肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1調(diào)控喉癌細胞的增殖和侵襲*

陽志慧，王少新，晉 舒，劉 勇，宋 鑫，魯云杰

1.四川省資陽市第一人民醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科(資陽 641300)；2.四川省腫瘤醫(yī)院 頭頸外科 (成都 610041)

隨著經(jīng)濟發(fā)展、生活水平提高和隨之而來的環(huán)境污染，癌癥患病率越來越高，也越發(fā)引起了人們的關(guān)注和重視。喉癌(laryngeal cancer,LC)是耳鼻喉科中的主要惡性腫瘤疾病之一，由于吸煙、喝酒易發(fā)LC，所以易患于男性群體[1]。LC細胞作為一種具有強大自我更新能力的細胞，擁有高度遷移、浸潤和轉(zhuǎn)移能力[2]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, LncRNA)是一類存在于真核細胞由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的沒有蛋白編碼能力的競爭性內(nèi)源RNA(competitive endogenous RNA, ceRNA)，可靶向調(diào)控微小RNA (microRNA, miR)和蛋白編碼基因的表達[3]。

肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(metastasis associated adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)位于染色體11q13位點上，是一種在細胞代謝過程中廣泛表達的LncRNA。MALAT1能夠誘導(dǎo)癌細胞增殖[4]，高度參與RNA加工、基因轉(zhuǎn)錄、核糖體蛋白、蛋白質(zhì)降解和代謝調(diào)節(jié)[5]。MALAT1在很多癌癥中高表達，敲除MALAT1，能夠抑制結(jié)腸直腸癌[6]、喉鱗癌[7]、非小細胞肺癌[8]等癌細胞的增殖，但在LC中未曾提及。本課題擬對MALAT1對LC細胞增殖和侵襲的作用以及潛在的分子機制進行研究，旨在為LC的治療提供理論依據(jù)和研究意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人二倍體細胞系(WI-38)和喉癌細胞系(TU212、Hep2和AMC-HN-8)購自深圳市豪地華拓生物科技有限公司。

1.1.2 試劑 Trizol Invitrogen(上海源葉生物科技有限公司，S30876-100 mL)；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(Gibco，DXT-10099141)；達爾貝科極限必需培養(yǎng)液(Dulbecco minimum essential medium，DMEM)(武漢塞默飛生命科技有限公司，PM150210)；lipofectAMINE 2000 REAGENT(Invitrogen，11668019)；LncRNA-MALAT1、短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，sh-RNA)、sh-MALAT1及其陰性對照(sh-MALAT1 negative control，sh-MALAT1-NC)、miR-503-5p模擬物(miR-503-5p mimic)、miR-503-5p抑制劑(miR-503-5p inhibitor)及陰性對照序列(廣州銳博生物科技有限公司)；Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega，E1910)；實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)/TaqMan One Step qRT-PCR Kit(Solarbio，T2210)；細胞計數(shù)試劑盒8(cell counting kit 8，CCK8)(江萊生物，48T/96T)；侵襲小室(Transwell)(Corning，F(xiàn)K-Ik019)。

1.1.3 儀器 凈化工作臺(Boxun，SW-CJ-2FD)；生物顯微鏡(Olympus，BX43)；恒溫培養(yǎng)箱(Daihan，WIG-105)；倒置熒光顯微鏡(Nikon，Ti2系列)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 在無菌超凈臺中，將WI-38、TU212、Hep2和AMC-HN-8細胞接種在含10% FBS和DMEM(高糖)的培養(yǎng)皿，37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，48～72 h后換液，進行細胞傳代，取對數(shù)期生長旺盛的細胞進行后續(xù)實驗研究。轉(zhuǎn)染時，6孔板中細胞密度融合到70%～80%時效果最佳。根據(jù)lipofectAMINE 2000 REAGENT(Invitrogen)說明書，sh-MALAT1與miR-503-5p inhibitor單獨或聯(lián)合轉(zhuǎn)染Hep2細胞。

1.2.2 qRT-PCR檢測基因表達 轉(zhuǎn)染后24 h內(nèi)收集細胞，并加入Trizol試劑提取人二倍體細胞系和LC細胞系中的總RNA。按照TaqMan One Step qRT-PCR Kit說明書，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進行qRT-PCR。利用Primer Premier 6.0，根據(jù)每個基因序列設(shè)計引物，分別為：MALAT1 (正向引物5′- GAATTGCGTCATTTAAGCCTA GTT -3′，反向引物5′- GTTTCATCCTACCACTC CCAATTAAT-3′)；miR-503-5p (正向引物5′-GA AGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，反向引物5′-GAA GATGGTGATGGGATTTC-3′)；叉頭盒蛋白K1(forkhead box K1，F(xiàn)OXK1) (正向引物5′ -GCCTC CTTGACAATACCGCT-3′，反向引物 5′ -TTCCA AACCCTCCCTCTGGT-3′)。根據(jù)熒光定量，計算所有樣品和標準品的循環(huán)數(shù)(cycle threshold, CT)?；谠摌藴实腃T值，繪制標準曲線，然后使用2-ΔΔCT方法進行定量計算。

1.2.3 確定MALAT1、miRNA和mRNA的靶向關(guān)系 使用生物信息學(xué)軟件StarBase和TargetScan對MALAT1、miR-503-5p和FOXK1靶向關(guān)系分別進行預(yù)測和分析。用Dual-Luciferase Reporter Assay System進一步驗證靶向關(guān)系。用PCR擴增含有miR-503-5p結(jié)合位點的MALAT1基因的3′-UTR序列，將MALAT1的3′-UTR克隆到pMIR-REPORT熒光素酶載體pMIR-MALAT1-wild type中。通過PCR擴增MALAT1 5′-GAATTGCGTC ATTTAAAGCCTAGTT-3′的3′-UTR結(jié)合位點的突變，并克隆到pMIR-MALAT1-mutant質(zhì)粒中。根據(jù)lipofectAMINE 2000 REAGENT(Invitrogen)說明書，將miR模擬物(miR mimic)和熒光素酶質(zhì)粒pMIR-MALAT1(野生型/突變型，WT/MUT)轉(zhuǎn)染到Hep2細胞中。轉(zhuǎn)染48 h后，棄去舊培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)清洗細胞2次。隨后，在每孔細胞中加入100 μL裂解緩沖液(passive lysis buffer, PLB)，室溫下輕輕震蕩15 min，收集細胞裂解液。取20 μL PLB加入發(fā)光板中，用GloMax生物發(fā)光檢測儀讀取背景值2 s，每個樣品加入100 μL熒光素酶分析試劑Ⅱ(luciferase assay reagent Ⅱ，LAR Ⅱ)工作液，快速混勻，讀值2 s。讀值完畢后，每個樣品再加入100 μL Stop&GloTM試劑，快速混勻后，放入發(fā)光板中檢測，讀值2 s。以上實驗，每個樣品重復(fù)3次，記錄和保存所有結(jié)果及數(shù)據(jù)，熒光顯微鏡不可在30 min內(nèi)連續(xù)開啟關(guān)閉。

1.2.4 CCK8法檢測LC細胞增殖情況 將對照組、sh-MALAT1組、miR-503-5p inhibitor組和聯(lián)合轉(zhuǎn)染(sh-MALAT1+miR-503-5p inhibitor)組細胞分別接種于96孔板(1×105個/孔)，每組設(shè)置6個重復(fù)孔。37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育，每孔加入10 μL CCK8(0.5 g/L)溶液培養(yǎng)4 h，完成培養(yǎng)。在0、1、2、3、4 d分別于酶標儀上測定波長在450 nm處各孔細胞的光密度(optical density, OD)值。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡技術(shù)(Western blot)檢測相關(guān)蛋白表達情況 將細胞中加入放射免疫沉淀(radioimmuneprecipitation,RIPA) PLB，放置于冰上15～30 min使細胞溶解，然后用超聲裂解法5 s，4次，使細胞裂解，最后4 ℃，離心半徑10 cm，離心速度3 000 r/min， 離心15 min。結(jié)束后，將上清液移入新EP管。提取的蛋白采用雙肌球蛋白酸(bicinchoninic acid,BCA)法定量，儲存于-20 ℃冰箱。分離蛋白用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分離至聚偏氟乙烯(polyvinylidene difluoride, PVDF)膜上，半干轉(zhuǎn)錄，100 mA，1.5 h，用5%脫脂奶粉封膜2 h。將稀釋的增殖抗原Ki67 (1∶1 000)、增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)(1∶1 000)、FOXK1 (1∶1 000)、β-肌動蛋白(β-actin)(1∶1 000)單抗在膜上孵育，4 ℃過夜。用PBST(PBS中加入Tween-20)洗滌后，加入相應(yīng)二抗，孵育30 min，再次用PBST洗滌。采用化學(xué)發(fā)光法和X線照射成像法觀察結(jié)果。最后用Protein圖像處理軟件和Quantity one軟件分別掃描X-膠片和條帶密度測量值。蛋白表達水平相對于β-actin表示。本實驗重復(fù)3次。

1.2.6 Transwell染色檢測LC細胞侵襲情況 根據(jù)試劑盒說明書，用200 μL無血清DMEM換液，24 h后，在Transwell的底部、膜上，按1∶5比例涂抹50 mg/L的基質(zhì)凝膠稀釋液，4 ℃風干。100 μL腫瘤細胞懸液中加入500 μL的含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基和200 μL無血清DMEM，將混合液注入Transwell的內(nèi)外，每組實驗在24孔板中重復(fù)3次，對照組在無基質(zhì)的Transwell中培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后，用PBS沖洗Transwell，移去膜上的細胞，用4%甲醇固定。最后用Giemsa染色，自然風干后觀察微孔膜下層的細胞。本實驗重復(fù)3次。

1.2.7 克隆形成實驗檢測LC細胞增殖情況 取對數(shù)生長期的細胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細胞，把細胞懸浮在10% FBS的DMEM培養(yǎng)液中備用。將適當密度的細胞接種于培養(yǎng)皿中并輕輕轉(zhuǎn)動，使細胞分散均勻。置37 ℃、5% CO2、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)2～3 d，棄去上清液，用PBS小心清洗2次。將1 mL 4%甲醇固定15 min，然后去固定液，加適量Giemsa染色液染色15 min，最后用純水緩慢洗去Giemsa染色液，自然風干，用生物顯微鏡觀察、拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 人二倍體、LC細胞系中MALAT1和miR-503-5p表達水平

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，人二倍體細胞系(WI-38) MALAT1表達水平為(1.00±0.13)，LC細胞系(TU212、Hep2和AMC-HN-8) MALAT1表達水平分別為(2.44±0.32)、(3.61±0.24)和(2.80±0.18)，LC細胞系中MALAT1的表達水平高于人二倍體細胞系(P<0.05)；人二倍體細胞系(WI-38) miR-503-5p表達水平為(1.00±0.12)，LC細胞系(TU212、Hep2和AMC-HN-8) miR-503-5p表達水平分別為(0.62±0.08)、(0.37±0.10)和(0.50±0.11)，LC細胞中miR-503-5p的表達低于WI-38(P<0.05)。結(jié)果表明，在LC細胞中，MALAT1高表達，miR-503-5p低表達。由于Hep2細胞中MALAT1和miR-503-5p的變化最明顯，因此后續(xù)采用Hep2細胞進行研究(圖1)。

2.2 MALAT1和miR-503-5p的靶向關(guān)系

通過生物信息學(xué)軟件StarBase對MALAT1和miR-503-5p的靶向關(guān)系進行預(yù)測和分析，發(fā)現(xiàn)miR-503-5p區(qū)域存在LncRNA的潛在結(jié)合位點，說明miR-503-5p是MALAT1的靶向調(diào)節(jié)基因之一。qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)：對照組、sh-NC組、sh-MALAT1組MALAT1表達分別為(1.00±0.10)、(0.93±0.12)、(0.13±0.05)，對照組、NC inhibitor 組、miR-503-5p inhibitor 組miR-503-5p表達分別為(1.00±0.12)、(0.99±0.20)、(0.08±0.03)，證明MALAT1和miR-503-5p能夠成功在LC細胞中被敲除。對照組、sh-MALAT1組、miR-503-5p inhibitor組、sh-MALAT1+ inhibitor組miR-503-5p表達分別為(0.37±0.10)、(2.86±0.11)、(0.08±0.03)、(0.41±0.08)，敲除MALAT1可以明顯增加miR-503-5p的表達水平，說明MALAT1和miR-503-5p為負調(diào)控靶向關(guān)系。對照組、NC mimic組、miR-503-5p mimic組miR-503-5p的表達水平分別為(1.00±0.12)、(1.01±0.20)、(43.60±6.08)，miR-503-5p mimic組miR-503-5p的表達水平相比對照組增加了40多倍(P<0.001)，證明過表達miR-503-5p可以大幅度增加miR-503-5p的表達水平。用雙熒光素酶報告進行進一步驗證MALAT1和miR-503-5p的靶向關(guān)系，NC mimic+ MALAT1 WT組、miR-503-5p mimic+ MALAT1 WT組、NC mimic+ MALAT1 MUT組、miR-503-5p mimic+MALAT1 MUT組熒光素酶活性分別為(3.31±0.30)、(1.72±0.21)、(3.28±0.27)、(3.44±0.22)，miR-503-5p mimic和野生型MALAT1共轉(zhuǎn)染Hep2細胞后，細胞中雙熒光素酶活性明顯低于突變型(P<0.05)，說明MALAT1與miR-503-5p之間一定存在著靶向關(guān)系。因此，miR-503-5p是MALAT1的靶向調(diào)節(jié)基因之一，且miR-503-5p受MALAT1的負調(diào)控作用(圖2)。

2.3 敲除MALAT1對LC細胞增殖的影響

CCK8檢測結(jié)果所示，隨著時間增長，各組細胞增殖差異逐漸明顯。在第4天，對照組、sh-MALAT1組、miR-503-5p inhibitor組、sh-MALAT1+inhibitor組細胞增殖倍數(shù)分別是(6.80±0.40)、(2.55±0.35)、(8.26±0.36)、(6.11±0.37)倍，敲除MALAT1可以降低LC細胞的增殖倍數(shù)(P<0.01)，miR-503-5p inhibitor組細胞增殖倍數(shù)明顯高于聯(lián)合轉(zhuǎn)染組(P<0.01)，說明miR-503-5p inhibitor逆轉(zhuǎn)了sh-MALAT1對LC細胞增殖的抑制作用。Western blot檢測結(jié)果顯示，對照組、sh-MALAT1組、miR-503-5p inhibitor組、sh-MALAT1+inhibitor組Ki67蛋白表達分別為(0.58±0.10)、(0.15±0.04)、(0.95±0.13)、(0.66±0.08)，PCNA蛋白表達分別為(0.43±0.08)、(0.09±0.03)、(0.73±0.07)、(0.54±0.10)，sh-MALAT1組相關(guān)蛋白(Ki67和PCNA)的表達水平降低(P<0.05)；miR-503-5p inhibitor組的相關(guān)蛋白表達水平卻明顯增加，而聯(lián)合轉(zhuǎn)染組相關(guān)蛋白表達水平明顯低于miR-503-5p inhibitor組(P<0.01)，說明miR-503-5p抑制劑逆轉(zhuǎn)了sh-MALAT1對相關(guān)蛋白表達的抑制作用。這些結(jié)果顯示，敲除MALAT1能夠抑制LC細胞的增殖和相關(guān)蛋白的表達，miR-503-5p抑制劑能夠逆轉(zhuǎn)sh-MALAT1對LC細胞增殖的抑制作用(圖3)。

2.4 敲除MALAT1對LC細胞侵襲能力的影響

從Transwell檢測結(jié)果可知，對照組、sh-MALAT1組、miR-503-5p inhibitor組、sh-MALAT1+ inhibitor組細胞侵襲數(shù)目分別為(86.45±7.12)、(31.19±4.28)、(138.26±10.13)、(95.21±9.13)個，與對照組比較，sh-MALAT1組LC細胞的侵襲數(shù)明顯降低(P<0.01)，miR-503-5p inhibitor組LC細胞侵襲數(shù)明顯增加(P<0.01)；與聯(lián)合轉(zhuǎn)染組相比，miR-503-5p inhibitor組有所降低(P<0.01)。結(jié)果說明，敲除MALAT1能夠抑制LC細胞的侵襲，miR-503-5p inhibitor能夠逆轉(zhuǎn)sh-MALAT1對LC細胞侵襲的抑制作用(圖4)。

2.5 MALAT1通過靶向miR-503-5p上調(diào)FOXK1對LC細胞增殖和侵襲的影響

通過生物信息學(xué)軟件TargetScan對miR-503-5p和FOXK1的靶向關(guān)系進行分析，結(jié)果顯示，F(xiàn)OXK1 3′-UTR的5062-5068 bp區(qū)域存在has-miR-503-5p的潛在結(jié)合位點，故FOXK1是miR-503-5p的靶向調(diào)節(jié)基因之一。繼而用qRT-PCR檢測人二倍體細胞系和LC細胞系中FOXK1的表達水平，結(jié)果顯示，人二倍體細胞系(WI-38) FOXK1表達水平為(1.00±0.13)，LC細胞系(TU212、Hep2和AMC-HN-8) FOXK1表達水平分別為(2.13±0.31)、(2.86±0.25)、(1.96±0.17)，F(xiàn)OXK1在LC細胞中高表達，且Hep2細胞中FOXK1的變化最為明顯，因此，采用Hep2細胞進行后續(xù)研究。進一步用Western blot、Transwell、克隆形成分析顯示，對照組、sh-MALAT1組、pLenti-CMV-FOXK1組、sh-MALAT1+FOXK1組FOXK1蛋白表達水平分別為(2.86±0.24)、(0.34±0.08)、(5.81±0.20)、(4.11±0.17)，侵襲細胞數(shù)目分別為(76.32±10.01)、(37.22±7.14)、(133.64±11.24)、(90.52±12.29)個，克隆形成細胞數(shù)目分別為(867.34±35.28)、(522.63±41.62)、(1 138.87±46.75)、(905.57±28.35)個，敲除MALAT1后FOXK1的表達水平隨之降低，LC細胞的侵襲數(shù)和增殖數(shù)也隨之減少；過表達FOXK1后LC細胞的侵襲和增殖能力增加，并可以明顯逆轉(zhuǎn)sh-MALAT1對LC細胞的抑制作用。過表達FOXK1能夠促進LC細胞增殖，并能逆轉(zhuǎn)sh-MALAT1對LC細胞增殖和侵襲的抑制作用。MALAT1通過靶向miR-503-5p上調(diào)FOXK1能夠促進LC細胞的增殖和侵襲(圖5)。

3 討論

LC是喉部的惡性腫瘤，發(fā)病率約占全身腫瘤的1%～5%，LC導(dǎo)致人吞咽困難，影響呼吸和說話，嚴重者可致人窒息而亡。由于其治療手段單一，治愈率不高，以至于嚴重影響人類的健康，是目前亟待解決的一個重大難題。因此，尋找多層面調(diào)控LC細胞增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)的異?；虮磉_、信號通路及其分子機制，將有助于識別潛在的LC靶點，為臨床提供新的治療策略。

MALAT1是較早發(fā)現(xiàn)與人類疾病相關(guān)的LncRNA之一，在不同的哺乳動物中均有豐富的表達，而且在各種癌癥的發(fā)展和進展過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[9]。已有研究[6,8,10]顯示，MALAT1在腫瘤組織系、卵巢癌細胞系中上調(diào)，在直腸癌、結(jié)腸癌、肺癌、喉鱗癌等癌癥中也被多次提及，MALAT1高表達可以促進癌細胞的增殖、侵襲和遷移，抑制癌細胞凋亡，這些研究證明MALAT1在多種癌癥中為一種致癌因子。在此基礎(chǔ)上，本研究對LC細胞系(TU212、Hep2和AMC-HN-8細胞)和人二倍體細胞系(WI-38細胞)中MALAT1的表達水平進行了qRT-PCR檢測，結(jié)果顯示，MALAT1在LC細胞中高表達，繼而設(shè)計sh-RNA對MALAT1進行敲除，結(jié)果顯示，敲除MALAT1可以明顯抑制LC細胞的增殖和侵襲。這說明在LC中MALAT1也為一個致癌因子，這與MALAT1在其他癌癥中的研究[6,8]結(jié)果相似。

miRNA是單鏈非編碼小RNA，是轉(zhuǎn)錄的主調(diào)控因子，影響細胞新陳代謝、衰老[11]和骨細胞分化[12-13]。miR-503-5p作為一種成熟的miRNA，由pre-miR-503的5′端衍生而來，是神經(jīng)母細胞瘤中ALK表達的調(diào)控因子[14]。研究[15-21]發(fā)現(xiàn)，miR-503-5p過表達能夠抑制膀胱癌細胞的增殖、老年癡呆癥神經(jīng)元的凋亡和炎癥、宮頸癌細胞的遷移和侵襲、骨肉瘤細胞的轉(zhuǎn)移和增殖、調(diào)控細胞的衰老。然而，目前關(guān)于miR-503-5p在LC方面的報道卻鮮少未見。在此基礎(chǔ)上，本研究對LC細胞系和人二倍體細胞系中miR-503-5p的表達水平進行qRT-PCR檢測，結(jié)果顯示，miR-503-5p在LC細胞中低表達，這說明在LC中，miR-503-5p為一個抑癌因子，這與miR-503-5p在其他癌癥中的研究[16-22]結(jié)果正好相似。本研究通過敲除MALAT1并結(jié)合miR-503-5p inhibitor對LC細胞進行轉(zhuǎn)染，進一步對MALAT1和miR-503-5p的靶向關(guān)系進行分析，利用qRT-PCR、雙熒光素酶活性報告、CCK8、Western blot和Transwell方法對LC細胞的增殖和侵襲進行檢測，研究發(fā)現(xiàn)，miR-503-5p確實是MALAT1的靶向調(diào)節(jié)基因之一，且兩者為負調(diào)控關(guān)系，上調(diào)miR-503-5p能夠抑制LC細胞增殖和侵襲。

一個miRNA可以靶向多個、甚至百個mRNA，其中有30%的mRNA能被miRNA進行調(diào)控。FOXK1是正常細胞增殖所必需的Forkhead家族轉(zhuǎn)錄因子，也是一種可以調(diào)節(jié)多種細胞代謝、發(fā)育的致癌轉(zhuǎn)錄因子[23-24]，屬于mRNA。在人類的多種癌癥中，F(xiàn)OXK1過表達，并通過與miRNA相互作用而發(fā)揮致癌作用。本研究通過生物信息學(xué)軟件對miR-503-5p和FOXK1的靶向關(guān)系進行了預(yù)測，發(fā)現(xiàn)FOXK1是miR-503-5p的靶向調(diào)節(jié)基因之一。已有研究[25-28]顯示，F(xiàn)OXK1在乳腺癌、前列腺癌、肺鱗癌、胃癌、肝癌中高表達，對癌細胞的增殖、遷移和侵襲有一定的調(diào)控作用。而在有關(guān)LC的研究中，F(xiàn)OXK1尚未被研究和報道。在此基礎(chǔ)上，本研究檢測了人二倍體細胞系和LC細胞系中FOXK1的表達情況，發(fā)現(xiàn)FOXK1在LC細胞中高表達，這說明FOXK1也為LC中的一種致癌因子。針對這個結(jié)果，本研究進一步在敲除MALAT1后，對FOXK1的表達水平進行觀察，研究發(fā)現(xiàn)，敲除MALAT1明顯降低FOXK1的表達水平，這說明MALAT1與FOXK1的調(diào)節(jié)為正相關(guān)。繼而又通過qRT-PCR、Western blot、Transwell、克隆形成分析檢測發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXK1過表達促進LC細胞的增殖和侵襲，且可以逆轉(zhuǎn)MALAT1低表達對LC細胞增殖和侵襲的抑制作用?？傊?，F(xiàn)OXK1參與了MALAT1對LC細胞增殖和侵襲的調(diào)控。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA MALAT1能夠通過靶向miR-503-5p上調(diào)FOXK1來促進LC細胞的增殖和侵襲，揭示了MALAT1、miR-503-5p和FOXK1在LC中的基因表達、信號通路及其調(diào)控機制。這為LC的診斷和治療以及預(yù)后判斷提供了一個新的靶點和理論突破。