葡萄籽提取物對破骨細胞分化的影響

許妍妮，趙俐婷，賀芳，張燕

作者單位：1西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，陜西 西安710061；2陜西地礦醫(yī)院，陜西 西安710014

葡萄籽提取物（grape seed extract，GSE）是從葡萄籽中提取分離得到的一類多酚類純天然物質(zhì)，主要由原花青素、兒茶素、表兒茶素、沒食子酸等多酚類物質(zhì)組成［1］。GSE是一種抗氧化劑，具有很強的體內(nèi)活性，是迄今發(fā)現(xiàn)的植物來源最高效的抗氧化劑之一［2］。GSE是一種天然成分，具有保護心肌、抗氧化、消炎、清除自由基、抗癌作用，具有極高的營養(yǎng)價值和藥用功能。?zden等［3］研究發(fā)現(xiàn)，GSE可有效減少牙周疾病的炎性反應(yīng)；Toker等［4］研究發(fā)現(xiàn)，GSE可通過減少MMP-8和HIF-1α水平降低大鼠牙槽骨損失和牙周疾病炎性反應(yīng)，同時可提高成骨細胞活性；Park等［5］研究發(fā)現(xiàn)，GSE可有效減少膠原誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎模型的炎性反應(yīng)和骨吸收。但GSE是否影響破骨細胞形成未見報道。

破骨細胞來源于髓細胞和多功能造血干細胞分化而來的單核巨噬細胞，在巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，M-CSF）和核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor kBligand，RANKL）的雙重刺激下，單核巨噬細胞不斷融合，最終分化成為具有骨吸收功能的破骨細胞［6］?；罨疶-細胞核因子1（nuclear factor of activated Tcells，cytoplasmic 1，NFATc1）是破骨細胞分化過程中最為關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，在NFATc1的作用下，破骨細胞轉(zhuǎn)錄表達抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistantacid phosphatase，TRAP）和組織蛋白酶K（cathepsin K）等功能分子發(fā)揮特定功能［7］。本研究自2108年1月至2019年1月檢測葡萄籽提取物對破骨細胞分化的影響，以期為臨床上治療骨質(zhì)疏松等疾病提供新思路。

1 材料與方法

1.1細胞RAW264.7細胞系（RAW 264.7小鼠單核巨噬細胞白血病細胞）用含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5%二氧化碳，每3天傳代1次。

1.2試劑GSE購自于美國GNC公司；巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）和核因子κB受體活化因子配體（RANKL）購自美國Peprotech公司。

1.3細胞誘導(dǎo)分化用破骨細胞誘導(dǎo)液（含有30 ng∕mL M-CSF、100 ng∕mL RANKL 的 10%FBS α-MEM完全培養(yǎng)基）進行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，每2天換液一次，5 d后待細胞出現(xiàn)明顯的破骨細胞形態(tài)特征（多核、巨大），即誘導(dǎo)分化成功。

1.4實時定量基因擴增熒光檢測系統(tǒng)（qPCR）檢測破骨細胞標志分子的表達提取總RNA，提取細胞總RNA，取1μg進行反轉(zhuǎn)錄，cDNA稀釋10倍后使用TaKaRa實時熒光定量試劑盒，進行qPCR，反應(yīng)體系為：2×mix 10 μL、正∕反向游引物（10 μmol∕L）0.5 μL、cDNA模板5μL，補H2O至20μL。反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火10 s，72℃延伸20 s，40個循環(huán)。使用GAPDH基因為內(nèi)參，2-△△CT法進行數(shù)據(jù)分析。檢測破骨分化標志分子Itgb3、Acp5、Ctsk的mRNA水平。

1.5 TRAP染色根據(jù)TRAP染色試劑盒（Sigma）說明書進行染色。等量混合亞硝酸鈉溶液和堅牢石榴紅GBC鹽溶液，依次加入萘酚AS-BI磷酸溶液、醋酸鹽溶液、酒石酸鹽溶液，充分混合，配制成染色液。4%多聚甲醛固定細胞30 min，加入適量染色液，37℃染色40 min。在光學(xué)顯微鏡下觀察，將有3個或3個以上核的TRAP陽性細胞認定為破骨細胞，并在每個孔的不同區(qū)域隨機選擇視野進行計數(shù)。

1.6 c-TX水平檢測在骨片上誘導(dǎo)破骨細胞，6 d后收集細胞培養(yǎng)上清，利用酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）試劑盒檢測c-TX水平。具體步驟是：將標準品工作液和細胞培養(yǎng)上清加入到酶標板中，2個復(fù)孔，每孔100μL。37℃孵育90 min。棄去液體，甩干，立即加入生物素化抗體工作液100μL，混勻后37℃孵育1 h。甩盡孔內(nèi)液體，每孔加洗滌液300μL，浸泡2 min后在厚吸水紙上拍干。重復(fù)此洗板步驟3次。每孔加酶結(jié)合物工作液100μL，混勻后37℃孵育30 min。洗板5次。加底物溶液100μL，混勻后37℃避光孵育20 min。加終止液50μL終止反應(yīng)，立即用酶標儀在450 nm波長測量各孔的光密度（OD值）。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法使用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)均為3次生物學(xué)重復(fù)。數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett’st檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1葡萄籽提取物抑制破骨細胞標志分子表達RAW264.7細胞分為兩組，分別為對照組（無葡萄籽提取物）、GSE組（細胞培養(yǎng)液中添加終濃度100μg∕mL的葡萄籽提取物）。對兩組RAW264.7細胞用含30 ng∕mLM-CSF、100 ng∕mLRANKL的10%FBS α-MEM培養(yǎng)基進行誘導(dǎo)分化，每2天換液一次，5 d后收集細胞，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，qPCR檢測破骨細胞分化標志分子Itgb3、Acp5、Dcst、Ctsk的mRNA水平。結(jié)果如圖1所示，細胞克隆經(jīng)誘導(dǎo)分化后，與對照組相比，GSE組細胞的破骨標志分子Itgb3 mRNA相對表達量由（216.59±34.61）下降至（104.55±9.54）（n＝3，P＝0.0355）；Acp5由（103.37±14.77）下降至（78.96±13.15）（n＝3，P＝0.0351）；Dcst由（304.85±14.77）下降至（65.03±11.75）（n＝3，P＝0.0003）；Ctsk由（290.23±41.65）下降至（132.23±14.06）（n＝3，P＝0.022 9）。以上分化標志分子mRNA水平均顯著降低，提示葡萄籽提取物抑制破骨細胞分化。

2.2葡萄籽提取物抑制破骨細胞形成對照組、GSE組RAW264.7細胞用含30 ng∕mL M-CSF、100 ng∕mL RANKL的10%FBSα-MEM培養(yǎng)基進行誘導(dǎo)分化5 d，固定后進行TRAP染色。結(jié)果如圖2所示，與對照組細胞相比，GSE組細胞形成的TRAP陽性細胞數(shù)目顯著減少，提示葡萄籽提取物抑制破骨細胞形成。

圖1 實時定量基因擴增熒光檢測破骨細胞標志分子表達：A為Itgb3，B為Acp5，C為Dcst，D為Ctsk

為了進一步炎癥葡萄籽提取物對破骨細胞形成的抑制作用，我們同時收集了細胞培養(yǎng)上清液，進行了TRAP活性檢測。結(jié)果如圖3所示，GSE組細胞培養(yǎng)上清TRAP活性由（2.52±0.39）下降至（0.91±0.10）（n＝3，P＝0.0165），再次證實了葡萄籽提取物對破骨細胞形成的抑制作用。

2.3葡萄籽提取物抑制破骨細胞功能對照組、GSE組RAW264.7細胞培養(yǎng)于骨片上，用含30 ng∕mL M-CSF、100 ng∕mL RANKL的10%FBS α-MEM培養(yǎng)基進行誘導(dǎo)分化6 d，收集細胞培養(yǎng)上清，進行了c-TX檢測。結(jié)果如圖4所示，與對照組細胞相比，GSE組細胞分泌的c-TX量由（1.01±0.11）nmol∕L下降至（0.49±0.06）nmol∕L（n＝3，P＝0.0028），提示葡萄籽提取物抑制破骨細胞活性。

圖3 TRAP活性檢測破骨細胞形成

3 討論

骨質(zhì)疏松是絕經(jīng)后婦女常見的一種退行性骨骼疾病，其病理特征為骨量減少、骨折概率增加［8］。流行病學(xué)調(diào)查顯示，約60%的60歲以上老人患有不同程度的骨質(zhì)疏松。在骨質(zhì)疏松導(dǎo)致的骨折中，髖、脊椎骨折最為常見［8］。髖部骨折后一年內(nèi)由于各種并發(fā)癥導(dǎo)致的死亡率高達20%，存活者中約40%因長期臥床導(dǎo)致關(guān)節(jié)固定僵直、功能喪失，生命質(zhì)量明顯下降［8］。骨質(zhì)疏松程度相對較輕的病人往往也要常年忍受四肢及腰背部疼痛、反復(fù)骨折等痛苦。目前臨床上使用的治療骨質(zhì)疏松藥物主要從抗破骨方面來發(fā)揮作用，如雙膦酸鹽、降鈣素等，但其副作用較大，不能長期使用。因此，開發(fā)安全的天然活性物質(zhì)是目前研究的熱點。

GSE是從葡萄籽里提取到的多酚類天然產(chǎn)物，富含黃酮類化合物，主要包括黃烷-3-醇結(jié)構(gòu)的兒茶素、表兒茶素和表兒茶素沒食子酸酯，以及由黃烷-3-醇通過碳-碳鍵結(jié)合聚合而成的原花青素［1］。葡萄籽提取物具有超強的抗氧化能力，能夠有效清除氧自由基，具備抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、調(diào)節(jié)血壓等重要功能［2，9-11］，能夠預(yù)防和治療70余種疾病，臨床應(yīng)用廣泛。葡萄籽提取物具有較高的食用安全性，無急性毒性和慢性長期毒性作用，日益被各國廣泛用作營養(yǎng)補充劑來使用。目前關(guān)于葡萄籽的生物活性作用報道較多，但對破骨細胞影響的研究未見報道，本研究擬探討其對破骨細胞分化、形成、功能的影響。

在本研究中，我們用100μg∕mL的葡萄籽提取物處理RAW264.7細胞，并對其用含30 ng∕mL M-CSF、100 ng∕mLRANKL的10%FBSα-MEM培養(yǎng)基進行誘導(dǎo)分化，收集細胞及培養(yǎng)上清，利用qPCR檢測破骨細胞分化標志分子的表達，利用TRAP染色及TRAP活性定量實驗檢測破骨細胞的形成情況，利用c-TX定量實驗檢測破骨細胞的骨吸收活性。研究結(jié)果顯示，經(jīng)葡萄籽提取物處理后，破骨標志分子Itgb3、Acp5、Dcst、Ctsk mRNA水平均顯著降低，TRAP陽性細胞數(shù)目減少，TRAP活性顯著降低，c-TX分泌顯著減少，表明葡萄籽提取物有效抑制破骨細胞分化形成及活性。我們下一步工作將驗證葡萄籽提取物在體內(nèi)的作用。若內(nèi)外研究結(jié)果在體內(nèi)得到了驗證，將會有力地證明GSE可以作為有效的營養(yǎng)補充劑用于骨質(zhì)疏松的預(yù)防和治療，將豐富目前對于GSE功能的認識。

圖2 TRAP染色檢測破骨細胞形成（TRAP染色×400）：A為對照組，B為GSE處理組，