高效液相色譜法測定黃瓜果實中6-芐基腺嘌呤殘留量

□ 袁曉轉(zhuǎn) 洛陽市食品藥品檢驗所

芐基腺嘌呤（6—BA）是一種植物生長調(diào)節(jié)劑，屬于人工合成細(xì)胞分裂素，在水果、蔬菜的保鮮等方面有重要應(yīng)用。6—BA 在黃瓜種子發(fā)芽、幼苗幼果生長等過程中也有應(yīng)用，可促進(jìn)黃瓜果實生長發(fā)育，提高果實品質(zhì)和產(chǎn)量[1—2]。但6—BA 具有一定毒性，人體過量攝入會刺激皮膚黏膜，出現(xiàn)食道和胃黏膜損傷、惡心、嘔吐等癥狀[3]。

因此檢測黃瓜果實中6—BA 殘留量很有必要，蔬菜中6—BA 的檢測主要有高效液相色譜法和高效液相色譜—質(zhì)譜法等方法[4—5]。本試驗利用甲醇提取，固相萃取柱凈化，高效液相色譜—標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法定量，操作簡便、準(zhǔn)確性好，可用于黃瓜果實中6—BA 殘留量的測定。

1 材料與方法

1.1 試劑耗材與儀器

6—芐基腺嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品（98.51%，Dr.Ehrenstorfer）；甲醇（色 譜級，Dikma）；乙酸銨（色譜級，科密歐）；冰乙酸（分析純，開封化學(xué)試劑總廠）；C18固相萃取柱（1 g/6 mL，上海安譜實驗科技股份有限公司）。

U3000 高 效 液 相 色 譜 儀（Thermo）；BSA224S—CW 電子天平（賽多利斯）；3K15 高速冷凍離心機（Sigma）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（IKA）；KQ—400DE 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；JYL—Y85 高速破壁調(diào)理機（九陽）。

1.2 儀器條件

色譜柱：XBridge?C18柱，4.6 mm×250 mm×5 μm（waters）； 檢 測器：紫外檢測器；波長：267 nm；流動相：甲醇+乙酸銨溶液（0.02 mol/L）=50+50；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取6—BA 標(biāo)準(zhǔn)品0.010 0 g，用甲醇溶解定容至100 mL，混勻，即得濃度為100 μg/mL 的溶液。分別精密量取100 μg/mL 溶液10.0、5.0 mL和2.0 mL，用甲醇定容至100 mL，即得濃度分別為10.0、5.0 μg/mL 和2.0 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

分別精密量取2.0 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲 備 溶 液5.0、2.0、1.0、5.0 mL 和2.0 mL，用甲醇定容至10、10、10、100 mL 和100 mL，即得濃度分別為1.0、0.4、0.2、0.1μg/mL和0.04 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 樣品的制備和測定

稱取10 g（精確到0.001 g）均質(zhì)后的樣品于50 mL 離心管中，加20 mL甲醇，超聲提取15 min，以10 000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)入200 mL 梨形瓶中，樣品再次用20 mL 甲醇超聲提取15 min，離心合并上清液，于50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至盡干，殘液以2 mL/min的流速過預(yù)先活化好的固相萃取柱，用少量水洗滌梨形瓶，洗液過固相萃取柱，再用5 mL 水洗滌固相萃取柱，去除雜質(zhì)后用甲醇洗脫并定容至5 mL，混勻后過0.22 μm 微孔濾膜，供檢測用。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜圖

將樣品按照“1.2 儀器條件”進(jìn)樣檢測，所得圖譜如圖1 所示，在目標(biāo)物時間附近不出峰，為陰性樣品。將標(biāo)準(zhǔn)儲備液按照“1.2 儀器條件”進(jìn)樣檢測，目標(biāo)物在7.490 min 出峰，見圖2。

圖1 陰性樣品色譜圖

圖2 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（1.989 8 μg/mL）色譜圖

2.2 線性范圍和檢出限、定量限

選取濃度為0.04、0.1、02、0.4、1.0、2.0、5.0 μg/mL 與10.0 μg/mL 的6—BA標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“1.2 儀器條件”進(jìn)樣測峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性分析，結(jié)果表明該方法在0.04～10.0 μg/mL線性范圍內(nèi)線性良好，見表1。檢出限定量限的確定方法：向陰性樣品中加入從低到高不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，以3 倍和10 倍信噪比（S/N）對應(yīng)的6—BA 濃度作為檢出限和定量限。

表1 6-BA 線性及檢出定量限

2.3 精密度試驗

用0.4 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣測定8 次，測定峰面積，計算精密度。結(jié)果見表2，測得精密度為0.90%，符合要求。

2.4 回收率試驗

向10 g 陰性樣品中添加一定量標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個添加水平設(shè)定3 次平行，結(jié)果見表3，加標(biāo)水平在99.4951 μg/mL（0.5 mL）時的色譜圖見圖3，

平均回收率在86.77%～96.45%內(nèi)，符合回收率要求。

表2 精密度試驗

表3 回收率試驗

圖3 加標(biāo)水平在99.4951 μg/mL（0.5 mL）時的色譜圖

2.5 重復(fù)性試驗

向10 g 陰性樣品中添加0.994 95 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液1.5 mL，做6 次平行。結(jié)果見表4，該試驗的RSD 為3.69%，符合分析測試要求。

表4 重復(fù)性試驗

3 結(jié)論

本試驗采用高效液相色譜法測定黃瓜果實6—BA 殘留量，在0.04 ～10.0 μg/mL 范圍內(nèi)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定方法檢出限、定量限，驗證了回收率、精密度、重復(fù)性等指標(biāo)。該方法準(zhǔn)確高效，滿足試驗要求，為黃瓜果實6—BA殘留量的檢測提供了有效參考。