屏南龍?jiān)础募径霹N’古樹(shù)組培快繁技術(shù)研究

胡計(jì)紅 陳桂信 楊惠婷 康建坂 甘代奎

摘 ?要：以屏南縣棠口鄉(xiāng)龍?jiān)创?00多年‘四季杜鵑古樹(shù)的頂芽為外植體，開(kāi)展離體快繁技術(shù)研究，探討外植體消毒方式、取材時(shí)間對(duì)無(wú)菌系建立的影響，培養(yǎng)基中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類(lèi)和配比對(duì)芽苗繼代增殖的影響，以及培養(yǎng)基中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類(lèi)與配比對(duì)無(wú)根苗瓶?jī)?nèi)生根的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，外植體表面消毒以75%酒精作用30 s后再用0.1% HgCl2消毒8 min，消毒效果最好。外植體最佳的取材時(shí)間為5月中旬前后。在無(wú)菌系建立中污染的外植體可采用75%酒精消毒20 s，然后用0.1% HgCl2消毒5 min，再經(jīng)4次轉(zhuǎn)瓶后成功率可達(dá)71%。初代培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基為WPM+3.0 mg/L ZT+0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L GA3 ，平均有效芽數(shù)為3.45。在增殖培養(yǎng)中，帶腋芽莖段誘導(dǎo)叢生芽的增殖效果優(yōu)于頂芽，最適培養(yǎng)基組合為Anderson+0.5 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA，增殖系數(shù)達(dá)13.23。最適的瓶?jī)?nèi)生根培養(yǎng)基為：WPM+0.1 mg/L ZT+0.5 mg/L NAA，生根率達(dá)92.6%。本研究的結(jié)果可為‘四季杜鵑古樹(shù)的保護(hù)與開(kāi)發(fā)利用提供理論與技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞：屏南四季杜鵑;古樹(shù);離體快繁

中圖分類(lèi)號(hào)：Q813.1 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： Rapid propagation in vitro was explored using the apical buds of an ancient Four-season Rhododendron tree， more than 400 years， from Longyuan Village， Tangkou Town， Pingnan County as the explants to find the effects of sterilizing methods and time of explants on the development of sterile cultures， effects of kinds and ratios of plant growth regulators added in the media on the proliferation of shoots and rooting of rootless shoots. The optimum sterilization conditions were the explants treated with 75% of ethanol for 30 seconds and then dipped with 0.1% of HgCl2 for 8 minutes. The optimum sampling period for explants was about middle to late May. After four times of bottle transfer success rate of re-sterilizing reached 71% through rescuing of the contaminated explants in the development of sterile cultures by treating with 75% of ethanol for 20 seconds and then dipping with 0.1% of HgCl2 for 5 minutes. The optimum components of the medium in the primary culture was WPM medium added 3.0 mg/L of zeatin （ZT）， 0.1 mg/L of NAA and 0.5 mg/L of GA3， on which the average number of induced valid buds was 3.45. In the proliferation culture， the clustered shoots were induced from apical and stem segments with axillary buds of sterile plant-lets inoculated on Anderson medium added 0.5 mg/L of TDZ and 0.1 mg/L of NAA， multiplication coefficient of stem segments with axillary buds was higher than that of apical buds， reached 13.23. In the rooting culture of rootless shoots， the optimum medium was WPM medium added 0.1 mg/L of ZT and 0.5 mg/L of NAA， on which the rooting rate reached 92.6%. The results would provide theoretical and technical supports for conservation， exploitation and utilization of the ancient Four-season Rhododendron tree.

Keywords： Pingnan Four-season Rhododendron; ancient tree; rapid propagation in vitro

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.04.017

杜鵑花是杜鵑花科（Ericaceae）杜鵑花屬（Rhododendron）著名觀賞植物[1]。福建‘四季杜鵑觀賞價(jià)值很高，但大多處于山間野生狀態(tài)，很少人工栽培，甚至有些稀有類(lèi)型僅單株保存延續(xù)種性。屏南縣地處閩東的寧德市高海拔山區(qū)，分布著豐富多樣的‘四季杜鵑種質(zhì)資源，在棠口鄉(xiāng)龍?jiān)创宕蹇谟?株開(kāi)紅花的杜鵑花古樹(shù)，經(jīng)鑒定該樹(shù)屬錦繡杜鵑（Rhododendron pulchrum Sweet）變種，樹(shù)齡400 a以上，該樹(shù)四季開(kāi)花，成為屏南縣獨(dú)有的、有開(kāi)發(fā)利用價(jià)值的珍稀地方種質(zhì)資源。

屏南縣龍?jiān)创宓摹募径霹N古樹(shù)具有一般高山杜鵑特性：枝粗葉少、無(wú)種子、生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、通常靠扦插繁殖[2]。但隨著樹(shù)木的成熟，插穗形成不定根的能力逐漸下降[3]，且古樹(shù)生理年齡大，芽的分生能力弱，扦插成活率低，對(duì)母樹(shù)的傷害和受繁殖季節(jié)影響大，很難實(shí)現(xiàn)對(duì)古樹(shù)的保護(hù)利用。組培快繁具有所需繁殖材料少、繁殖系數(shù)高、種苗基因型和長(zhǎng)勢(shì)整齊一致、不受季節(jié)影響等優(yōu)點(diǎn)[4]，被廣泛應(yīng)用于杜鵑花的繁殖與工廠化生產(chǎn)。1975年Anderosn[5]以高山杜鵑的莖尖為外植體，進(jìn)行組織培養(yǎng)研究，成功獲得再生植株;在此基礎(chǔ)上，湯桂鈞等[6]探討了基本培養(yǎng)基種類(lèi)對(duì)高山杜鵑繼代增殖的影響;王吉等[7]、劉玉東等[8]篩選了高山杜鵑繼代增殖培養(yǎng)基中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類(lèi)和濃度配比的最佳組合。

‘四季杜鵑古樹(shù)樹(shù)齡長(zhǎng)，生命力和再生能力較弱，植株表面和體內(nèi)寄生了多種病原菌（圖1C），給組培快繁增加了難度;20世紀(jì)80年代初期，屏南縣政府邀請(qǐng)了中科院上海植生所的研究人員，曾對(duì)該杜鵑花古樹(shù)進(jìn)行組培快繁試驗(yàn)，未獲得成功;1986年，福建農(nóng)學(xué)院陳振光等[9]對(duì)傳統(tǒng)杜鵑組培技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，在MS基本培養(yǎng)基中，添加高強(qiáng)度的細(xì)胞分裂素6-（Hydroxy-3-methy?lbut-2-enylamino）purin （ZT）和6-（γ，γ-Dimethylall?ylamino）purine （2iP）和1-Naphthylacetic acid （NAA），成功誘導(dǎo)再生植株，并移栽成活，組培苗成年后，表現(xiàn)花期長(zhǎng)，除了盛夏不開(kāi)花，其余時(shí)間鮮花不斷;該研究未公布培養(yǎng)基的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的配比，無(wú)法給后續(xù)的研究提供借鑒。

本研究以屏南縣的‘四季杜鵑古樹(shù)的頂芽為材料，參考前人的杜鵑組培快繁技術(shù)，改進(jìn)無(wú)菌系建立的方法，減少污染率，提高成活率;優(yōu)化初代培養(yǎng)、繼代增殖和生根培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基種類(lèi)和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類(lèi)與配比，建立‘四季杜鵑古樹(shù)的組培快繁體系，為今后‘四季杜鵑古樹(shù)的保護(hù)、繁育和開(kāi)發(fā)利用提供理論與技術(shù)支撐。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

莖段外植體分別于2018年10月中旬、2019年3（圖1A）、5（圖1B）、6月份中旬采自福建省寧德市屏南縣棠口鄉(xiāng)龍?jiān)创宓摹募径霹N古樹(shù)當(dāng)年生中上部新枝。

1.2 ?方法

1.2.1 ?無(wú)菌系建立 ?對(duì)10月中旬取材的龍?jiān)础募径霹N古樹(shù)單芽嫩枝進(jìn)行消毒處理。除去葉片，留有葉柄的帶頂芽莖段在流水下用軟毛刷輕輕刷洗表面，5% 雕牌洗衣粉溶液洗滌浸泡25 min，蒸餾水沖洗20 min，50 %多菌靈浸泡30 min，蒸餾水沖洗3次，然后轉(zhuǎn)至超凈工作臺(tái)，無(wú)菌水沖洗3次，75%酒精浸泡30 s，無(wú)菌水沖洗3次，然后采用0.1% HgCl2做不同的消毒時(shí)間處理，最后用無(wú)菌水洗5次以上;用濾紙吸干材料表面水分，將材料剪成帶頂芽莖段，接入WPM+蔗糖30 g/L+瓊脂6.7 g/L，pH 5.0～5.4培養(yǎng)基中。10 d后，統(tǒng)計(jì)其污染數(shù)，30 d后觀察外植體生長(zhǎng)情況，對(duì)污染率、死亡率、成活率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。次年3、5、6月份中旬取材的‘四季杜鵑古樹(shù)嫩枝做同上處理，0.1% HgCl2消毒采用8 min。培養(yǎng)條件均為：溫度（25±2） ℃，光照強(qiáng)度1500～2000 Lux，光照時(shí)間12 h/d。

1.2.2 ?無(wú)菌系建立中污染的外植體再消毒利用 ?將污染的外植體取出，用軟毛刷清洗、蒸餾水沖刷后，分別以5個(gè)消毒處理（酒精30 s、次氯酸鈉15 min、酒精20 s+次氯酸鈉5 min、酒精20 s+ HgCl2 5 min、酒精30 s+ HgCl2 5 min）進(jìn)行滅菌。后接入WPM培養(yǎng)基中，每個(gè)處理15瓶，3次重復(fù);接種10 d后觀察污染情況，30 d后觀察外植體生長(zhǎng)情況進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

1.2.3 ?誘導(dǎo)培養(yǎng) ?將未污染且成活的外植體，接種于以WPM和1/4MS為基本培養(yǎng)基添加了（3.0、5.0） mg/L ZT和0.1 mg/L NAA組合的初代培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)。每個(gè)處理接種15瓶，每瓶接種1個(gè)外植體，3次重復(fù);接種后40 d統(tǒng)計(jì)高度大于2 cm的有效芽誘導(dǎo)數(shù)（1/4 MS培養(yǎng)基中附加蔗糖30 g/L，瓊脂6.7 g/L，pH 5.0～5.4）。

1.2.4 ?繼代增殖培養(yǎng) ?將經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)的無(wú)菌苗頂芽與帶腋芽莖段分別接種于以WPM和Anderson為基本培養(yǎng)基并附加（0.5、1.0）mg/L ZT和0.1 mg/L NAA或（0.5、1.0） mg/L TDZ和0.1 mg/L NAA組合的不同增殖培養(yǎng)基中，每個(gè)處理接種5瓶，每瓶接種3個(gè)外植體，3次重復(fù);接種后60 d統(tǒng)計(jì)分析，篩選出杜鵑增殖培養(yǎng)過(guò)程中最佳培養(yǎng)基組合（Anderson培養(yǎng)基中附加蔗糖30 g/L，瓊脂7.2 g/L，pH 5.0～5.4）。

1.2.5 ?瓶?jī)?nèi)生根培養(yǎng) ?選取增殖培養(yǎng)后長(zhǎng)勢(shì)一致的無(wú)根苗，剪成長(zhǎng)2～3 cm左右的帶頂芽莖段，分別接種于添加了（0.5、1.0）mg/L NAA或（0.5、1.0）mg/L IBA或0.1mg/L ZT與（0.5、1.0）mg/L NAA組合的WPM生根培養(yǎng)基中，每個(gè)處理接種10瓶，每瓶接種2個(gè)外植體，3次重復(fù);接種后60 d觀察統(tǒng)計(jì)無(wú)根苗的生根情況計(jì)算生根率。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

采用Excel整理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，SPSS 22.0進(jìn)行差異顯著性分析。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?HgCl2消毒時(shí)間對(duì)無(wú)菌系建立的影響

10月初取材，不同時(shí)間消毒處理結(jié)果不同。如表1所示，隨著HgCl2消毒時(shí)間的增加，3號(hào)處理與各處理相互間平均污染率具有顯著性差異，但5號(hào)處理平均污染率最低，為31.3%;平均死亡率在1和3號(hào)處理上無(wú)顯著性差異，其他處理間差異性顯著;1號(hào)處理平均死亡率最低，為14.9;平均成功率在1和2號(hào)處理間差異不顯著，4號(hào)處理平均成功率顯著高于其他處理，為44.3%，5號(hào)處理平均污染率雖然最低，但消毒時(shí)間較長(zhǎng)，0.1% HgCl2對(duì)頂芽產(chǎn)生毒害，成功率低。所以，‘四季杜鵑古樹(shù)當(dāng)選用頂芽作為外植體時(shí)，0.1% HgCl2最佳的表面消毒時(shí)間為8 min。

2.2 ?取材時(shí)間對(duì)無(wú)菌系建立的影響

10月初與3、5、6月份中旬分別采‘四季杜鵑古樹(shù)帶頂芽的莖段，如表2所示，經(jīng)消毒處理后，不同月份取材對(duì)無(wú)菌體系建立階段平均污染率、平均死亡率、平均成功率均存在顯著性差異（P<0.05）;3號(hào)處理，平均污染率和死亡率最低，分別是22.5%和10.8%，平均成功率最高，為66.7%;所以，5月中旬為外植體最佳取材時(shí)間。

2.3 ?污染的外植體再消毒對(duì)無(wú)菌系建立的影響

對(duì)無(wú)菌系建立階段外植體僅基部長(zhǎng)菌污染的，進(jìn)行再消毒和4次轉(zhuǎn)瓶處理。如表3所示，消毒方式不同平均污染率在1、3與2、4、5號(hào)處理間具有顯著性差異，1號(hào)處理最高，達(dá)79.5%;平均死亡率均具有顯著性差異，其中 2號(hào)處理死亡率較高，為84.8%;1、2、3號(hào)處理的成功率為0，4號(hào)處理平均成功率達(dá)到71%，且與其他處理差異性顯著。因此，酒精20 s+0.1% HgCl2 5 min為外植體污染再消毒的最佳方式。

2.4 ?基本培養(yǎng)基種類(lèi)與植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比對(duì)初代培養(yǎng)的影響

在誘導(dǎo)不定芽的過(guò)程中，接種的外植體整體在第7～10 d不定芽萌發(fā)（圖2A），20 d后不定芽伸長(zhǎng)，生長(zhǎng)速度較快（圖2B），30 d后不定芽伸長(zhǎng)至2.0～2.5 cm，葉片下垂（圖2C），第40 后不定芽生長(zhǎng)速度緩慢（圖2D）。如表4所示：3號(hào)處理誘導(dǎo)的平均有效芽數(shù)最多，為3.45，且生長(zhǎng)狀況相對(duì)較好;1/4 MS為基本培養(yǎng)基時(shí)，平均芽數(shù)為3.36，與WPM培養(yǎng)基中芽數(shù)相近，但1/4 MS誘導(dǎo)的不定芽細(xì)長(zhǎng)卷曲狀，狀態(tài)差;綜合以上，在初代培養(yǎng)中，‘四季杜鵑古樹(shù)最佳培養(yǎng)基為：WPM+3.0 g/L ZT+0.1 mg/L NAA。

2.5 ?基本培養(yǎng)基與植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)無(wú)菌苗頂芽繼代增殖的影響

在無(wú)菌苗頂芽誘導(dǎo)不定芽過(guò)程中，添加ZT培養(yǎng)基組合7～10 d頂芽伸長(zhǎng)不定芽萌發(fā)，30 d不定芽伸長(zhǎng)至2 cm左右，60 d后生長(zhǎng)緩慢，葉片逐漸下垂變褐，均無(wú)愈傷組織形成;在添加TDZ培養(yǎng)基組合中，7～10 d不定芽萌發(fā)，基部有愈傷組織形成，30 d不定芽長(zhǎng)勢(shì)良好，基部愈傷組織不定芽萌發(fā)（圖3A）;60 d（圖3B）不定芽伸長(zhǎng)至1.0～2.5 cm，生長(zhǎng)緩慢;如表5，在WPM培養(yǎng)基中添加ZT或TDZ時(shí)，隨著ZT或TDZ濃度的提高，平均芽誘導(dǎo)率差異不明顯或無(wú)差異（P< 0.05），芽的增殖系數(shù)隨著其濃度的提高均達(dá)到顯著性差異;在Anderson培養(yǎng)基中，隨著ZT濃度的提高，平均芽誘導(dǎo)率和增殖系數(shù)隨著其濃度的提高均達(dá)到顯著性差異，隨著TDZ濃度的提高，平均芽誘導(dǎo)率無(wú)差異，芽的增殖系數(shù)隨著其濃度的提高達(dá)到顯著性差異;7號(hào)處理的芽誘導(dǎo)率100%，芽增殖系數(shù)為9.31，顯著高于其他培養(yǎng)基組合;因此，頂芽誘導(dǎo)不定芽的最適培養(yǎng)基組合為Anderson+0.5 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA。

2.6 ?基本培養(yǎng)基與植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)無(wú)菌苗帶腋芽莖段繼代增殖的影響

帶腋芽莖段在添加ZT的培養(yǎng)基組合中無(wú)愈傷組織形成，7～10 d不定芽從基部或葉腋處萌發(fā)，30 d后不定芽增殖狀態(tài)穩(wěn)定，60 d后不定芽生長(zhǎng)緩慢，均高2.5 cm左右;在添加TDZ的培養(yǎng)基組合中，10～20 d莖段基部或葉腋處不定芽萌發(fā)，基部有愈傷組織形成，30 d不定芽伸長(zhǎng)0.1～0.5 cm左右，愈傷組織上不定芽萌發(fā)（圖3C），60 d后不定芽呈簇生狀，生長(zhǎng)緩慢（圖3D）;如表6，在WPM培養(yǎng)基中添加ZT或TDZ時(shí)，隨著ZT或TDZ濃度的提高，平均芽誘導(dǎo)率均為100%，無(wú)顯著差異（P<0.05），芽的增殖系數(shù)隨著其濃度的提高均達(dá)到顯著性差異;在Anderson培養(yǎng)基中，隨著ZT濃度的提高，平均芽誘導(dǎo)率和增殖系數(shù)隨著其濃度的提高均達(dá)到顯著性差異，隨著TDZ濃度的提高，平均芽誘導(dǎo)率無(wú)差異，芽的增殖系數(shù)隨著其濃度的提高達(dá)到顯著性差異;7號(hào)的增殖系數(shù)最高，為13.23;因此，帶腋芽莖段誘導(dǎo)不定芽的最佳培養(yǎng)基組合為Anderson+0.5 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA。

2.7 ?植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類(lèi)與配比對(duì)無(wú)根苗瓶?jī)?nèi)生根的影響

觀察發(fā)現(xiàn)，在添加了生長(zhǎng)素NAA或IBA的培養(yǎng)基中，60 d后不定根萌發(fā)，90 d后不定根伸長(zhǎng)，在添加IBA的培養(yǎng)基中生根率較低;在僅添加了NAA的培養(yǎng)基中生根率較好但根系易形成棉絮狀斷根（圖4A）;添加0.1 mg/L ZT和0.5 mg/L NAA的培養(yǎng)基中，第30天基部形成愈傷組織，不定根萌發(fā)，60 d后不定根伸長(zhǎng)（圖4B、圖4C）。如表7所示，在添加了不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的WPM培養(yǎng)基中;生根率隨著生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類(lèi)與濃度變化，均存在顯著差異，平均根長(zhǎng)僅5號(hào)處理存在差異，其他無(wú)顯著差異，平均生根數(shù)2號(hào)與6號(hào)處理無(wú)顯著差異，其他組合存在顯著差異;5號(hào)處理中生根率、平均根長(zhǎng)、平均生根數(shù)顯著高于其他組合，未添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的對(duì)照組，生根率為0;因此，生根培養(yǎng)基最佳組合為WPM+0.1 mg/L ZT+0.5 mg/L NAA。

3 ?討論

污染問(wèn)題一直是影響植物組織培養(yǎng)是否成功的關(guān)鍵因素之一[10]，前人研究表明，高山杜鵑組織培養(yǎng)以HgCl2為主要表面消毒劑時(shí)，外植體處理5～10 min作用效果較好[6-7， 11-12]。本研究得出10月份取材，對(duì)龍?jiān)础募径霹N古樹(shù)HgCl2處理，成功率隨著消毒時(shí)間增加先上升后下降，以消毒8 min效果最好，成功率為44.6%;為優(yōu)化無(wú)菌系建立的成功率，對(duì)材料進(jìn)行不同時(shí)間取材對(duì)比，10月份取材時(shí)，外植體生理較老化，消毒和不定芽誘導(dǎo)困難，成功率較低;3月份取材，當(dāng)年新生枝條較短，幾乎只能采集到1 cm左右長(zhǎng)的莖尖，外植體消毒困難，成功率低;6月份為梅雨季節(jié)，連續(xù)的陰雨天容易滋生細(xì)菌，導(dǎo)致外植體的污染率更高;龍?jiān)础募径霹N的生長(zhǎng)旺盛期在5月份。試驗(yàn)結(jié)果表明，5月中旬的晴天取幼嫩的頂芽，成功率最高，達(dá)到66.7%，這與鐘宇等[4]研究結(jié)果相似，在3—5月植物處于生長(zhǎng)旺盛期，接種成功率較高。國(guó)內(nèi)外近些年以葉片或花蕾作為外植體建立杜鵑組培快繁技術(shù)體系也較多[13-16]，Tomsone等[17]也在對(duì)常綠杜鵑‘伊琳娜的研究中指出，花蕾芽作為外植體更容易控制污染。龍?jiān)础募径霹N已有400年以上樹(shù)齡，樹(shù)體表面及內(nèi)生菌嚴(yán)重，其生存環(huán)境差、生理年齡較高、生命活性弱等都給無(wú)菌系建立帶來(lái)了阻礙，可嘗試以葉片或花蕾為外植體建立無(wú)菌系，是否能夠提高成功率還有待試驗(yàn)。

‘四季杜鵑古樹(shù)的取材有限，生長(zhǎng)環(huán)境差，枝條攜帶病原菌和內(nèi)生菌嚴(yán)重，在無(wú)菌系建立中，通過(guò)表面消毒，可去除外植體表面的病原菌，但無(wú)法去除體內(nèi)的內(nèi)生菌，內(nèi)生菌主要通過(guò)維管束運(yùn)輸?shù)脚囵B(yǎng)基中，引起外植體的再次污染。因此，將污染的外植體重新消毒轉(zhuǎn)瓶再培養(yǎng)，可提高接種材料的利用率和成活率，節(jié)約外植體。唐映紅等[18]在無(wú)菌系建立階段將外植體經(jīng)過(guò)反復(fù)轉(zhuǎn)瓶的方法消除莖段中的內(nèi)生菌，得到無(wú)菌幼芽;參考前人經(jīng)驗(yàn)，本研究將污染的外植體進(jìn)行再1次消毒處理，幫助消除外植體表面的寄生菌，再經(jīng)過(guò)4次轉(zhuǎn)瓶，減少外植體切口處分泌的內(nèi)生菌（此方法還沒(méi)有文章提到過(guò)）;通過(guò)不同消毒方式對(duì)比，以酒精20 s+0.1% HgCl2 5 min處理和4次轉(zhuǎn)瓶后，成功率達(dá)到71%，有效挽救了污染的外植體，提高外植體的利用率。

培養(yǎng)基種類(lèi)及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)組培苗生長(zhǎng)發(fā)育有顯著影響。初代培養(yǎng)在1/4 MS培養(yǎng)基中的杜鵑葉片出現(xiàn)卷曲，在WPM培養(yǎng)基中杜鵑長(zhǎng)勢(shì)較好。增殖培養(yǎng)中，在植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑共同作用下，WPM培養(yǎng)基中的杜鵑部分容易出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，Anderson培養(yǎng)基中杜鵑長(zhǎng)勢(shì)較好;1/4 MS和WPM對(duì)杜鵑枝條培養(yǎng)的不適宜性可能與培養(yǎng)基中礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)素的濃度有關(guān)，杜鵑花科植物適宜生長(zhǎng)在低pH和低營(yíng)養(yǎng)狀況的土壤中[19]，表明用于這類(lèi)植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基應(yīng)為低離子濃度[20]，在Anderson培養(yǎng)基上表現(xiàn)較好的生長(zhǎng)狀況可能由于其離子濃度較低，適宜‘四季杜鵑古樹(shù)的生長(zhǎng)。此外，增殖培養(yǎng)階段帶腋芽莖段比頂芽更適宜增殖培養(yǎng)，無(wú)論培養(yǎng)基或植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑如何腋芽的增殖系數(shù)都比頂芽高，這在誘導(dǎo)迷人杜鵑和迎紅杜鵑從生芽上也得到同樣的結(jié)果[21-22]。

由于‘四季杜鵑古樹(shù)生理年齡大，對(duì)低強(qiáng)度的細(xì)胞分裂素反應(yīng)遲鈍，因此，在本研究中使用了高強(qiáng)度的細(xì)胞分裂素（ZT和TDZ）。試驗(yàn)結(jié)果表明，不同強(qiáng)度的細(xì)胞分裂素對(duì)‘四季杜鵑古樹(shù)繼代增殖效果上存在明顯差異，由于TDZ的強(qiáng)度高于ZT，TDZ和NAA濃度及其相互作用顯著影響愈傷組織和芽的形成，其愈傷誘導(dǎo)率比ZT與NAA組合的培養(yǎng)基高，添加0.5 mg/L TDZ的培養(yǎng)基，增殖系數(shù)達(dá)到13.23，是ZT培養(yǎng)基組合的2倍;但是在不定芽誘導(dǎo)的質(zhì)量上，TDZ組合的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的無(wú)菌苗，多數(shù)呈簇生狀，細(xì)弱矮小;雖然TDZ能快速有效地誘導(dǎo)外植體產(chǎn)生不定芽或叢生芽，但抑制了不定芽的伸長(zhǎng)[12， 17]，影響無(wú)菌苗的質(zhì)量;因此，在TDZ組合培養(yǎng)基中誘導(dǎo)的不定芽，必須轉(zhuǎn)接到不含TDZ的培養(yǎng)基中進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，提高無(wú)菌苗質(zhì)量;而ZT組合培養(yǎng)基誘導(dǎo)的不定芽或叢生芽生長(zhǎng)正常，無(wú)菌苗長(zhǎng)勢(shì)較好，無(wú)須進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，該結(jié)果與郭穎等[23]和Preece等[24]在杜鵑組培快繁上的研究結(jié)果相一致。

在一般組培快繁的生根培養(yǎng)中，通常使用低大量元素的基本培養(yǎng)基，去除培養(yǎng)基中的細(xì)胞分裂素，只加入生長(zhǎng)素，Wei等[25]在云錦杜鵑的生根培養(yǎng)中，基本培養(yǎng)基為WPM，只添加了1.0 mg/L的IBA，其生根率達(dá)84.0%;而在‘四季杜鵑古樹(shù)的生根培養(yǎng)中，雖然在WPM基本培養(yǎng)基中添加了1.0 mg/L的IBA，其生根率很低，僅為11.8%，NAA的生根效果顯著高于IBA，這與王育選等[26]的試驗(yàn)結(jié)果一致;本研究中，在生根培養(yǎng)基中添加低濃度的ZT，能有效刺激無(wú)菌苗的生根，生根率顯著提高，這可能與‘四季杜鵑古樹(shù)的生理年齡有關(guān)，生理年齡大，對(duì)生長(zhǎng)素的反應(yīng)遲鈍，需要細(xì)胞分裂素的刺激來(lái)啟動(dòng)根原基的細(xì)胞分裂，‘四季杜鵑古樹(shù)的最佳的生根培養(yǎng)基為WPM+0.1 mg/ LZT+0.5 mg/L NAA，其無(wú)根苗的生根率達(dá)92.6%。

裴東等[3]指出，組織培養(yǎng)技術(shù)為樹(shù)木的復(fù)幼提供了一個(gè)良好的實(shí)驗(yàn)體系，試驗(yàn)誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定芽使形成的植株表現(xiàn)出一定程度復(fù)幼，且連續(xù)多次繼代培養(yǎng)可使許多成熟樹(shù)木的分生組織復(fù)幼;本研究對(duì)‘四季杜鵑古樹(shù)組培快繁體系的建立，幫助古樹(shù)恢復(fù)其幼態(tài)特征，如提高生根能力等;前期的實(shí)驗(yàn)研究也為后面移栽打下基礎(chǔ)，這對(duì)古樹(shù)保護(hù)利用具有重要意義。

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