腦膠質(zhì)瘤患者組織中同源框基因10及小泛素相關(guān)修飾蛋白的表達及臨床意義

李曉波，夏 鷹，聶 柳，金 虎

?？谑腥嗣襻t(yī)院 神經(jīng)外科 (?？?570208)

目前，腦膠質(zhì)瘤的臨床治療主要包括手術(shù)、放療、化療、靶向治療等方法[1-4]。同源框基因(homeobox gene，HOX)在結(jié)腸癌、膠質(zhì)細胞瘤、骨肉瘤等惡性腫瘤組織中表達異常。結(jié)直腸癌細胞中HOXDl0基因表達上調(diào)，可抑制癌細胞活力，誘導(dǎo)癌細胞凋亡[5]。研究[6]表明，蛋白的小泛素樣相關(guān)修飾蛋白(small ubiquitin-like modifier,SUMO)化與去SUMO化為體內(nèi)一種動態(tài)可逆的過程，SUMO化可能促進膠質(zhì)瘤發(fā)生。小泛素相關(guān)修飾物特異性蛋白酶6(small ubiquitin related modifier-specific proteases 6，SENP6)通過特異性降解小泛素相關(guān)修飾物分子，參與機體惡性腫瘤疾病進程[7]。目前，關(guān)于腦膠質(zhì)瘤中HOXD10及SENP6蛋白表達情況及機制的研究較少。因此，本研究期望通過檢測腦膠質(zhì)瘤患者腦組織中上述兩種蛋白表達水平，分析其與患者臨床病理參數(shù)及生存率的關(guān)系，為該疾病的臨床診斷及治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2012年2月至2015年2月經(jīng)?？谑腥嗣襻t(yī)院確診并行手術(shù)治療的腦膠質(zhì)瘤患者40例為研究對象，設(shè)為試驗組，其中男26例，女14例，年齡48～65(54.2±8.1)歲；臨床分期：依照WHO關(guān)于腦膠質(zhì)瘤的分類及分級標(biāo)準(zhǔn)[8]，Ⅰ期6例、Ⅱ期18例、Ⅲ期9例、Ⅳ期7例。納入標(biāo)準(zhǔn)：1)符合腦膠質(zhì)瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]并經(jīng)過術(shù)后病理檢查證實者；2)臨床資料完整者；3)原發(fā)性腦膠質(zhì)瘤者；4)初次治療者，即術(shù)前未行生物治療、化療、放療等。排除標(biāo)準(zhǔn)：1)合并心、肝、血液系統(tǒng)嚴(yán)重疾病者；2)臨床資料缺失者；3)合并全身性感染疾病或神經(jīng)系統(tǒng)病變者；4)合并其他惡性腫瘤者。選取同期本院顱腦損傷需行顱內(nèi)減壓手術(shù)治療患者40例為對照組，男22例，女18例，年齡43～62(52.8±7.9)歲。入選本研究的患者均簽署知情同意書，試驗組患者均符合腦膠質(zhì)瘤的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)。本次臨床研究已獲得倫理委員會批準(zhǔn)。入院時兩組基本資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 方法

利用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)(Western blot)檢測兩組患者組織中HOXD10、SENP6蛋白表達情況。步驟：兩組患者腦組織于冰上破碎后，利用放射免疫沉淀分析(radio immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液裂解，冰浴15 min，離心15 min(離心速度4 000 r/min，離心半徑10 cm)，取上清液，上樣于10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)分離蛋白，轉(zhuǎn)膜后封閉1.5 h，分別加入鼠抗人一抗(HOXD10、SENP6及GAPDH)(購自上海安研商貿(mào)有限公司)，4 ℃孵育過夜。次日加入兔抗鼠二抗室溫孵育1.5 h，膠片曝光照相。采用Image-Pro Plus圖像分析管理系統(tǒng)分析，以特異性條帶平均吸光度(A)值與面積的乘積為有效值，代表蛋白相對表達量。以GAPDH為內(nèi)標(biāo)參照物。

1.3 蛋白表達水平與病理特征關(guān)系分析

分析HOXD10、SENP6蛋白陽性表達與腦膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征的關(guān)系，包括患者的年齡、性別、腫瘤大小、臨床分期、分化程度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組HOXD10、SENP6蛋白表達比較

試驗組HOXD10蛋白相對表達量為(0.39±0.05)，明顯低于對照組(1.07±0.12)；試驗組SENP6蛋白相對表達量為(1.25±0.13)，明顯高于對照組(0.26±0.04)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表1、圖1)。

表1 兩組HOXD10、SENP6蛋白表達比較

2.2 兩種蛋白與臨床病理特征關(guān)系分析

本研究以HOXD10、SENP6蛋白相對表達量的均值為標(biāo)準(zhǔn)，高于均值即為高表達，低于均值即為低表達。結(jié)果顯示，腫瘤大小≥3.0 cm、臨床分期為Ⅲ期、Ⅳ期和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腦膠質(zhì)瘤患者組織中HOXD10蛋白高表達率低于腫瘤大小<3.0 cm、臨床分期為I期、Ⅱ期和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腦膠質(zhì)瘤患者，而腫瘤大小≥3.0 cm、臨床分期為Ⅲ期、Ⅳ期和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腦膠質(zhì)瘤患者組織中SENP6蛋白高表達率高于腫瘤大小<3.0 cm、臨床分期為I期、Ⅱ期和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腦膠質(zhì)瘤患者(表2)。

表2 兩種蛋白水平與臨床病理特征關(guān)系[n(%)]

2.3 患者生存率分析比較

隨訪36個月，HOXD10高表達組患者生存率為61.11%，HOXD10低表達組患者生存率為27.27%，與HOXD10高表達組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(2=4.245，P=0.039)；SENP6高表達組患者生存率為23.81%，SENP6低表達組患者生存率為57.90%。與SEMP6高表達組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(2=5.174，P=0.023)(圖2～3)。

3 討論

腦膠質(zhì)瘤的致癌因素主要為先天遺傳高危因素和環(huán)境因素。腦膠質(zhì)瘤具有發(fā)病率高、復(fù)發(fā)率高及患者預(yù)后差等特點，給臨床治療帶來了極大的挑戰(zhàn)[10-11]。既往研究[12]表明，腦膠質(zhì)瘤占中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤的81%。本研究觀察了HOXD10、SENP6蛋白在兩組患者組織中的表達水平，結(jié)果顯示，試驗組患者腫瘤組織中HOXD10蛋白相對表達量明顯低于對照組；SENP6蛋白相對表達量明顯高于對照組患者(P<0.05)。結(jié)果表明，HOXD10蛋白在腦膠質(zhì)瘤患者組織中低表達，而SENP6蛋白呈高表達，初步推斷兩者表達水平與腦膠質(zhì)瘤疾病的發(fā)生有密切關(guān)系。

本研究進一步分析了兩種蛋白表達水平與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，HOXD10、SENP6蛋白表達與腫瘤大小、臨床分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)，結(jié)果表明腫瘤大小≥3.0 cm、臨床分期為Ⅲ期、Ⅳ期和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腦膠質(zhì)瘤患者組織中HOXD10蛋白高表達率低于腫瘤大小<3.0 cm、臨床分期為I期、Ⅱ期和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腦膠質(zhì)瘤患者，而腫瘤大小≥3.0 cm、臨床分期為Ⅲ期、Ⅳ期和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腦膠質(zhì)瘤患者組織中SENP6蛋白高表達率高于腫瘤大小<3.0 cm、臨床分期為I期、Ⅱ期和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腦膠質(zhì)瘤患者。已有研究[13]顯示，HOXD10蛋白的陽性表達水平與膠質(zhì)瘤細胞的增殖、侵襲及遷移等過程均密切相關(guān)。HOXD10在腫瘤細胞中發(fā)揮抑癌基因作用，且其可以通過下調(diào)Ras同源家族基因C(ras homolog gene family member C，RhoC)的表達，抑制RhoC蛋白在組織中的表達水平，進而降低膠質(zhì)瘤細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移能力[14]。SENPs蛋白的表達水平與乳腺癌、膀胱癌、肝癌、前列腺癌等多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，可通過提高核因子κB(NF-κB)活化水平，激活NF-κB通路，加速正常細胞凋亡[6]。研究[7]表明，SENP6蛋白可特異性降解蛋白小泛素相關(guān)修飾物分子，提高泛素化降解水平，增加外界刺激對NF-κB信號通路的激活作用，導(dǎo)致NF-κB通路被激活，使正常細胞受到損傷。因此推斷，HOXD10、SENP6蛋白表達水平與腦膠質(zhì)瘤患者臨床病理的關(guān)系可能與上述機制有關(guān)。

已有研究[15]表明，HOXD10低表達可作為原發(fā)性肝細胞癌治療和生存率預(yù)測的參考指標(biāo)。生存分析結(jié)果顯示，HOXD10高表達組患者3年生存率明顯高于HOXD10低表達組；SENP6高表達組患者3年生存率明顯低于SENP6低表達組(P<0.05)。HOXD10蛋白及SENP6蛋白均為腦膠質(zhì)瘤患者的生存率預(yù)測因子，檢測上述蛋白有助于對腦膠質(zhì)瘤病情的判斷及生存率評估。

綜上所述， HOXD10蛋白在腦膠質(zhì)瘤患者組織中低表達，SENP6蛋白呈高表達；其陽性表達水平與腫瘤大小、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。HOXD10、SENP6蛋白表達程度與腦膠質(zhì)瘤疾病患者生存率有密切的關(guān)系，在腦膠質(zhì)瘤疾病進程中有重要作用，可作為該疾病臨床診斷的重要標(biāo)志物。此外，兩種蛋白之間是否存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，有待進一步研究。