基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究女貞子-淫羊藿藥對(duì)活性成分抗骨質(zhì)疏松的分子機(jī)制

陳楠 宋紅 沙南南 王擁軍,3 張巖,3*

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 2000322.貴州省骨科醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 5500023.教育部筋骨理論與治法重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種常見(jiàn)的骨代謝疾病，其主要特征為骨密度降低和骨微結(jié)構(gòu)破壞[1-2]。據(jù)估計(jì)，全世界約有30%的婦女和12%的男性受到OP的影響，全球每年會(huì)有890萬(wàn)人發(fā)生骨折[3-4]。但是在臨床藥物只能發(fā)揮改善癥狀的作用，并不能有效抑制OP的進(jìn)一步發(fā)展[5]。隨著中醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展，中藥在治療OP方面的多成分、多機(jī)制的優(yōu)勢(shì)也逐漸被發(fā)掘出來(lái)，所以從OP的發(fā)生機(jī)制上尋找中藥中的有效成分，并做出科學(xué)闡述，能夠發(fā)揮傳統(tǒng)中藥在治療OP方面的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

女貞子為木犀科植物女貞的干燥成熟果實(shí)，首次記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有滋補(bǔ)肝腎、養(yǎng)血益陰的作用，用于臨床治療OP也有千年歷史上[6-7]?，F(xiàn)代科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，中藥女貞子化學(xué)成分多達(dá)100多種，其中以多糖、黃酮類等為主[8]。具有多種藥理作用，包括抗OP[9]、抗氧化[10]、抗衰老[11]、抗癌[12]、抗糖尿病[13]等。中藥淫羊藿為小檗科淫羊藿屬植物，最初記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，主要發(fā)揮補(bǔ)足腎陽(yáng)、強(qiáng)健筋骨作用，應(yīng)用廣泛[14]。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿含有260多種有效成分，包括黃酮、多糖、生物堿等[15]。淫羊藿藥理學(xué)作用包括抗OP、抗腫瘤、抗動(dòng)脈粥樣硬化[16]。有研究表明[17-18]，女貞子和淫羊藿的藥對(duì)配伍對(duì)OP有很大的改善和治療作用，所以揭示其分子機(jī)制也有利于女貞子-淫羊藿藥對(duì)基礎(chǔ)和臨床的使用及推廣。

1 資料與方法

1.1 女貞子-淫羊藿中活性成分的篩選

TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄約502味中藥，及對(duì)應(yīng)約12 144個(gè)相關(guān)中藥成分，并對(duì)每個(gè)中藥的化合物按照藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行分類，同時(shí)對(duì)應(yīng)上相關(guān)疾病[19]。本研究通過(guò)檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，分別以女貞子和淫羊藿為關(guān)鍵詞，其中篩選條件設(shè)置為類藥性(DL)≥ 0.18、口服生物吸收利用度(OB)≥30%，將獲取的女貞子和淫羊藿的所有活性成分進(jìn)行查重和整合。

1.2 疾病靶點(diǎn)的獲取

DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)是包含有關(guān)藥物及其機(jī)制的全面分子信息[20](同時(shí)還包括DisGeNET[21]、TTD[22]、OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)[23]、GAD數(shù)據(jù)庫(kù)[24]、PharmGKB數(shù)據(jù)庫(kù)[25]、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)[26])，設(shè)置“osteoporosis”為關(guān)鍵詞在以上7個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，并對(duì)檢索結(jié)果進(jìn)行整理，查重和整合所有靶點(diǎn)即為OP的所有已知靶點(diǎn)。

1.3 中藥活性成分和疾病靶點(diǎn)基因的獲取

使用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)[27]，種族設(shè)置為Human，查詢中藥活性成分和疾病靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，將OP已知相關(guān)靶點(diǎn)使用UniProt查出對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)基因，并繪制維恩圖獲得女貞子-淫羊藿活性成分潛在抗OP的作用靶點(diǎn)基因。

1.4 女貞子與淫羊藿“活性成分-靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)”的構(gòu)建

用軟件Cytoscape3.7.1對(duì)其進(jìn)行構(gòu)造，作網(wǎng)絡(luò)可視化分析圖[28]。將從上述獲得的女貞子與淫羊藿的有效活性成分和靶點(diǎn)基因?qū)胲浖﨏ytoscape3.7.1，篩選出女貞子-淫羊藿有效活性成分及其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)基因，同時(shí)結(jié)合文獻(xiàn)研究，整理和分析其中的相互作用。

1.5 關(guān)鍵靶點(diǎn)生物功能注釋及通路分析

DAVID是一個(gè)信息數(shù)據(jù)庫(kù)，可以對(duì)靶點(diǎn)的功能和通路進(jìn)行KEGG通路分析，通過(guò)信號(hào)通路對(duì)疾病闡述中藥的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[29]。在DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)中依次輸入女貞子、淫羊藿和OP的關(guān)鍵靶點(diǎn)，在通路分析選項(xiàng)設(shè)置KEGG，以P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行信號(hào)通路篩選。

2 結(jié)果

2.1 女貞子-淫羊藿有效活性成分的篩選

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索發(fā)現(xiàn)女貞子化學(xué)成分共有119個(gè)，淫羊藿化學(xué)成分共有130個(gè)，通過(guò)DL≥0.18和OB≥30%進(jìn)一步篩選得到其潛在活性化合物，其中女貞子有13個(gè)，淫羊藿有23個(gè)(表1)，使用Draw Venn Diagram平臺(tái)將中藥活性成分劃分并繪制維恩圖(圖1)。

圖1 女貞子-淫羊藿中潛在活性成分維恩圖Fig.1 Venn diagram of potential active components in Ligustrum lucidum and Epimedium

表1 女貞子-淫羊藿中潛在活性成分DL和OB值及其化學(xué)結(jié)構(gòu)式Table 1 DL and OB values and chemical structure formula of potential active components in Ligustrum lucidum and Epimedium

續(xù)表1 女貞子-淫羊藿中潛在活性成分DL和OB值及其化學(xué)結(jié)構(gòu)式Continued table 1 DL and OB values and chemical structure formula of potential active components in Ligustrum lucidum and Epimedium

2.2 女貞子與淫羊藿活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

將女貞子和淫羊藿的33個(gè)潛在活性成分，及其對(duì)應(yīng)的227個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖2。

圖2 中藥生物活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Network diagram of bioactive components and targets of traditional Chinese medicine注：兩個(gè)八邊形：女貞子、淫羊藿兩味中藥；外圈圓形：潛在活性成分；中間四邊形：潛在活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)基因。

2.3 疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

將OP與其對(duì)應(yīng)的190個(gè)靶點(diǎn)基因進(jìn)行構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖3。

圖3 OP-靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 OP target gene network注：中間圓形：骨質(zhì)疏松；四周為骨質(zhì)疏松治療的潛在靶點(diǎn)基因。

2.4 女貞子-淫羊藿成分抗OP的潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

將女貞子-淫羊藿成分靶點(diǎn)使用UniProt得到對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)基因，查重和整合得到女貞子和淫羊藿活性成分靶點(diǎn)基因各190個(gè)、216個(gè)[30]。繪制維恩圖將藥物與骨質(zhì)疏松癥對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)基因188個(gè)進(jìn)行分析(圖4)，最終獲得共同基因16個(gè)，其中歸屬女貞子的有15個(gè)，分別為T(mén)GFβ1、PGR、AR、ESR1、COL1A1、CA2、PPARG、NOS3、CYP3A4、TNF、STAT1、SELE、RUNX2、THBD、HK2；歸屬于淫羊藿的有15個(gè)，分別為T(mén)GFβ1、PGR、AR、ESR1、COL1A1、ESR2、PPARG、NOS3、CYP3A4、TNF、STAT1、SELE、RUNX2、THBD、HK2；兩者間共同靶點(diǎn)為14個(gè)，分別為T(mén)GFβ1、PGR、AR、ESR1、COL1A1、PPARG、NOS3、CYP3A4、TNF、STAT1、SELE、RUNX2、THBD、HK2。這提示女貞子與淫羊藿在抗OP治療過(guò)程中大多為共同的作用靶點(diǎn)發(fā)揮作用，同時(shí)又有其自己關(guān)鍵作用靶點(diǎn)可單獨(dú)發(fā)揮作用，兩藥可協(xié)同發(fā)揮抗OP作用。

圖4 女貞子-淫羊藿-OP靶點(diǎn)基因維恩圖Fig.4 Venn map of target gene of privet fructus ligustri lucidi-herba epimedii maxim-OP

2.5 藥物-活性成分-關(guān)鍵作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

對(duì)女貞子-淫羊藿以及OP疾病共有靶點(diǎn)基因進(jìn)行橋接，共獲得有效成分18個(gè)，有效靶點(diǎn)基因16個(gè)，見(jiàn)圖5。

圖5 中藥生物關(guān)鍵活性成分-OP靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 Target network diagram of OP, a key bioactive component of traditional Chinese medicine注：上面兩個(gè)八邊形：女貞子、淫羊藿兩味中藥；中間四邊形：有效成分；下面圓形：有效靶點(diǎn)基因。

2.6 女貞子-淫羊藿治療OP機(jī)制通路分析

KEGG通路富集分析女貞子-淫羊藿的14個(gè)潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)基因，發(fā)現(xiàn)共有12條信號(hào)通路發(fā)揮作用(圖6)，其中選擇相關(guān)性最大的前10條通路分別為破骨細(xì)胞分化通路(圖7)、癌癥途徑、癌癥的蛋白多糖通路、結(jié)核病通路、乙型肝炎通路、弓形蟲(chóng)病通路、阿米巴病通路、利什曼病通路、炎癥性腸病通路、瘧疾通路、非洲錐蟲(chóng)病通路、II型糖尿病通路，表明女貞子-淫羊藿藥對(duì)可能通過(guò)這些信號(hào)通路協(xié)調(diào)發(fā)揮抗OP作用。采用OmicShare對(duì)通路進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)女貞子-淫羊藿藥對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)基因富集于多種OP通路上，提示此通路可作為未來(lái)研究女貞子-淫羊藿抗OP的重要方向。

圖6 女貞子-淫羊藿抗OP的信號(hào)通路富集分析Fig.6 Enrichment analysis of anti OP signal pathway of Ligustrum lucidum and Epimedium

圖7 女貞子-淫羊藿抗OP的KEGG信號(hào)通路Fig.7 KEGG signaling pathway of Ligustrum lucidum-Epimedium against OP注：粗框：女貞子和淫羊藿藥對(duì)治療OP的有效靶點(diǎn)。

3 討論

基于中醫(yī)“腎藏精，主骨、生髓”理論，腎虛是OP癥的主要發(fā)病機(jī)制[31]。女貞子、淫羊藿作為兩味常用治療腎虛中藥，其中女貞子以治療腎陰虛為主，淫羊藿以治療腎陽(yáng)虛為主，以“陰陽(yáng)雙補(bǔ)，益精壯骨”的立法將二者配伍用于臨床治療OP已接近50年之久[32]。目前許多臨床研究認(rèn)為女貞子-淫羊藿藥對(duì)在治療糖皮質(zhì)激素所致OP方面療效顯著[33]，同時(shí)女貞子-淫羊藿藥對(duì)在調(diào)節(jié)患者機(jī)體免疫功能和預(yù)防疾病作用明顯[34-35]。

通過(guò)本研究中所有網(wǎng)絡(luò)圖顯示，山奈酚(kaempferol)及槲皮素(quercetin)為女貞子和淫羊藿共有活性成分，除此之外還有淫羊藿苷(icariin)、去水淫羊藿黃素(anhydroicaritin)和木犀草素(luteolin)均為網(wǎng)絡(luò)中的重要節(jié)點(diǎn)，說(shuō)明這些潛在有效化合物在女貞子-淫羊藿藥對(duì)抗OP治療中發(fā)揮著重要作用，這與目前的基礎(chǔ)和臨床的相關(guān)研究結(jié)果基本保持一致，同時(shí)也提高了本研究中對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果的可信度。研究表明山奈酚可以顯著抑制去卵巢(OVX)大鼠骨吸收，改善骨小梁微結(jié)構(gòu)[36]，而且山奈酚可以減緩OVX模型后引起的體重增加，并且不會(huì)引起子宮內(nèi)膜肥大[37]。共有活性成分槲皮素可以使糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的OP癥大鼠的股骨骨小梁密度和皮質(zhì)骨骨厚度增加[38]。也有文獻(xiàn)指出[39]，當(dāng)給藥TNF-α刺激骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)BMSCs的核因子κB(NF-κB)的激活和β-連環(huán)蛋白的降解，而此時(shí)可以通過(guò)槲皮素抑制這個(gè)過(guò)程，并促進(jìn)BMSCs增殖和其向成骨分化，增加成骨細(xì)胞。維生素D受體(VDR)的激活被認(rèn)為是治療OP的潛在藥物靶標(biāo)，有研究報(bào)道槲皮素可以激活VDR與配體結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。此外，該研究還證實(shí)槲皮素提高了Caco-2細(xì)胞中VDR靶基因TRPV6 mRNA表達(dá)水平。以上結(jié)果表明，槲皮素可作為VDR的激動(dòng)劑起到抗OP作用[40]。

本研究通過(guò)藥物有效活性成分及其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)的對(duì)應(yīng)匹配構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)圖，最終獲取得到女貞子-淫羊藿藥對(duì)在治療OP方面的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因共16個(gè)，其中女貞子15個(gè)，淫羊藿15個(gè)，兩者共有的靶點(diǎn)有14個(gè)，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)有效的治療靶點(diǎn)蛋白有TNF、PPARG、STAT1、TGFB1，而這4個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)在抗骨質(zhì)疏松的信號(hào)通路中均占有重要地位，可作為女貞子-淫羊藿藥對(duì)抗OP的重要靶點(diǎn)蛋白。在KEGG 信號(hào)通路富集分析的結(jié)構(gòu)中也顯示，這4個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)富集的通路主要為破骨細(xì)胞分化通路等，結(jié)合目前基礎(chǔ)和臨床的研究中，女貞子-淫羊藿的配伍發(fā)揮抗OP機(jī)制及所對(duì)應(yīng)的通路中都有所體現(xiàn)。KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果也表明女貞子-淫羊藿藥對(duì)的多種活性成分對(duì)應(yīng)的關(guān)鍵靶點(diǎn)作用于多種有效通路，正符合中醫(yī)藥獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，不同成分、靶點(diǎn)和通路之間的相互協(xié)調(diào)共同發(fā)揮治療OP的作用，初步證明女貞子和淫羊藿配伍治療OP的科學(xué)性，為進(jìn)一步深入探討其作用機(jī)制以及研發(fā)防治骨質(zhì)疏松新藥提供了新方向。