多因素響應(yīng)面法優(yōu)化紅景天抗氧化有效物質(zhì)提取工藝

張睿 王 湘 王玥琦 馮麗莉

摘要? 目的：研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化紅景天抗氧化有效物質(zhì)的提取工藝。方法：以乙醇濃度、提取時(shí)間、乙醇用量為主要影響因素，紅景天苷提取率（%）、提取液體外DPPH清除率（%）和提取液體外總抗氧化能力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用3因素5水平響應(yīng)面法對(duì)紅景天抗氧化有效物質(zhì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果：Design-Expert軟件優(yōu)化得到的最佳提取工藝為，飲片加11倍體積46.60%乙醇溶液提取4.67 h，提取2次，合并提取液，濃縮，即得。該提取工藝下紅景天苷提取率為1.12%，提取液DPPH清除率為89.13%，總抗氧化能力為1.39 mmol/L。結(jié)論：用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的紅景天抗氧化有效物質(zhì)提取工藝簡(jiǎn)便易行，準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性好。

關(guān)鍵詞? 紅景天;抗氧化;多因素;響應(yīng)面法;紅景天苷提取率;DPPH清除率;總抗氧化能力;提取工藝

Optimal Extraction of Herba Rhodiolae Antioxidant Active Ingredients by Multi-factors Response Surface Methodology

ZHANG Rui，WANG Xiang，WANG Yueqi，F(xiàn)ENG Lili

（College of Basic Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）

Abstract Objective： To optimize the extraction technology of Herba Rhodiolae antioxidant active ingredients by response surface methodology. Methods： Based on ethanol concentration，extraction time and dosage of ethanol as the main in uencing factors，the 3 factor 5 level response surface methodology was applied to optimize antioxidant active ingredients extraction of Herba Rhodiolae with evaluation indexes including extraction yield of Herba Rhodiolae （%），extracting liquid outside DPPH clearance （%） and extracting liquid outside total antioxidant activities（mmol/L）. Results： The optimal extraction process optimized by Design-Expert software was as follows：decoction peices adding 11 times of 46.60% ethanol solution and were extracted from for 4.67 h twice.The extracts were combined and concentrated.Under this extraction process，the extraction rate of Herba Rhodiolae is 1.12%，the DPPH removal rate of the extract was 89.13%，and the total antioxidant capacity was 1.39 mmol/L. Conclusion： The extraction process of Herba Rhodiolae antioxidants optimized by response surface method is simple，easy to implement，and has good accuracy and reproducibility.

Keywords? Herba Rhodiolae; Antioxidant active ingredients; Multi-factors，Response surface methodology; Extraction yield of Herba Rhodiolae; DPPH clearance; The total antioxidant activities by FRAP methods; Extraction technology

中圖分類號(hào)：R284 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2020.14.001

藏藥紅景天是景天科植物大花紅景天的干燥根和根莖，始載于公元8世紀(jì)藏醫(yī)藥經(jīng)典《四部醫(yī)典》[1]，稱其為“長(zhǎng)生不老草”“九死還生草”，被譽(yù)為“高原人參”，具有扶正固本、理氣養(yǎng)血等功效，《中華人民共和國(guó)藥典》（2015版一部）謂其“味甘、苦，平。歸肺、心經(jīng)。功能益氣活血、通脈平喘，用于氣虛血瘀、胸痹心痛、中風(fēng)偏癱、倦怠氣喘”[2]，是具有極高藥用價(jià)值的珍貴藥材?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，紅景天具有抗腫瘤、抗抑郁、抗疲勞、抗缺氧和免疫調(diào)節(jié)等功效[3-5]。同時(shí)，紅景天提取物具有卓越的抗氧化能力，被廣泛應(yīng)用于延緩機(jī)體衰老及防治氧化相關(guān)的老年性疾病[6-9]。另外，紅景天服用安全，原衛(wèi)生部2002年已批準(zhǔn)其為可用于保健食品的中藥品種[10]，是近年來國(guó)內(nèi)炙手可熱的保健中藥，具有廣闊的應(yīng)用前景。

目前紅景天藥材中分離出40多種化學(xué)物質(zhì)，包括酚類、黃酮類、生物堿類、揮發(fā)油以及其他的一些常見物質(zhì)（氨基酸類、多糖類、果膠、蛋白質(zhì)、蠟等）[11]，其中紅景天苷被認(rèn)為是紅景天保健功效的最重要成分。因此目前紅景天的提取制備以及產(chǎn)品的質(zhì)量控制中一般以紅景天苷提取率或者含量作為指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化評(píng)價(jià)[12]，而中藥中其他同樣有可能發(fā)揮抗氧化活性的有效物質(zhì)卻沒有得到體現(xiàn)。為了綜合評(píng)價(jià)紅景天提取物抗氧化能力，最大限度的提取紅景天藥材中抗氧化有效物質(zhì)，本研究擬以紅景天苷提取率（%）、提取液體外DPPH清除率（%）和提取液總抗氧化能力（mmol/L）3者相結(jié)合的綜合效應(yīng)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面方法對(duì)紅景天抗氧化有效物質(zhì)的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀（配有PDA檢測(cè)器、四元梯度泵、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、Empower工作站，美國(guó)沃特世科技有限公司，美國(guó)，型號(hào)：2695-2996）;酶標(biāo)儀（美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司，美國(guó)，型號(hào)：Thermo MK3）;精密電子天平（瑞士梅特勒-托利多國(guó)際股份有限公司，瑞士，型號(hào)：AL104-IC）;超聲波清洗器（江蘇昆山市超聲儀器有限公司，型號(hào)：KQ-500E）;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠，型號(hào)：RE-52）;紫外可見分光光度計(jì)（北京萊伯泰科儀器有限公司，型號(hào)：BlueStar）;中草藥打粉機(jī)[泰斯特儀器設(shè)備（天津）有限公司，型號(hào)：FW17];智能恒溫水浴鍋（北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司，型號(hào)：HW SY21/KP6）;控溫?cái)?shù)顯電熱套[泰斯特儀器設(shè)備（天津）有限公司，型號(hào)：98-I-B]。

1.2 試劑 美國(guó)Cayman Chemical的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl，DPPH，批號(hào)：14805）;總抗氧化能力試劑盒[T-AOC檢測(cè)試劑盒（FRAP法）微板法，南京建成生物工程研究所，批號(hào)：A015]及其他分析試劑甲醇（北京化學(xué)試劑公司，批號(hào)：bh100619）;乙醇（北京化學(xué)試劑公司，批號(hào)：BH100213，95%乙醇）;色譜試劑甲醇（北京匯海科儀科技有限公司，F(xiàn)isher Scientific，美國(guó)，批號(hào)：A452-4）;乙腈（北京匯?？苾x科技有限公司，F(xiàn)isher Scientific，美國(guó)，批號(hào)：A998-4）。

1.3 藥物 中藥紅景天飲片[北京同仁堂（集團(tuán)）有限責(zé)任公司，批號(hào)：20160921];紅景天苷標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110818-201507）。

2 方法與結(jié)果

2.1 優(yōu)化指標(biāo)測(cè)定

2.1.1 HPLC法測(cè)定紅景天苷提取率

2.1.1.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑C18分析柱（4.6 mm×150 mm，5 μm，Dikma），甲醇-水（15∶ 85）為流動(dòng)相，柱溫30 ℃，進(jìn)樣體積10 μL。取濃度為44.70 μg/mL紅景天苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣后經(jīng)二極管陣列檢測(cè)器全波長(zhǎng)掃描，可見紅景天苷在275 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，保留時(shí)間9.7 min，該色譜條件下，色譜峰分離良好，故測(cè)定時(shí)選用此波長(zhǎng)。

2.1.1.2 紅景天苷對(duì)照品儲(chǔ)備液的配制 精密稱取紅景天苷對(duì)照品29.80 mg置于100 mL棕色容量瓶中，加甲醇適量超聲溶解后稀釋至刻度，得到濃度為298.00 μg/mL的紅景天苷對(duì)照品儲(chǔ)備液，即得。

2.1.1.3 供試樣品的制備 取紅景天藥材粉末（過10目篩）適量，精密稱定，置圓底燒瓶中，按提取實(shí)驗(yàn)安排提取，提取前后稱定質(zhì)量，并用相同溶劑補(bǔ)足，過濾后合并濾液，混勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

2.1.1.4 紅景天苷線性關(guān)系考察 精密吸取紅景天苷對(duì)照品儲(chǔ)備液（298.00 mg/L）0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL和3.00 mL分別置于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得到濃度范圍在14.90～89.40 mg/L的紅景天苷對(duì)照品溶液。按“2.1.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定紅景天苷峰面積，以對(duì)照品濃度（C）為橫坐標(biāo)，紅景天苷峰面積（A）為縱坐標(biāo)，得回歸方程A=3 009.2C-13 796，相關(guān)系數(shù)R為0.999 7，表明該濃度范圍內(nèi)紅景天苷線性關(guān)系良好。

2.1.1.5 精密度考察 取線性關(guān)系考察項(xiàng)下的濃度為44.70 mg/L的紅景天苷對(duì)照品溶液，按“2.1.1.1”項(xiàng)下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定紅景天苷峰面積，計(jì)算RSD為0.89%，表明該方法測(cè)定紅景天苷精密度符合要求。

2.1.1.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)? 取紅景天飲片（20160921批）粉末適量，精密稱定，加入60%乙醇30 mL，稱取總重量，加熱回流提取1 h，補(bǔ)足重量后過濾，取續(xù)濾液適量，分別于0 h、2 h、4 h、6 h、10 h、24 h，按“2.1.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定紅景天苷峰面積，計(jì)算RSD為1.93%，表明紅景天苷樣品24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.1.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取紅景天飲片（20160921批）粉末適量，精密稱定，加入60%乙醇30 mL，稱取總重量，加熱回流提取1 h，補(bǔ)足重量后過濾，取續(xù)濾液適量，平行操作6份，按“2.1.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定紅景天苷峰面積，計(jì)算其平均含量，計(jì)算RSD為1.89%，表明該方法測(cè)定紅景天苷重復(fù)性符合要求。

2.1.1.8 回收率實(shí)驗(yàn) 采用加樣回收法，精密吸取“2.1.1.7”項(xiàng)下重復(fù)性實(shí)驗(yàn)樣品1 mL，分別加入濃度為44.70 μg/mL的紅景天苷對(duì)照品溶液1 mL，混合均勻，按“2.1.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定紅景天苷峰面積，計(jì)算其加樣回收率為98.98%，RSD為1.97%。見表1。

2.1.1.9 紅景天苷提取率的計(jì)算 將供試品溶液按“2.1.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定其中紅景天苷峰面積，根據(jù)“2.1.1.4”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算紅景天苷濃度C，按照以下公式計(jì)算其提取率：

2.1.2 DPPH自由基清除率測(cè)定

2.1.2.1 DPPH溶液的配制 精密稱取DPPH 2.59 mg于10 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容，得到濃度為259.00 mg/L的DPPH溶液，0～4 ℃避光保存，當(dāng)天臨用現(xiàn)配。

2.1.2.2 測(cè)定方法 為了消除提取液本身顏色對(duì)測(cè)定的干擾，在測(cè)定中引入了提取液在514 nm波長(zhǎng)下自身的吸收度Aj。

1）Ai：取提取液1 mL，加入250 μL DPPH溶液于同一具塞試管中，搖勻，在黑暗中37 ℃保溫20 min，以甲醇為空白在514 nm測(cè)定其吸光度Ai。

2）A0：取甲醇1 mL，加入250 μL DPPH溶液于同一具塞試管中，搖勻，在黑暗中37 ℃保溫20 min，以甲醇為空白在514 nm測(cè)定其吸光度A0。

3）Aj：取提取液1 mL，加入250 μL的甲醇于同一具塞試管中，搖勻，在黑暗中37 ℃保溫20 min，以甲醇為空白在514 nm測(cè)定其吸光度Aj。

試驗(yàn)重復(fù)3次，根據(jù)下列公式計(jì)算植物提取液對(duì)DPPH的抑制率，求得平均值：

抑制率（%）=（1-（Ai-Aj）/A0）×100%

注：Ai為加提取液后DPPH溶液的吸光度，A0為未加提取液時(shí)DPPH溶液的吸光度，Aj為提取液在測(cè)定波長(zhǎng)的吸光度。

2.1.3 總抗氧化能力的測(cè)定（FRA P 值測(cè)定）

2.1.3.1 測(cè)定方法 按照試劑盒說明書配置工作液進(jìn)行檢測(cè)。

2.1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 稱取27.80 mg試劑盒提供的FeSO4·7H2O，加水溶解并稀釋到10 mL，此時(shí)濃度即為10 mmol/L。取適量10 mmol/L FeSO4溶液15 μL、30 μL、60 μL、90 μL、120 μL、150 μL稀釋至1 mL，得到濃度分別為0.15 mmol/L、0.30 mmol/L、0.60 mmol/L、0.90 mmol/L、1.20 mmol/L和1.50 mmol/L的FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取100 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液點(diǎn)板，采用酶標(biāo)儀于630 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度A為縱坐標(biāo)，F(xiàn)eSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度C為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得A=0.402 2C-0.084 7，相關(guān)系數(shù)R為0.999 5，表明FeSO4濃度在0.15～1.50 mmol/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

注：樣品的抗氧化能力用FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度來表示，即1FRAP單位=1 mmol/L FeSO4。

2.2 單因素優(yōu)化紅景天提取溶劑

文獻(xiàn)中有關(guān)紅景天提取溶劑的選擇不一致，為了綜合多指標(biāo)考察紅景天抗氧化有效物質(zhì)的提取工藝，首先采用單因素方法對(duì)紅景天提取影響較大的因素進(jìn)行考察，確定優(yōu)化范圍，包括乙醇濃度、提取時(shí)間和料液比。取紅景天飲片（批號(hào)：20160921），用銅舂初搗后采用粉碎機(jī)進(jìn)行粗粉，粉末過1號(hào)篩待用。在其他處理?xiàng)l件一致的情況下，分別考察乙醇濃度（0、20%、40%、60%、80%、100%）、料液比（1∶ 5、1∶ 7、1∶ 12）、提取時(shí)間（1 h、2 h、3 h）對(duì)紅景天抗氧化有效物質(zhì)化提取效果的影響。

2.2.1 乙醇濃度的影響 固定料液比為1∶ 7、提取時(shí)間為2 h，考察不同濃度乙醇對(duì)紅景天苷提取率和提取液體外抗氧化活性的影響。見圖1。從中可見表明，隨著乙醇濃度不斷增加，紅景天苷提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，60%乙醇提取率最高;DPPH清除率隨著乙醇濃度升高開始緩慢上升，但當(dāng)濃度增加至60%以后開始下降，80%乙醇時(shí)清除率明顯降低;總抗氧化能力隨著乙醇濃度升高不斷減小。綜合3方面的因素，說明乙醇濃度過高和過低均不利于紅景天中抗氧化有效物質(zhì)的提取，低于40%紅景天苷提取率偏低，超過80%時(shí)3個(gè)指標(biāo)均顯著下降，因此提取溶劑中乙醇濃度的優(yōu)化范圍設(shè)置在40% ～80%之間較為合理。

2.2.2 提取時(shí)間的影響 固定乙醇濃度為60%、料液比為1∶ 7，考察不同提取時(shí)間對(duì)紅景天抗氧化有效物質(zhì)提取效果的影響。見圖2。結(jié)果表明，隨著提取時(shí)間的增加，3個(gè)指標(biāo)都呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。

2.2.3 料液比的影響 固定乙醇濃度為60%、提取時(shí)間為2 h，考察不同料液比對(duì)紅景天抗氧化有效物質(zhì)提取效果的影響。見圖3。隨著料液比的增加，紅景天苷的提取率隨之上升，但是1∶ 7與1∶ 12結(jié)果相差不大，提取液總抗氧化能力先下降后上升，DPPH清除率則呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。由于料液比對(duì)3個(gè)指標(biāo)的影響不一致，出于生產(chǎn)實(shí)際操作的可行性和節(jié)約資源的角度，料液比的優(yōu)化范圍設(shè)置在1∶ 6～1∶ 12范圍內(nèi)。

2.3 星點(diǎn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案 提取工藝優(yōu)化：

影響提取效果的因素主要包括乙醇濃度、提取時(shí)間、提取次數(shù)和料液比，其中由于提取次數(shù)為非連續(xù)變量，回歸處理較困難，為了簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)，將提取次數(shù)暫定為1次。在單因素考察的基礎(chǔ)上，選取乙醇濃度（X1）、提取時(shí)間（X2）、料液比（X3）3個(gè)因素作自變量，以提取液中紅景天苷提取率（%，Y1）、DPPH清除率（%，Y2）和總抗氧化能力（mmol/L，Y3）作因變量，采用響應(yīng)面法優(yōu)化最佳提取工藝，各因素的水平設(shè)計(jì)見表2。取紅景天藥材5 g左右，精密稱定，加入適量提取溶劑，按照表3安排試驗(yàn)，提取液濾過、合并、濃縮后，按照“2.1”項(xiàng)下，測(cè)定紅景天苷提取率（%）、DPPH清除率（%）和總抗氧化能力（mmol/L）。見表3。

2.4 模型擬合和提取工藝優(yōu)化

采用Design-Expert 10.0.3對(duì)紅景天提取工藝實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合。經(jīng)過運(yùn)算后得到紅景天苷提取率（Y1，mg/g）、DPPH清除率（Y2，%）和總抗氧化能力（Y3，mmol/L）對(duì)乙醇濃度（X1）、提取時(shí)間（X2）、料液比（X3）的模型，其擬合回歸模擬方程如下，其回歸模型的方差分析見表4。

Y1=（-430.31+48.76X1+72.55X2+6.25X3-1.05X1X2+0.36X1X3+3.41X2X3-0.44X12-2.94X22-2.04X32）×10-3（R2=0.914 3，RAdj2=0.974 4）

Y2=-20.89+1.74X1+2.26X2+13.15X3+0.02X1X2-0.07X1X3-0.18X2X3-0.01X12-0.11X22-0.43X32（R2=0.898 2，RAdj2=0.955 6）

Y3=（-610+33.64X1+162.47X2+182.23X3+0.25X1X2-0.80X1X3-1.89X2X3-0.35X12-23.45X22-4.96X32）×10-3（R2=0.892 5，RAdj2=0.942 8）

從表4中數(shù)據(jù)可見，X1、X2和二次項(xiàng)X1X2、X12對(duì)紅景天苷提取率（Y1）有極顯著影響（ P <0.01），其他因素的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P >0.05）;X1、X2和二次項(xiàng)X1X3、X12、X32對(duì)DPPH清除率（Y2）有極顯著影響（ P <0.01），X3有顯著影響（ P <0.05），其他因素的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P >0.05）;X1、X3和二次項(xiàng)X12、X22對(duì)總抗氧化能力（Y3）有極顯著影響（ P <0.01），其他因素的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P >0.05）。綜合各因素對(duì)于3個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)紅景天抗氧化有效物質(zhì)提取效果影響最大的因素是乙醇濃度X1，交互因素也會(huì)對(duì)3個(gè)指標(biāo)產(chǎn)生不同的影響。圖4為固定第3因素條件下，其他2項(xiàng)因素對(duì)紅景天苷提取率（Y1）、DPPH清除率（Y2）和總抗氧化能力（Y3）交互效應(yīng)的響應(yīng)面圖。

利用Design-Expert 10.0.3軟件對(duì)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化，以Y1、Y2和Y3均最大化為原則，結(jié)合實(shí)際操作的可行性，得到優(yōu)化的最佳提取工藝條件為：飲片加入11倍量46.60%乙醇，提取4.67 h，收集提取液，濃縮即得。

2.5 提取次數(shù)優(yōu)化及驗(yàn)證試驗(yàn)

采用“2.4”項(xiàng)下得到的最佳提取工藝分別提取1、2、3次，平行操作3份，分別測(cè)定3個(gè)指標(biāo)，考察最佳提取次數(shù)。見表5，并將預(yù)測(cè)值與提取一次的實(shí)測(cè)值比較并計(jì)算偏差，預(yù)測(cè)值紅景天苷提取率為1.10%，DPPH清除率為88.61%，總抗氧化能力為1.40 mmol/L，實(shí)測(cè)值分別為1.12%、89.13%和1.39 mmol/L，RSD分別為3.45%、1.78%和3.60%，預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的偏差較小，說明該工藝穩(wěn)定可行，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

在最佳提取工藝條件下，提取次數(shù)增加紅景天苷提取率呈增高趨勢(shì)，但是提取2次和3次時(shí)無明顯差異，而DPPH清除率和總抗氧化能力在提取3次時(shí)明顯低于2次，綜合3個(gè)指標(biāo)的結(jié)果，確定提取次數(shù)為2次。

3 討論

紅景天作為傳統(tǒng)藏藥，主要以根和莖入藥，以其獨(dú)特的藥理效果在臨床中應(yīng)用良好，常用于治療冠心病、慢性疲勞癥、慢性腎炎等病癥，另由于其具有明確的抗氧化性能，能夠有效的對(duì)抗自由基，降低體內(nèi)自由基對(duì)細(xì)胞的氧化損害，抗脂質(zhì)過氧化，延緩機(jī)體衰老以及預(yù)防阿爾茨海默病等老年病的發(fā)生[13-15]，因此是極具開發(fā)價(jià)值的保健藥材。有關(guān)紅景天苷提取工藝的研究較多，有加熱回流提取[16]、超聲提取[17]、微波提取[18]等，但多數(shù)以提取液中以紅景天苷為代表的單一成分的提取率作為考察指標(biāo)進(jìn)行工藝優(yōu)化，未能體現(xiàn)提取物抗氧化作用的其他有效物質(zhì)的提取效果。結(jié)合生產(chǎn)過程的實(shí)際情況，本研究采用加熱回流提取方法，通過對(duì)紅景天苷提取率和提取物體外抗氧化活性雙重指標(biāo)對(duì)紅景天抗氧化有效物質(zhì)的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

由于體外抗氧化活性判斷的標(biāo)準(zhǔn)紛繁復(fù)雜，基于不同的化學(xué)反應(yīng)原理，其評(píng)價(jià)的方式均有很大的不同。為了研究紅景天提取液抗氧化活性在不同方面的應(yīng)用，本研究選取了提取液DPPH清除率和總抗氧化能力2種不同的體外抗氧化活性評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)提取工藝進(jìn)行評(píng)價(jià)。DPPH在有機(jī)溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，其醇溶液呈深紫色，具有單一電子，故能夠接受一個(gè)電子或是氫離子，在波長(zhǎng)為514 nm下具有最大光吸收。有自由基清除劑存在時(shí)，DPPH的單電子被捕捉而使其顏色變淺，在最大光吸收波長(zhǎng)處的吸光值下降，從而評(píng)價(jià)樣品的抗氧化能力。待測(cè)樣品的抗氧化能力用DPPH清除率來表示，清除率越大，抗氧化性越強(qiáng)[19]。FRAP法測(cè)定總抗氧化能力的原理是酸性條件下抗氧化物可以還原Ferric-tripyridyltriazine（Fe3+-TPTZ）產(chǎn)生藍(lán)色的Fe2+-TPTZ，隨后測(cè)定藍(lán)色的Fe2+-TPTZ吸光度即可獲得樣品的總抗氧化能力。中藥提取液總抗氧化能力的檢測(cè)可以用于檢測(cè)各種溶液的抗氧化能力的強(qiáng)弱，用于篩選強(qiáng)抗氧化能力的藥物[20]。

本研究中采用紅景天苷提取率和2種體外抗氧化指標(biāo)（DPPH清除率和總抗氧化能力）相結(jié)合的綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用響應(yīng)面優(yōu)化方法對(duì)紅景天抗氧化有效物質(zhì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

響應(yīng)曲面法是建立在數(shù)學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)基礎(chǔ)上，采用多元二次回歸方程來考察各因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，能對(duì)優(yōu)選出的實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行全面分析的一種統(tǒng)計(jì)方法，可以在實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行非線性擬合，與傳統(tǒng)的正交試驗(yàn)和均勻設(shè)計(jì)比較，具有操作簡(jiǎn)單、精度高、預(yù)測(cè)性好等優(yōu)點(diǎn)[21-23]。因此本研究中采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)響應(yīng)面法對(duì)紅景天抗氧化有效物質(zhì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了實(shí)測(cè)值與Design-Expert 10.0.3軟件的預(yù)測(cè)值基本相符，說明本工藝對(duì)紅景天抗氧化有效物質(zhì)的提取是穩(wěn)定可行。結(jié)合單因素優(yōu)化提取次數(shù)的結(jié)果，最佳工藝為飲片加入11倍量46.60%乙醇，提取4.67 h，提取2次，收集提取液，濃縮即得。該研究可以為紅景天抗氧化功效產(chǎn)品的開發(fā)提供一定的借鑒意義。

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（2019-04-26收稿 責(zé)任編輯：楊覺雄）