樺褐孔菌多糖經(jīng)Nrf2信號通路對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織氧化應激和炎癥反應的抑制作用△

楊雪 左中夫

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥。研究證實，DR的發(fā)生與氧化應激和炎癥反應密切相關。機體內Nrf2信號通路是保護正常細胞免受活性氧、氧化應激以及外源性損傷的主要細胞信號通路[1]。當受到氧化活性物質刺激時，Nrf2與AU富含元件結合，釋放下游的靶基因，調控抗氧化酶和Ⅱ相代謝酶基因的轉錄[2]，發(fā)揮抗氧化應激作用。樺褐孔菌是一種寄生在白樺、榆樹和銀樺等樹干或樹皮上的真菌。呂金玲等[3]研究表明，樺褐孔菌多糖能有效降低血糖濃度，起到抗氧化應激的作用。本研究探討樺褐孔菌多糖經(jīng)Nrf2信號通路對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織氧化應激和炎癥反應的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物分組及模型構建選取12周齡雄性SD大鼠40只(體質量200～300 g，購自錦州醫(yī)科大學實驗動物中心)，每天給予大鼠標準顆粒飼料，自由飲水；環(huán)境溫度為20～25 ℃，相對濕度為40%～60%。將實驗大鼠在標準條件下正常飼養(yǎng)1周后隨機分為4組：正常對照組10只、糖尿病組10只、IOP組(給予大鼠樺褐孔菌多糖300 mg·kg-1)10只和抑制劑組(給予大鼠樺褐孔菌多糖300 mg·kg-1+鋅原卟啉20 mg·kg-1)10只。除正常對照組外，其余大鼠均采用一次性腹腔注射10 g·L-1鏈脲佐菌素(60 mg·kg-1)制作糖尿病大鼠模型，并于給藥后48 h和72 h后分別測量尾靜脈血糖濃度，當血糖濃度≥16.7 mmol·L-1時，認為造模成功。樺褐孔菌多糖采用灌胃法給藥；抑制劑組在樺褐孔菌多糖灌胃前24 h將鋅原卟啉20 mg·kg-1經(jīng)腹腔注射給大鼠。正常對照組和糖尿病組灌胃相同體積的生理鹽水,并于12周后禁食不禁水12 h后進行實驗。

1.1.2 主要試劑與儀器鏈脲佐菌素(美國Sigma公司)，樺褐孔菌多糖(延邊高麗釀造有限公司)，丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成生物科技有限公司)，兔抗大鼠Nrf2多克隆抗體、兔抗大鼠HO-1多克隆抗體、兔抗大鼠COX-2多克隆抗體、山羊抗兔IgG(廣州歐邊生物制品有限公司)，萬能顯微鏡和照相機(日本OLYMPUS公司)，石蠟切片機、DFC295成像系統(tǒng)(德國LEICA公司)，全自動生化分析儀(上海泰醫(yī)醫(yī)療儀器設備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集將大鼠麻醉后，用40 g·L-1多聚甲醛灌注心臟，立即取一側眼球，保留視神經(jīng)，去除多余組織，固定于FFA固定液10 min后，再用40 g·L-1多聚甲醛固定24 h。石蠟包埋，切片，厚度為5 μm，用于HE染色和免疫組織化學染色。分離的新鮮視網(wǎng)膜繼續(xù)冰凍用于Western blot檢測。

1.2.2 視網(wǎng)膜樣品組織中MDA、GSH、SOD含量檢測測量大鼠體質量，取靜脈血，采用全自動生化分析儀測定大鼠空腹血糖濃度。處死大鼠，摘取另一側眼球制成組織勻漿，嚴格遵照MDA、GSH、SOD試劑盒的說明書來測定視網(wǎng)膜樣品組織中MDA、GSH、SOD含量。

1.2.3 采用HE染色觀察視網(wǎng)膜形態(tài)并檢測視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞密度用蘇木精浸染視網(wǎng)膜切片3 min，水洗后移入分化液中分化30 s，使切片退至淡藍紅色，放入水中洗滌5 min，移入伊紅液中浸染 90 s，水洗擦干后用梯度酒精脫水各2 min。最后置于二甲苯中透明處理，封片，用顯微鏡觀察視網(wǎng)膜形態(tài)，并計算神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量，分析其密度變化。

1.2.4 免疫組織化學染色觀察視網(wǎng)膜細胞HO-1陽性染色情況將視網(wǎng)膜切片常規(guī)脫蠟入水，梯度酒精脫水，之后轉移至PBS緩沖液中孵育5 min，再用過氧化氫孵育10 min，在正常山羊血清中室溫封閉30 min后，去除封閉液，滴加一抗工作液,4 ℃孵育過夜。用PBS清洗切片2次后，滴加二抗工作液，室溫孵育20 min，再次用PBS清洗擦干切片后滴加新鮮的DAB工作液，在顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜細胞染色情況。隨后，用蘇木素復染2 min，水洗切片，進行脫水封片,計算陽性細胞率。

1.2.5 采用Western blot法檢測視網(wǎng)膜HO-1、Nrf2和COX-2蛋白的表達取冷凍的視網(wǎng)膜組織，加入4倍體積的細胞裂解液；取上清，加入考馬斯亮蘭，用Bradford 法測定蛋白含量；將玻璃板放置在架子上進行灌膠和上樣，電泳4～5 h后進行轉膜。利用半干法將目的蛋白轉移到PVDF膜上，用麗春紅染色后，置于脫色搖床上搖5 min。用PBS清洗1次后浸入脫脂奶粉封閉液，置于搖床上過夜，用PBS洗3次，每次5 min。采用ECL試劑盒顯色，檢測 HO-1、Nrf2和COX-2蛋白的表達水平。

1.3 統(tǒng)計學分析應用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以均數(shù)±標準差表示；采用單因素方差分析或雙因素方差分析進行各組間比較。檢驗水準：α=0.05。

2 結果

2.1 造模前后各組大鼠體質量和血糖濃度比較4組大鼠造模前體質量和血糖濃度差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)。造模后12周，糖尿病組、IOP組、抑制劑組大鼠體質量均低于正常對照組，血糖濃度均高于正常對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)；IOP組大鼠血糖濃度均<16.7 mmol·L-1，糖尿病組和抑制劑組血糖濃度均大于該值。見表1。

表1 造模前后各組大鼠體質量和血糖濃度比較

2.2 造模后各組大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD、GSH和MDA的含量比較造模后，各組大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD、GSH和MDA的含量檢測結果見表2。由表2可見:糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD、GSH的含量明顯低于正常對照組(均為P<0.01);MDA含量明顯高于正常對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.01)。IOP組視網(wǎng)膜組織中SOD、GSH含量高于糖尿病組及抑制劑組，MDA含量顯著低于糖尿病組及抑制劑組，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。

表2 造模后各組大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD、GSH和MDA的含量

2.3 各組大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)及神經(jīng)節(jié)細胞計數(shù)HE染色后顯微鏡觀察結果顯示，正常對照組和IOP組大鼠視網(wǎng)膜各層結構清晰，排列整齊；糖尿病組和抑制劑組大鼠視網(wǎng)膜分層模糊，各層排列紊亂，細胞水腫明顯(圖1)。正常對照組、糖尿病組、抑制劑組和IOP組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞密度分別為(2300±100)個·mm-2、(1400±100)個·mm-2、(1505±95)個·mm-2、(2250±95)個·mm-2。正常對照組和IOP組神經(jīng)節(jié)細胞密度均高于糖尿病組(均為P<0.01)；抑制劑組神經(jīng)節(jié)細胞密度低于IOP組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；而正常對照組與IOP組神經(jīng)節(jié)細胞密度相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖1 各組大鼠視網(wǎng)膜HE染色 A：正常對照組；B：糖尿病組；C：抑制劑組；D：IOP組。箭頭示視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞

2.4 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中HO-1、Nrf2和COX-2蛋白的表達免疫組織化學染色結果顯示：正常對照組視網(wǎng)膜切片上可見少量HO-1陽性表達點，其他3組HO-1陽性表達點增多，且IOP組HO-1陽性表達點高于糖尿病組和抑制劑組，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。Western blot結果顯示:糖尿病組HO-1、Nrf2及COX-2蛋白的表達均高于正常對照組(均為P<0.01)。IOP組大鼠視網(wǎng)膜組織中HO-1、Nrf2蛋白表達高于糖尿病組，COX-2蛋白的表達低于糖尿病組(均為P<0.01)；抑制劑組大鼠視網(wǎng)膜組織中HO-1、Nrf2蛋白表達低于IOP組，COX-2蛋白的表達高于IOP組，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.01)。見表3。

表3 造模后各組大鼠視網(wǎng)膜組織中HO-1、Nrf2和COX-2蛋白的相對表達量

3 討論

隨著人們生活水平的提高，加之其他諸多因素的影響，糖尿病患病率不斷升高。據(jù)統(tǒng)計，2011年，全球大約有3.66億糖尿病患者，到2030年這個數(shù)字預測將增加到5.52億[4]。糖尿病的并發(fā)癥是導致糖尿病患者病情惡化，致殘和致死的重要原因[5]。

DR是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一，是導致世界范圍內成年人視力喪失的主要原因[6]，嚴重影響患者的生活質量。DR的發(fā)生與發(fā)展與多個因素有關，主要包括多元醇通路、高級糖基化終末產(chǎn)物的形成、蛋白激酶C的激活等。以上這些信號通路均可以激活氧化應激反應，生成異常代謝通路，導致視網(wǎng)膜缺血缺氧，加重炎癥反應，使氧自由基產(chǎn)生增加，機體抗氧化清除能力降低，細胞凋亡，最終導致視網(wǎng)膜出血、滲出等。SOD是生物體內存在的一種抗氧化金屬酶，在機體氧化與抗氧化平衡中起到至關重要的作用。GSH作為重要的抗氧化劑，能夠清除人體內的自由基，參與體內多種氧化還原反應。MDA是體內自由基作用于脂質發(fā)生過氧化的終末產(chǎn)物，可間接反映脂質過氧化水平。本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD、GSH的含量明顯低于正常對照組，MDA含量高于正常對照組，糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)結構出現(xiàn)了異常變化，表明在高糖狀態(tài)下，視網(wǎng)膜氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡，清除氧自由基的能力減弱，導致氧化應激損傷增強，細胞遭受自由基的攻擊而引起了不可逆性損傷。

Keap1-Nrf2-ARE通路可抵抗來自化學因素、環(huán)境因素等多種因素導致的氧化應激反應，是調節(jié)機體氧化還原反應的關鍵通路，激活其可使抗氧化蛋白、抗炎因子的表達上調，減輕機體氧化應激損傷[7]。Nrf2是一種細胞內轉錄因子，它參與細胞氧化應激等多種防御機制。Nrf2 處于靜止期時主要位于胞質內，當受到氧化活性物質刺激時，Nrf2 轉位進入細胞核內，再與ARE啟動子部位結合，釋放下游的靶基因，調控抗氧化酶(主要包括HO-1、過氧化物酶-1、SOD、GSH-Px和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶等)和Ⅱ相代謝酶(主要包括谷胱甘肽-S-轉移酶、NQO1、葡萄糖醛酸轉移酶1A6等)基因的轉錄活動[8],從而可以清除細胞內活性氧自由基和炎癥因子，降低血清中MDA的含量，降低機體內氧化還原反應，發(fā)揮抗氧化及抗炎的作用[9]。HO-1是氧化應激的重要參與者，且極易被誘導。在本研究中，糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜組織中Nrf2及HO-1的表達高于正常對照組，HO-1的表達由細胞質轉位于細胞核，表明在高糖狀態(tài)下，機體啟動了Nrf2/ARE信號通路，使下游的抗氧化酶HO-1被激活，增強了細胞的抗氧化能力。目前，COX-2被公認為重要的炎癥因子，是花生四烯酸代謝的一種重要酶[10]，其與炎癥、腫瘤等病理狀態(tài)下新生血管的生成密切相關，并參與了DR的病理過程[11]。在高糖的病理狀態(tài)下，核轉錄因子-κB、白細胞介素-6等炎癥因子作為順式作用元件，上調COX-2的表達[12]，COX-2催化花生四烯酸生成前列腺素，產(chǎn)生縮血管前列腺素，損害血管內皮的功能[13]，促進DR的進一步發(fā)展。COX-2的表達量與炎癥反應密切相關，在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜組織中COX-2表達較正常對照組增多，表明氧化應激伴隨炎癥反應增強，加快了DR的進展。

樺褐孔菌，又名白樺茸，是一種寄生在白樺、榆樹和銀樺等樹干或樹皮上的藥用真菌[14]。樺褐孔菌中含有200多種生物活性物質[15]，其中樺褐孔菌多糖被認為是潛在的保健成分[16]，也是公認的有效降糖成分。樺褐孔菌多糖能夠清除活性氧自由基，抑制細胞間核酸的氧化，增強SOD和過氧化物酶的活性[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，與糖尿病組大鼠相比，IOP組大鼠血糖濃度明顯降低，視網(wǎng)膜組織中SOD、GSH含量顯著增高，MDA含量顯著降低，視網(wǎng)膜各層結構未見異常，提示樺褐孔菌多糖可以有效地降低血糖濃度，減輕氧化應激反應，具有抗氧化作用。鋅原卟啉為HO-1抑制劑，本研究發(fā)現(xiàn)，IOP組大鼠Nrf2、HO-1的表達較糖尿病組上調明顯，而COX-2表達明顯下降，加入鋅原卟啉后，下調了Nrf2、HO-1的表達，上調了COX-2的表達。這些均提示樺褐孔菌多糖能夠激活Nrf2信號通路并上調其下游抗氧化蛋白的表達，降低DR大鼠視網(wǎng)膜氧化應激及炎癥反應。

綜上所述，樺褐孔菌多糖能夠對DR起到對抗作用，其機制與激活Nrf2信號通路有關。