三胸家族核心成員DPY30與ASH2L的表達相關性分析

文 暢，李 梁，舒鵬程，強伯勤，彭小忠,2*

(1. 中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所 北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院 生物化學與分子生物學系醫(yī)學分子生物學國家重點實驗室 醫(yī)學靈長類研究中心 神經科學中心, 北京 100005;2. 中國醫(yī)學科學院 醫(yī)學生物學研究所， 云南 昆明 650118)

三胸家族(trithorax group proteins, TrxG)與多梳家族(polycomb group proteins, PcG)是一對進化上高度保守，功能上相互拮抗的組蛋白修飾復合物，二者分別通過促進組蛋白H3K4或H3K27的甲基化修飾，改變染色質結構，進而分別激活或抑制基因的轉錄[1]。 TrxG復合物由WDR5、ASH2L、RBBP5和DPY30 4種核心成員、SET1A、SET1B、MLL1、MLL2、MLL3和MLL4中任意1種甲基轉移酶分子及一些輔助成員組成，TrxG各復合物通過促進組蛋白H3K4me3修飾形成，使染色質結構松散，便于轉錄因子的結合，進而激活基因轉錄[2]。

DPY30通過與ASH2L發(fā)生直接相互作用，從而參與TrxG復合物形成，這種相互作用對TrxG的甲基轉移酶活性有重要的調節(jié)作用[3-5]。在小鼠神經系統(tǒng)發(fā)育過程中條件性敲除DPY30與ASH2L會引起相似的表型[6-7]，并且DPY30與ASH2L均對上皮性卵巢癌細胞增殖、運動及上皮間質轉化等具有重要作用[8-10]，但二者之間的表達相關性目前尚不明確。本研究通過一系列實驗發(fā)現在人體各組織及K562細胞分化過程中，ASH2L與DPY30表達具有相關性，且ASH2L可能調控了DPY30蛋白水平。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:ASH2L條件性敲除(ASH2L-cKO)小鼠通過ASH2Lfl/fl小鼠與D6-Cre工具鼠配種所得的二代雜合子小鼠再次交配獲得，采用同窩野生型(Wild Type, WT)小鼠作為對照。ASH2L-cKO/D6-Cre小鼠可在大腦皮質特異性敲除ASH2L基因[6]。小鼠飼養(yǎng)在無特定病原體環(huán)境中，飼養(yǎng)溫度20 ℃～24 ℃，自由飲食，晝夜各12 h，所有動物護理和實驗均已獲得中國醫(yī)學科學院/北京協(xié)和醫(yī)學院動物保護與利用委員會的批準(文號：ACUC2010A02-123)，所有程序均在符合實驗動物法規(guī)(中國科學技術技術委員會第2號命令)下進行。

1.1.2 實驗細胞系:人慢性髓源白血病(K562)細胞系(中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞資源中心)。

1.1.3 主要試劑:成人多組織(MTNTM)膜和Northern雜交液(Clontech公司)；探針標記試劑盒(Promega公司)；，ASH2L抗體、MLL1抗體和MLL2抗體(Bethyl公司)；DPY30抗體和β-actin抗體(Sigma-Aldrich公司)；WDR5抗體(RDsystem公司)；RBBP5抗體(Abcam公司)； H3K4me3抗體(Millpore公司)；免疫熒光抗體辣根過氧化物酶交聯(lián)的山羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶交聯(lián)的山羊抗小鼠IgG和辣根過氧化物酶交聯(lián)的兔抗山羊IgG(北京中杉金橋生物技術公司)；ChIP-seq所用ASH2L和H3K4me3抗體(Active Motif公司)；Lipofectamin2000和Opti-MEM(Invitrogen公司)；反轉錄試劑盒(Vazyme公司)；熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa公司)；引物合成(北京擎科生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 Nortehrn blot檢測分子表達:將MTNTM膜置于6×SSC中浸濕，置于雜交管中，加入68 ℃預熱的雜交液5 mL，68 ℃預雜交30 min，棄預雜液；將32P標記的探針(25 ng)98 ℃變性5 min，與預熱的雜交液混勻，加到雜交管內，68 ℃雜交60 min；將雜交膜置于2×SSC,0.5% SDS 中室溫洗3次，每次10 min，于0.1×SSC,0.1% SDS中，68 ℃洗2次，每次20 min；將濕膜置于保鮮膜內，壓X線片，-70 ℃曝光。

1.2.2 誘導K562細胞分化:取對數增殖期的K562細胞，按(4～5)×105個/mL重懸于新配置的培養(yǎng)基中。將1 mg/mL(1.6×10-3mol/L)PMA儲藏液稀釋100倍，每10ml細胞懸液加稀釋后的PMA 31 μL，分別于誘導0.5、1、2、4和8 h后收獲細胞，Trizol法提取總RNA。

1.2.3 Western blot檢測蛋白水平:用TNTE裂解液提取小鼠大腦皮質蛋白，BCA法測定總蛋白濃度，配置適當比例的凝膠進行蛋白電泳，內參蛋白β-actin抗體稀釋比例為1∶5 000，ASH2L、MLL1、MLL2和H3K4me3抗體稀釋比例為1∶1 000，WDR5和RBBP5抗體稀釋比例為1∶200，DPY30抗體稀釋比例為1∶100，辣根過氧化物酶交聯(lián)的山羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶交聯(lián)的山羊抗鼠IgG、辣根過氧化物酶交聯(lián)的兔抗山羊IgG稀釋比例均為1∶5 000。

1.2.4 RT-qPCR檢測RNA水平:Trizol法提取總小鼠大腦皮質總RNA，按照說明書用反轉錄試劑盒進行RNA反轉錄反應，配置相應體系進行RT-qPCR反應，RT-qPCR反應條件: 95 ℃預變性3 min，擴增循環(huán)50次(循環(huán)條件: 95 ℃/10 s，60 ℃/30 s)，72 ℃延伸10 min，最后4 ℃冷卻。根據Cq值計算各基因RNA表達水平。qPCR所用引物序列如表1。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for RT-qPCR

1.2.5 ChIP-seq分析: 本研究中ChIP-seq實驗為取小鼠大腦皮質，干冰凍存寄往美國Active Motif公司進行ChIP-seq實驗及分析后，采用IGV軟件進行結果可視化分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 不同組織中DPY30與ASH2L表達分布相似

ASH2L在血液系統(tǒng)組織中表達較高，如骨髓、胎肝。DPY30與ASH2L表達分布有一定的相似性，均在骨髓、胎肝中有較高表達，同為TrxG核心成員的WDR5表達則較ASH2L和DPY30低，其與ASH2L的表達相似性較DPY30低(圖1)。

2.2 DPY30與ASH2L在PMA誘導K562細胞分化過程中表達趨勢相似

以細胞分化初始(0 h)表達量為基準，DPY30與ASH2L表達均隨著K562細胞分化逐漸減少，而同為三胸家族核心成員的WDR5的表達則在分化進行的0～1 h短暫地降低后再次升高至接近初始(0 h)水平(圖2)。

2.3 條件性敲除ASH2L導致DPY30蛋白減少

ASH2L-cKO小鼠大腦皮質中，組蛋白H3K4me3修飾水平降低，DPY30蛋白減少，而其他成員蛋白含量無明顯改變(圖3A)，但條件性敲除ASH2L并未導致TrxG核心成員DPY30、WDR5、RBBP5的RNA水平改變(圖3B)。

A.expression of ASH2L and DPY30 in various human tissues; B.quantitative analysis of ASH2L and DPY30 in various human tissues圖1 ASH2L與DPY30在多種人體組織中表達情況Fig 1 Detection of the expression of ASH2L and DPY30 in various human

A.expression of ASH2L and DPY30 during PMA-induced K562 cells’ differentiation; B.quantitative analysis of ASH2L and DPY30 during PMA-induced K562 cells differentiation

A.protein expression of TrxG members in the cerebral cortex of ASH2L-cKO mouse; B.quantitative analysis of TrxG core components’ mRNA expression in the cerebral cortex of ASH2L-cKO mouse compared with WT mouse cortex, *P<0.05(WT:n=3, ASH2L-cKO:n=3)

2.4 H3K4me3與ASH2L在ASH2L與DPY30基因調控區(qū)域有分布

H3K4me3與ASH2L在ASH2L與DPY30基因上游調控區(qū)域均有分布，但H3K4me3在ASH2L與DPY30基因上游調控區(qū)域的結合峰度在WT和ASH2L-cKO小鼠大腦皮質中未出現明顯改變(圖4，表2)。

表2 ASH2L與DPY30基因位點上ASH2L 與H3K4me3結合峰度分析

3 討論

TrxG通過促進基因上游調控區(qū)域的組蛋白H3K4me3修飾，激活基因轉錄，在細胞周期調控、機體發(fā)育、腫瘤發(fā)生等眾多生命過程中發(fā)揮著十分重要的調控作用[1,2]。ASH2L與DPY30均是TrxG核心成員，ASH2L與甲基轉移酶、RBBP5、WDR5和DPY30蛋白分子均能發(fā)生相互作用，進而發(fā)揮調節(jié)酶活性、輔助TrxG募集到染色質相應位置等功能[3-5,11]。DPY30是TrxG中最后被發(fā)現的核心成員[12]，在復合體中僅依靠氨基酸殘基相互作用，并且這種相互作用對H3K4me3的形成、基因轉錄調控、細胞增殖分化等過程具有重要作用[3-5]。但DPY30在TrxG復合體中的具體功能目前尚不清楚。

A,B.analysis of the distribution of H3K4me3 and ASH2L on ASH2L and DPY30 loci圖4 ASH2L與DPY30基因位點上H3K4me3與ASH2L在分布情況分析Fig 4 Analysis of distribution of H3K4me3 and ASH2L on ASH2L and DPY30 gene loci

本研究發(fā)現，在不同組織及K562細胞分化過程中，DPY30與ASH2L的表達具有一定的相似性，而TrxG另一核心成員WDR5的表達則不具有這種相似性，ASH2L-cKO/D6-Cre小鼠大腦皮質中DPY30蛋白減少，說明ASH2L可能對DPY30蛋白水平具有調控作用，缺失ASH2L蛋白會導致DPY30蛋白減少，而ASH2L-cKO/D6-Cre小鼠大腦皮質中DPY30的RNA水平改變無統(tǒng)計學意義，說明ASH2L不是在RNA水平，可能是在蛋白水平對DPY30的表達進行調節(jié)。同時ChIP-seq結果可視化分析中，H3K4me3與ASH2L在ASH2L與DPY30基因上游調控區(qū)域均有分布，但H3K4me3在ASH2L與DPY30基因上游調控區(qū)域的結合峰度在WT和ASH2L-cKO/D6-Cre小鼠大腦皮質中未出現明顯改變，提示ASH2L與DPY30的轉錄可能受到TrxG所促進的H3K4me3修飾方式調節(jié)，但這種調節(jié)并不受ASH2L表達水平的影響，從另一方面說明ASH2L不是在RNA水平對DPY30的表達進行調節(jié)。然而，為什么DPY30與ASH2L表達具有相關性，ASH2L是如何調節(jié)DPY30蛋白水平的，這些問題目前尚沒有解決，需要更多的實驗加以探究。