利用DNA-RNA嵌合體增強CRISPR-Cas12a的靶標特異性（2020.7.22 Plant Biotechnology Journal）

CRISPR-Cas12a是第二類（V型）用于編輯哺乳動物基因組的CRISPR-Cas系統(tǒng)。Cas12a通過單鏈（cr）RNA與目標DNA螺旋結(jié)合，形成DNA-RNA雜交雙鏈。Cas12a在功能上與CRISPR-Cas9形成互補，一直是一種備受關(guān)注的基因工程工具。與識別富含鳥嘌呤（G）序列的Cas9不同，Cas12a識別特定的富含胸腺嘧啶（T）的PAM序列（TTTN或TTN），并能特異性地誘導DNA雙鏈斷裂。

2020年7月2日，Nucleic Acids Research在線發(fā)表了來自韓國研究者的題為“Enhancement of target specificity of CRISPR–Cas12a by using a chimeric DNA–RNA guide”的論文，研究人員對CRISPR-Cas12a系統(tǒng)進行改進，用DNA部分替代（cr）RNA，改變堿基對靶DNA的能量勢，可以高效、特異性地誘導靶DNA序列突變。這種基于DNA-RNA嵌合體的CRISPR-Cas12a基因組編輯，減少了脫靶切割，從而提高了安全性，在基因突變引起的不治癥的治療應用上具有潛在的潛力。

CRISPR-Cas12a比CRISPR-Cas9對目標DNA與gRNA的錯配更敏感;當錯配引入時，其切割活性將被顯著抑制。但是，在其他區(qū)域的錯配仍然可能存在，只是目前無法檢測到。用DNA取代（cr）RNA可以通過改變導向物與靶點之間的結(jié)合能來提高靶點特異性。此外，DNA在水溶液中比RNA更穩(wěn)定，更容易應用于基因組編輯，更便于產(chǎn)品商業(yè)化。因此，在本研究中，作者試圖用DNA來替換了CRISPR-Cas12a的部分gRNA，進而提高系統(tǒng)的準確性，并使傳統(tǒng)CRISPR-Cas12a基因組編輯工具更加多樣化。

基于已經(jīng)構(gòu)建好的CRISPR-Cas12a復合物中明確的gRNAs和氨基酸序列與特定DNA的結(jié)合，作者在5端，3端和特定區(qū)域篩選可以降低脫靶效率但是不降低靶向切割效率的（cr）RNA-DNA嵌合體。實驗結(jié)果表明在5發(fā)卡端的DNA替換會降低發(fā)卡結(jié)構(gòu)的改變，進而使Cas12a的活力提高。除了5發(fā)卡端，在目標序列的特殊區(qū)域內(nèi)的DNA替換將降低靶向切割效率，這樣表明Cas12a蛋白需要與特定區(qū)域的2-OH識別才能穩(wěn)定（cr）RNA-DNA雙鏈結(jié)構(gòu)。

（cr）RNA-DNA嵌合體降低了雜交能量，提高了對錯配的敏感性，大大提高了目標DNA的特異性。作者使用SpCas9-切口酶和嵌合（cr）RNA引導的Cas12a，解決了目標編輯效率低的問題。開發(fā)了一種高度靶向特異性的基因組編輯技術(shù)。