microRNA通過ROS途徑對腦膠質瘤調節(jié)機制的研究進展

李 晶，崔宏偉，楊 凌*

(內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 1.全科醫(yī)學科；2.臨床醫(yī)學研究中心，內蒙古 呼和浩特 010050)

腦膠質瘤(glioma)是成人中樞神經系統(tǒng)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，占顱內腫瘤的35%～61%，具有發(fā)病率高和治愈率低的特點，對人體健康造成了嚴重危害。腦膠質瘤是一種異質性腫瘤，由世界衛(wèi)生組織(WHO)分類為生長緩慢、很少發(fā)生惡性轉化的毛細胞性星形細胞瘤(Ⅰ級)和3組彌漫性浸潤性星形細胞瘤(Ⅱ級)，間變性星形細胞瘤(Ⅲ級)和膠質母細胞瘤(Ⅳ級)[1]。Ⅰ、Ⅱ級為低級別膠質瘤，Ⅲ、Ⅳ級為高級別膠質瘤，它們表現出更高的惡性程度。這些腫瘤顯示出大量的微血管增生，假性壞死和呈浸潤式生長，不易切除，且術后易復發(fā)[2]。雖然在開發(fā)治療方法方面，包括手術切除、放療、化療、

免疫治療、光動力治療、中醫(yī)藥治療等方面取得了顯著進展，治療效果明顯改善，但腦膠質瘤患者的預后和生存率仍不理想，而且膠質瘤的高侵襲性極大地限制了其整體治療效果，特別是惡性程度最高的多形性膠質母細胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)[3-4]。膠質瘤的治療難度取決于多種生物學機制，如通過血腦屏障的藥物傳遞失敗、腫瘤對化療的反應以及腫瘤細胞的內在抵抗等。因此，從分子生物學方面深入研究膠質瘤發(fā)生、發(fā)展所涉及的分子機制，開發(fā)新的、更加有效的治療策略勢在必行。近年來小核糖核酸(microRNA，miRNA)的表達已被用作癌癥診斷、進展、預后和治療效果的指標，它們可以作為診斷生物標志物和治療靶點?；钚匝?reactive oxygen species，ROS)作為細胞氧化還原的主要活性產物，參與不同的信號傳導通路來控制細胞的穩(wěn)定性。許多研究表明，miRNA參與了膠質瘤的發(fā)展，并與腫瘤發(fā)生和進展中的ROS相關，了解miRNA對ROS的作用機制可以為腦膠質瘤的治療制定新的治療方案。本文將綜述腦膠質瘤中參與調節(jié)ROS的miRNA及其作用。

1 miRNA與腦膠質瘤

miRNA是一組長度在19～24個核苷酸的胞質非編碼RNA，在細胞增殖、分化、凋亡、腫瘤發(fā)生、遷移、侵襲和神經元發(fā)育等生物學行為中起著重要作用。miRNA作為基因表達的負調控因子發(fā)揮作用，通過與靶基因3’-非翻譯區(qū)(3’-UTR)的特異性結合，導致靶mRNA轉錄抑制或蛋白質合成受阻。miRNA已成為人類癌進程中的重要調節(jié)因子，根據靶基因可以作為癌基因或抑癌基因，它們在腫瘤發(fā)生、血管生成、侵襲和凋亡中起著重要作用。一些miRNA也與臨床結果和化療和放療抵抗有關。此外，miRNA有可能影響對分子靶向治療的反應，也可能與腫瘤干細胞特性有關，影響腫瘤的維持和進展。

miRNA在膠質瘤的發(fā)展中起著至關重要的作用，如miR-21作為癌基因在約70%的腫瘤樣品中過表達，在膠質瘤中也上調miRNA表達，miR-21能利于細胞存活，其在膠質瘤細胞中的敲除導致細胞凋亡增加、侵襲性降低和體內腫瘤生長抑制，特別地，miR-21能夠增強膠質瘤細胞對多種化療藥物和腫瘤壞死因子相關配體的敏感性[5]。在多形性膠質母細胞瘤中研究較好的miR-21、miR-26a、miR-221/222、miR-7和miR-34a的靶點主要是EGFR/PTEN/Akt和p53/pRB通路的組成部分[1]。另外miR-421通過直接靶向MEF2D發(fā)揮腫瘤抑制作用[6]，miR-526b-3p通過靶向WEE1抑制膠質瘤的發(fā)生和進展[7]，以及miR-193-5p靶向ELTD1和調節(jié)細胞周期抑制了膠質瘤細胞的增殖[8]?？偟膩碚f，在膠質瘤進展過程中，miRNA是具有診斷和預后潛力的生物學標志物，被認為是重要的潛在調節(jié)因子，它們可能成為膠質瘤的治療靶點。

2 ROS與腦膠質瘤

在正常生理條件下，細胞呼吸過程中不斷產生活性氧(ROS)，并根據環(huán)境條件調節(jié)各種信號通路的刺激。ROS是指氧的某些代謝產物和一些反應的含氧產物，它們是具有活性的物質，主要包括超氧陰離子(O2·ˉ)，羥基自由基(·OH)，羥基離子(OH-)，過氧化氫(H2O2)，單線態(tài)氧(1O2)和臭氧(O3)等，并且已被報道為調節(jié)細胞信號傳導的重要化學介質[9]。線粒體是ROS產生的主要部位。ROS可以分為內源性和外源性，前者涉及線粒體電子傳遞鏈[3]、NADPH氧化酶(NADPH oxidase，NOX)，以及炎性級聯，而后者來自異種生物代謝、電離輻射、重金屬和吸煙等。當細胞受到內外環(huán)境的刺激，如細胞代謝活動增加、線粒體功能障礙導致缺氧或自噬、過氧化物酶體活化、細胞信號的生長因子失控、癌基因活化以及癌細胞中的ROS源(如NADPH氧化酶、環(huán)氧化酶或脂氧化酶)活性增強等，ROS產生增多，從而破壞了機體氧化與抗氧化防御系統(tǒng)之間的平衡，最終導致氧化應激[10-11]。所以，氧化應激是ROS生成和抗氧化機制之間速率改變的結果。ROS在多種信號傳導中發(fā)揮關鍵作用，包括低氧誘導因子-1α(HIF-1α)，NF-κB，p53和轉化生長因子β(TGF-β)，其參與細胞生存、增殖、凋亡、侵襲和轉移等重要生理過程[12]。ROS能夠促進腫瘤細胞的激活，可以對DNA、蛋白質和脂質造成損傷，通過刺激激酶和具有分子開關的小G蛋白(如c-Src、Ras和ERK1/2)等細胞內信號，嚴重影響基因調控，導致細胞異常增殖，進而促進癌癥的發(fā)生和發(fā)展[10,13]。

中樞神經系統(tǒng)因為具有較高的代謝活性和相對降低的細胞再生能力，因此對ROS的氧化損傷尤為敏感。在阿爾茨海默病患者的海馬和新皮質以及肌萎縮側索硬化的運動神經元中檢測到蛋白質氧化和脂質過氧化。據報道，ROS可通過凋亡和壞死機制導致神經元和星形膠質細胞死亡。在多形性膠質母細胞瘤(GBM)中，高代謝率和ROS基礎水平的增加對信號傳導的調節(jié)起著重要作用，保護惡性細胞免受凋亡，從而創(chuàng)造免疫抑制環(huán)境。細胞針對ROS分子的抗氧化防御體系涉及內源性抗氧化劑，例如谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)，過氧化氫酶(catalase，CAT)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)等[14]。氧化環(huán)境支持GBM細胞的存活，誘導健康細胞產生CAT和SOD等抗氧化酶，以降低ROS的升高水平，這說明癌細胞及腫瘤微環(huán)境已經發(fā)展出應對氧化應激的能力。研究顯示蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)抑制劑、Go6976、COX-2抑制劑、NS398、NADPH氧化酶抑制劑、二亞苯基氯化碘鹽(diphenyleneiodonium，DPI)和ROS清除劑、SOD和Tempol能相繼阻斷TPA誘導的U87膠質瘤細胞的侵襲/遷移，并降低了相關信號通路。進一步研究表明ROS激活的ERK刺激環(huán)氧合酶-2/前列腺素E2和金屬蛋白酶-9參與了TPA誘導的U87膠質瘤細胞的侵襲與遷移，并且槲皮素、黃芩素和楊梅素等抗氧化物質能有效地抑制膠質瘤細胞的侵襲與遷移[15]。因此，了解ROS在腦膠質瘤中的調節(jié)機制可能有助于開發(fā)有效的治療策略。

3 miRNA通過ROS對腦膠質瘤的調節(jié)

3.1 調節(jié)膠質瘤細胞增殖和凋亡

miRNA通過調節(jié)靶基因的表達影響ROS的產生，對腦膠質瘤細胞的增殖、凋亡產生影響。miR-34a作為研究較深的腫瘤抑制性miRNA是抑癌基因p53基因調控網絡的一部分，在多種實體瘤中普遍處于下調狀態(tài)，包括人腦膠質瘤A172細胞和腦膠質瘤組織中，上調miR-34a可通過其靶基因NOX2增加ROS的產生，從而抑制細胞的增殖，促進其凋亡[16](表1)。miR-183/96/182在膠質瘤組織中表達增加，屬于致癌miRNA，敲除單個組分或整個miR-183/96/182簇可通過ROS介導的AKT和p53途徑誘導細胞凋亡，但是抑制miR-183/96/182簇誘導ROS介導的AKT/凋亡信號傳導與miR-183/96/182的3個靶基因FGF9、CPEB1和FOXO1無關。然而，miR-183/96/182簇的缺失誘導了ROS介導的p53/凋亡信號，這種作用依賴于FGF9、CPEB1和FOXO1[17]。線粒體發(fā)生功能障礙時，會導致線粒體膜電位降低，產生過量的ROS和ATP，并改變凋亡蛋白的表達。miR-101是腫瘤抑制miRNA，在星形細胞瘤U251細胞中轉染miR-101能夠破壞線粒體途徑提高細胞的ROS水平，升高Bax/Bcl-2比率和切割的caspase-9等凋亡信號誘導細胞凋亡[18]。Herpud1是保護癌細胞氧化應激的細胞保護因子，miR-9-3p可以通過調節(jié)Herpud1基因增加腦膠質瘤細胞中H2O2誘導的凋亡[19]。

表1 miRNA對腦膠質瘤ROS的調節(jié)機制Table 1 Regulation mechanism of microRNAs on ROS in glioma

miRNA也可以通過參與對內源性抗氧化劑的表達調控對細胞ROS水平產生影響。過氧化物酶3(peroxiredoxin 3,PRDX3)基因位于線粒體內，是清除線粒體內H2O2的主要過氧化物酶。miR-383與正常腦組織相比，miR-383在人髓母細胞瘤組織、人髓母細胞瘤D314和Daoy細胞系中表達降低，通過轉染上調miR-383可以負調節(jié)PRDX3的表達，導致細胞內ROS水平增加，線粒體膜電位降低，從而抑制D314細胞增殖，誘導其凋亡[20-21]。

3.2 誘導腦膠質瘤干細胞凋亡或分化

在包括膠質瘤在內的許多腫瘤類型中，都存在一個類似莖的亞群，這些具有自我更新能力和膠質瘤不成熟表型的小群體細胞，稱為“膠質瘤干細胞(glioma stem cells，GSC)”，它們表現出干細胞特性，并具有啟動和增殖腫瘤的能力[22]。腦膠質瘤含有豐富的缺氧區(qū)域，提供了促進維持和擴增膠質瘤干細胞增殖的微環(huán)境。miR-210在細胞適應缺氧、干細胞存活和干細胞維持中發(fā)揮重要作用。缺氧導致GSC中HIF-2α mRNA表達和miR-210表達增加。敲除miR-210可以降低神經球形成能力、干細胞標志物表達和細胞活力，并能誘導缺氧GSC分化和G1期阻滯。敲除miR-210可以導致缺氧GSC的凋亡率和caspase-3/7活性升高，侵襲能力、ROS和乳酸鹽產生降低。這些研究結果表明，miR-210可能是消除位于缺氧區(qū)的GSC的潛在治療靶點[23]。miR-128a能夠改變腫瘤細胞內的氧化還原狀態(tài)并促進細胞衰老，此外，miR-128a通過靶向Bmi-1抑制成神經管細胞瘤細胞的生長[24]。

miR-153在GSC中被發(fā)現下調，miR-153過表達可以導致神經球形成能力和干細胞標志物表達降低，并通過ROS介導的p38 MAPK的激活誘導分化[22]。研究已表明ROS介導的p38 MAPK通路控制腦膠質瘤細胞的分化和腫瘤起始能力。特別是觀察到腦膠質瘤起始細胞中p38途徑刺激分化和細胞自我更新的喪失是ROS依賴性觸發(fā)的，這表明氧化應激剝奪了這些細胞的干性[25]。此外，miR-153過表達能夠降低腦膠質瘤干細胞的致瘤能力，并可增加攜帶人類腦膠質瘤干細胞的小鼠的存活率[22]。

3.3 提高放療或化療的敏感性

放療和化療是治療多種惡性腫瘤(包括腦膠質瘤)的重要治療策略。然而，腫瘤細胞對放療和化療的抵抗降低了許多腦膠質瘤患者治療的效果。據報道，由于DNA損傷檢查點的激活和DNA修復的提高，GSC顯示出對輻射的抵抗力。在GSC中發(fā)現miR-153下調，其靶基因核因子E2相關因子2(Nrf-2)上調，Nrf-2表達的增強可以增加谷胱甘肽過氧化物酶1(GPx1)的轉錄和降低ROS水平，導致GSC對放療的抗性。對miR-153進行過表達可以增加ROS的產生并使GSC對放射增敏[22]。細胞對ROS產生增加的適應導致了放射抗性，Bmi-1是一個與腫瘤細胞放射抗性相關的癌基因。miR-128a是抑制Bmi-1表達的特異性miRNA。在U-87MG腦膠質瘤細胞中，X線輻射以劑量依賴的方式抑制細胞生長。U-87MG細胞在暴露于X線輻射24 h后，細胞周期分布改變，G0/G1期細胞數量增加。在1和2 Gy組中，Bmi-1的mRNA表達水平下調，在6和8 Gy組中上調。1號和2號Gy組miR-128a的表達水平上調，8 Gy組下調。暴露于≥2Gy后，ROS水平升高，加入N-乙酰半胱氨酸能夠誘導放射抗性。這些結果表明高劑量的X線輻射增加了Bmi-1的表達水平，同時miR-128a水平下降，ROS水平上升，說明ROS可能參與了U-87MG細胞中X線輻射的抑制作用機制， 并且ROS的下調可能誘導放射抗性[26]。電離輻射可以引起膠質瘤細胞系U-251的miR-193a-3p表達的變化，miR-193a-3p表達增加通過γH2AX誘導細胞內ROS和DNA損傷的積累，從而誘導細胞凋亡?？寡趸幚砜梢宰钄鄊iR-193a-3p誘導的凋亡和DNA損傷，表明ROS在miR-193a-3p的調控機制中起關鍵作用。進一步研究顯示，Mcl-1是miR-193a-3p的直接靶標。通過siRNA轉染使Mcl-1下調，模擬miR-193a-3p轉染的結果，顯示ROS、DNA損傷、細胞色素C的釋放和細胞凋亡都有所增加[27]。

替莫唑胺(TMZ)是一種口服烷基化劑，廣泛應用于難治性膠質瘤。然而，癌細胞滲透性差和耐藥性限制了該藥物的療效。miR-155為一種致癌miRNA，并且在成膠質細胞瘤中高表達。MAPK13和MAPK14作為腫瘤抑制基因在降低ROS的積累、誘導細胞凋亡和減緩癌進展方面發(fā)揮重要作用。敲除miR-155可以通過靶向MAPK13和MAPK14加強TMZ對腦膠質瘤細胞U87的抗腫瘤作用，使細胞對化療增敏[28]。敲除miR-183/96/182簇也可以通過調節(jié)ROS介導的凋亡途徑抑制膠質瘤細胞的增殖，增強TMZ對膠質瘤細胞的抗癌作用[17]。

4 問題與展望

細胞氧化還原系統(tǒng)的改變是導致癌細胞惡性和增殖的重要因素，ROS在很大程度上促進了腦膠質瘤細胞的快速增殖及對傳統(tǒng)治療方法的抵抗。癌細胞由于其高基礎代謝率，與正常細胞相比更容易受到針對細胞氧化還原狀態(tài)的治療藥物的影響，如新的氧化還原療法可以減少氧化應激，防止細胞損傷和高突變率，減少免疫抑制環(huán)境。利用ROS破壞細胞微環(huán)境中的氧化還原平衡，改變氧化還原穩(wěn)態(tài)和以降低它們的增殖率并誘導異常細胞分化或凋亡，可以為癌的治療提供新的思路。在多種腫瘤包括腦膠質瘤中，miRNA通過其廣泛的作用也參與了ROS調控，因此以miRNA作為調控ROS的重要因子，可能成為腦膠質瘤治療中潛在的靶點，為基因診斷和治療提供了新的突破，這有助于提高腦膠質瘤的治療效率，延長患者的生存期。