細(xì)胞Nrf2 mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01、P<0.001)，其余濃度組間兩兩相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、過表達(dá)組、干擾組Nrf2相對(duì)熒光素酶活性分別為100.0%±4.3%、37.5%±3.8%、231.1%±5.7%；經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，與空白對(duì)照組相比，過表達(dá)組Nrf2相對(duì)熒光素酶活性顯著降低，干擾組則顯著增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.001)。

2.4 干預(yù)Nrf2對(duì)miR-140-5p介導(dǎo)的細(xì)胞存活及氧化應(yīng)激水平的影響經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，相較于高糖空白組，高糖miR干預(yù)組Nrf2 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高，細(xì)胞存活率顯著增加，ROS含量顯著下降，SOD活性顯著增加(均為P<0.001)；相較于高糖miR干預(yù)組，高糖Nrf2逆轉(zhuǎn)組Nrf2 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低，細(xì)胞存活率顯著降低,ROS含量顯著增加,SOD活性顯著降低(均為P<0.01)。見表2。

表2 各組Nrf2 mRNA相對(duì)表達(dá)量、細(xì)胞存活率、ROS含量、SOD活性

3 討論

DR是常見的糖尿病微血管并發(fā)癥之一，可導(dǎo)致嚴(yán)重的視力障礙甚至失明。RPE細(xì)胞在維持視網(wǎng)膜功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用[8]，RPE細(xì)胞損傷和DR的發(fā)生關(guān)系緊密。由于糖尿病患者長(zhǎng)期處于高血糖狀態(tài)，機(jī)體內(nèi)細(xì)胞極易發(fā)生黏附分子活化、抗氧化酶損傷等病理性改變，誘發(fā)RPE細(xì)胞氧化應(yīng)激的發(fā)生，從而引發(fā)患者視力下降。

miRNA是一類長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA，通常為基因表達(dá)負(fù)性調(diào)控因子，在多種疾病中發(fā)揮調(diào)控作用[9]。它們通常與mRNA的特定區(qū)域結(jié)合并阻止翻譯，從而導(dǎo)致其靶蛋白表達(dá)水平降低。抑制miRNA的表達(dá)，可以引起相關(guān)蛋白表達(dá)的增加。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病發(fā)生發(fā)展過程中，包括組織代謝變化、胰島素質(zhì)量控制、β細(xì)胞功能控制及糖尿病并發(fā)癥發(fā)生過程中，miRNA均發(fā)揮了重要的作用[10]。Ortega等[11]發(fā)現(xiàn)，葡萄糖耐量正常(NGT)者相對(duì)于2型糖尿病患者miR-140-5p表達(dá)顯著增加；miR-140與病態(tài)肥胖，尤其是脂肪含量相關(guān)，減肥手術(shù)后，其表達(dá)水平降低。然而，miR-140-5p是否參與調(diào)控DR的發(fā)生發(fā)展仍尚未明確。本研究結(jié)果顯示，高糖誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞氧化應(yīng)激中，當(dāng)細(xì)胞存活率顯著性降低時(shí)，miR-140-5p表達(dá)顯著性升高；抑制miR-140-5p表達(dá)可顯著逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞存活率下降及氧化應(yīng)激發(fā)生。以上結(jié)果說明，miR-140-5p在高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。Su等[12]的研究結(jié)果顯示，糖尿病腎病患者腎組織中miR-140-5p表達(dá)顯著下調(diào)，而miR-140-5p可通過抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路從而改善高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，提示miR-140-5p對(duì)于高糖環(huán)境具有重要的調(diào)節(jié)作用，與本研究得出的結(jié)果具有一定的相似性。

Nrf2是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的重要轉(zhuǎn)錄因子，是維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)的中樞調(diào)節(jié)者。外源性有毒物質(zhì)和氧化應(yīng)激使Nrf2活化，活化的Nrf2可以清除自由基，上調(diào)多種抗氧化酶及解毒酶，提高SOD等抗氧化酶表達(dá)水平，維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)水平[13]。DR的主要病理過程為高糖誘導(dǎo)RPE細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，最終誘發(fā)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致患者視力下降。該過程是否有Nrf2參與且Nrf2與miR-140-5p間是否存在靶向關(guān)系，是本研究核心探討的問題。雖然目前有報(bào)道提示，miR-140-5p可通過靶向Nrf2和Sirt2促進(jìn)心肌氧化應(yīng)激，加重阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性[14]；miR-140-5p可通過Keap1獨(dú)立機(jī)制激活Nrf2/ARE途徑，減輕順鉑所致急性腎損傷的氧化應(yīng)激[15]。而在DR研究領(lǐng)域，miR-140-5p靶向作用Nrf2是否為高糖誘發(fā)RPE細(xì)胞氧化應(yīng)激發(fā)生的重要信號(hào)通路，目前尚未完全闡明。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境中Nrf2-mRNA表達(dá)發(fā)生顯著性降低，說明Nrf2可能參與了高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激調(diào)控，且調(diào)控結(jié)果同miR-140-5p相反。熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)證明了Nrf2可充當(dāng)miR-140-5p的靶基因，且最終通過轉(zhuǎn)染si-Nrf2，證明了這一通路在高糖誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中的作用。

綜上，本研究結(jié)果表明，miR-140-5p通過調(diào)節(jié)Nrf2在高糖誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要調(diào)控作用，對(duì)該機(jī)制的進(jìn)一步研究可能有助于開發(fā)新的DR的治療靶點(diǎn)。