基于甘蔗AP85-441和R570基因組參考序列的微衛(wèi)星位點鑒定和SSR標記開發(fā)

徐志軍 趙勝 胡小文 孔冉 蘇俊波 劉洋

摘 ?要：分子標記缺乏是制約甘蔗分子標記技術發(fā)展的重要因素。本研究利用甘蔗AP85-441和R570基因組參考序列，使用MISA軟件分別鑒定出512 835和97 839個微衛(wèi)星位點，分別占割手密基因組（AP85-441）和甘蔗基因組（R570）高質量參考序列的0.32%和0.35%。在2個基因組序列中，優(yōu)勢重復單元均為單核苷酸、二核苷酸和三核苷酸，各重復單元均以AT富集的基元為主。割手密和甘蔗基因組序列中分別有472 117和89 748個位點可以開發(fā)SSR標記。對割手密、甘蔗與高粱基因進行同源性分析，分別鑒定出16 691個和13 271個對應到高粱1～10號染色體上的同源基因，利用基因序列中的SSR位點，開發(fā)出13 224和7624對SSR引物。對開發(fā)的引物分別以割手密和甘蔗基因組為模板進行e-PCR檢測，這些引物在割手密基因組中以多位點擴增為主，在2個基因組中的有效標記比例分別為79.35%和36.13%、79.01%和93.36%。部分SSR引物在基因組中表現出特異性擴增，有1368對僅在AP85-441中單擴增，有1420對僅在R570序列中單擴增，共有752對SSR引物可在2個基因組中單擴增，且這些SSR的擴增位點和來源基因均分布于所在基因組的全部染色體上。在禾本科作物基因組中e-PCR檢測表明，開發(fā)的單擴增SSR標記具有較好的特異性。本研究鑒定的SSR位點，有助于進一步豐富甘蔗的分子標記;開發(fā)的3540對SSR引物對于栽培種甘蔗遺傳圖譜構建中遺傳來源區(qū)分和同源連鎖群確定具有重要的參考意義。

關鍵詞：甘蔗;微衛(wèi)星序列;同源基因;SSR標記;特異擴增

中圖分類號：S566.1;S188+.1 ? ? ?文獻標識碼：A

Abstract： Lacking of molecular markers is an important factor restricting the development of marker-based genetic and breeding research. In this study， 512 835 and 97 839 microsatellite sequence， which accounted for 0.32% and 0.35% of the genome， were identified based AP85-441 and R570 genomic reference sequences respectively， using the MISA software. In the genomes， the dominant repeat units were single nucleotide， dinucleotide and trinucleotide， and each repeat unit was dominated by AT-enriched elements. 472 117 and 89 748 loci of the genomes could be used to develop SSR markers. 16 691 and 13 271 homologous genes corresponding to sorghum chromosome 1–10 were identified by homology analysis on the genes of Saccharum spontaneum， sugarcane and sorghum， and 13 224 and 7624 pairs of SSR primers were developed by the gene sequence. In silico PCR analysis of these SSR markers revealed that the markers were mostly multilocus amplified in Saccharum spontaneum genome， and the effective markers in the two genomes were 79.35% and 36.13%， 79.01% and 93.36%， respectively. Part of the SSR markers showed specific amplification in the genomes. 1368 and 1420 SSR were specific single-locus amplification in AP85-441 and R570， respectively. 752 SSR were single-locus amplification in the two genomes， and the amplification sites and source genes of these SSR were distributed on all chromosomes in the genome. In this study， the SSR loci identified would be conducive to enriching the molecular markers of sugarcane， and the 3540 pairs of SSR primers developed will provide support for the determination of homologous linkage groups and group genetic origin in the construction of sugarcane genetic map.

Keywords： sugarcane; microsatellite sequence; homologous gene; SSR marker; specific amplification

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.04.013

微衛(wèi)星序列（Microsatellite sequence），又稱簡單重復序列（Simple sequence repeats， SSR），是一類在植物基因組中廣泛存在的以少數幾個核苷酸（1～6個）為單位重復構成的DNA片段，多位于基因非編碼區(qū)，兩端多是單拷貝且具有一定保守性的序列?；谖⑿l(wèi)星位點其特性開發(fā)的分子標記稱為SSR標記，具有分布廣泛、共顯性和多態(tài)性好、分辨率高、重復性好的特點，分析過程簡單、實驗結果可靠，因而被廣泛的應用于作物的遺傳多樣性分析、指紋圖譜構建、雜種鑒定、遺傳圖譜構建、基因挖掘研究等方面。

栽培種甘蔗（Saccharum spp.）是我國最為重要的糖料作物，在我國熱帶和亞熱帶地區(qū)廣泛種植。由甘蔗制取的蔗糖是我國人民食用蔗糖的主要來源（占比90%以上）。我國甘蔗種植面積在1.33×106 hm2左右。由于我國甘蔗種植區(qū)域和種植總面積的限制，加之栽培種甘蔗復雜的基因組結構制約著甘蔗基因組學和育種學的發(fā)展[1]，盡管我國是世界第3大食用蔗糖生產國，我國每年仍需進口大量的食用蔗糖[2-3]。在過去20年里，分子遺傳學的發(fā)展和進步促進了對甘蔗基因組的全面認識，基于RAPD、AFLP、SSR等分子標記的低密度不飽和遺傳圖譜[4-13]、重要性狀的QTL定位研究[14-17]、全基因組關聯(lián)分析[18-20]先后展開以期建立甘蔗性狀-標記技術體系從而加速甘蔗育種進程。然而，栽培種甘蔗基因組極其復雜，解析難度遠超大多數作物，其基因組具有異源多倍體、非整倍體的特性，基因組約為10 GB。相較于甘蔗基因組，現有的甘蔗分子標記，特別是用于高密度遺傳圖譜構建和重要功能基因挖掘的分子標記還太少，限制了甘蔗重要性狀關聯(lián)功能基因的挖掘和輔助選擇標記的開發(fā)，從而導致基于分子標記技術的甘蔗遺傳改良研究進展緩慢。

運用最新的測序技術和組裝策略，甘蔗基因組在2018年取得重要進展：甘蔗祖先種割手密（Saccharum spontaneum L.）最小單倍體AP85- 441（1n=4x=32， 3.5 GB）基因組完成測序[21]，且利用甘蔗基因組與高粱基因組的共線性，獲得了基于BAC文庫的栽培種甘蔗R570嵌合單倍體高質量序列（530.7 Mb）[22]。這些基因組信息的發(fā)布，為大規(guī)模分子標記的開發(fā)提供了大量可利用數據?；诖?，本研究利用AP85-441和R570基因組序列信息，鑒定基因組中的微衛(wèi)星位點，進一步豐富甘蔗的分子標記;并利用甘蔗基因組與高粱基因組的同源性，開發(fā)可用于遺傳圖譜遺傳來源劃分和同源連鎖群錨定的SSR標記，為甘蔗重要功能基因的挖掘和分子標記輔助育種奠定基礎。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

割手密最小單倍體AP85-441全基因組信息下載于http：//www.life.illinois.edu/ming/downlo-ads/Spontaneum_genome/，割手密單套基因信息由福建農林大學張積森教授提供，栽培種甘蔗R570嵌合單倍體高質量序列信息下載于http：// sugarcane-genome.cirad.fr。水稻、高粱基因組數據來源于Phytozome數據庫（https：//phytozome.jgi.doe. gov/pz/portal.html），玉米基因組數據來源于（https：//www.maizegdb.org）。

1.2 ?SSR位點挖掘及基因SSR引物設計

使用MISA軟件（Microsatellite identification tool， http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/）分別搜索AP85-441全基因組、R570基因組高質量參考序列、AP85-441單套染色體基因序列中的微衛(wèi)星序列SSR，并對SSR重復基序類型進行特征分析。查找標準為單核苷酸基序至少重復次數為10，而2、3、4、5和6核苷酸基序最少重復次數分別為6、5、5、5和5。使用Primer 3.0軟件對SSR位點進行引物設計，每個SSR位點分別設計3組引物，并且滿足以下的特征：（1）長度在15～25 bp范圍內;（2）PCR擴增產物長度為100～400 bp;（3）退火溫度（Tm值）在50～60 ℃之間;（4）GC的含量在40%～60%;（5）避免出現發(fā)夾結構及引物二聚體。

1.3 ?基因同源性分析

使用本地Blast軟件Blast-2.2.31（ftp：//ftp.ncbi. nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/），對割手密蛋白序列與高粱蛋白序列、栽培種甘蔗蛋白序列與高粱蛋白序列、割手密蛋白序列與栽培種甘蔗蛋白序列分別進行Blast比對。比對結果使用MCS?canX（Multiple collinearity scan toolkit）軟件，分析割手密基因、栽培種甘蔗基因和高粱基因三者之間的同源性。

1.4 ?e-PCR引物質量檢測

使用e-PCR Version： 2.3.9（http：//www.ncbi. nlm.nih.gov/tools/epcr/）對設計的引物進行電子PCR檢測，參數設置按照Deng等[23]的方法進行。分別分析同源基因開發(fā)的SSR引物在甘蔗、割手密基因組中的擴增情況，統(tǒng)計并記錄引物在基因組上的擴增次數，剔除擴增產物長度<100 bp和>500 bp及特異性不好的引物。篩選出的單擴增SSR標記在水稻、玉米和高粱基因組中進行e-PCR檢測特異性。

2 ?結果與分析

2.1 ?割手密基因組和甘蔗基因組參考序列中SSR位點分布及結構特點

利用割手密AP85-441基因組序列和甘蔗R570嵌合單倍體高質量序列鑒定出具有單核苷酸～六核苷酸重復單元類型的微衛(wèi)星位點，其中從割手密3.13 Gb的基因組和甘蔗530.7 Mb的基因組參考序列中分別鑒定出512 835和97 839個微衛(wèi)星位點，分別包含37 090和7383個復合位點。鑒定出的微衛(wèi)星序列分別占割手密基因組和甘蔗基因組高質量參考序列的0.32%和0.35%，平均每6.10 kb和5.42 kb出現1個微衛(wèi)星位點。

從割手密和甘蔗基因組序列中分別鑒定出6種重復單元類型的基序種類分別為1949和1062種，基序種類隨重復單元核苷酸數的增加而增加，分別為4、12、60、231、662、980種和4、12、60、210、368、408種（表1和表2）。在2個基因組序列中，各重復單元組成的SSR數量上存在著較大差異，但均以單核苷酸、二核苷酸和三核苷酸為主，分別占全部SSR位點的96.74%和96.19%。在2個基因組中，各重復單元優(yōu)勢基序類型隨著重復單元增加，在所屬重復單元SSR位點中所占的比例呈下降趨勢，重復單元均以AT富集的基元為主。2個基因組序列中除三核苷酸重復單元中的優(yōu)勢基序為分別為AAG/CTT（14.24%）和CCG/CGG（21.18%）外，其余重復單元中的優(yōu)勢基序均相同，分別為A/T、AT/AT、AAAT/ATTT、AAAAG/CTTTT、AGATAT/ATATCT（表1和表2）。2個基因組序列中微衛(wèi)星位點重復單元重復次數分布分別為5～9127次和5～135次，但主要集中在5～15次，各重復單元數量均隨重復次數的增加而降低，單核苷酸～六核苷酸單元主要重復次數分別為10、6、5、5、5、5（圖1）。對鑒定出的微衛(wèi)星位點進行引物設計發(fā)現，割手密和甘蔗基因組高質量參考序列中分別有472 117和89 748個位點可以開發(fā)SSR標記。

2.2 ?割手密、甘蔗和高粱同源基因鑒定

對割手密單倍體35 519個基因的蛋白序列、甘蔗25 316個基因的蛋白序列進行比對，并分別與高粱基因的蛋白進行比對，分別鑒定出16 691個和13 271個對應到高粱1～10號染色體上的同源基因，其中有8854對割手密和甘蔗同源基因同時與高粱基因同源（圖2，表3）。甘蔗、割手密和高粱同源基因在各染色體上不均勻分布，其中對應到高粱8號染色體上同源基因最少，推測甘蔗、割手密在進化過程中可能發(fā)生了基因丟失事件（圖2）;其中栽培種甘蔗對應到高粱1～4號染色體上的同源基因最多，且這些基因在甘蔗參考基因組上的分布與其同源基因的分布一致性較高;割手密對應到高粱1、3、4號染色體上的同源基因最多，割手密2、5、6和7號染色體上的同源基因對應到高粱染色體4～9號染色體，可能與高粱向割手密進化過程中染色體的重排和丟失有關;甘蔗-高粱-割手密同時同源的基因也主要對應到高粱1～4號染色體?；蚨ㄎ伙@示甘蔗基因組參考序列與高粱基因組的一致性更高（圖2），且甘蔗與高粱同源基因大部分具有相同的染色體分布。

2.3 ?用于遺傳圖譜遺傳來源劃分及同源連鎖群錨定的標記開發(fā)

利用MISA軟件對割手密單倍體、栽培種甘蔗與高粱同源基因的全長序列中的SSR位點進行鑒定，其中分別有7887和4766個的基因包含SSR位點（表4），位點個數分別為13 708和8059個，對這些SSR位點進行引物設計，分別獲得13 224和7624對SSR引物（表4）。分別以割手密基因組和甘蔗基因組高質量參考序列為模板，對獲得的SSR引物進行e-PCR檢測，這些引物在割手密基因組中以多位點擴增為主。其中來源于割手密基因組的13 224對SSR引物在2個基因組序列中有效擴增位點比例均為97.88%，但有效標記數差異顯著，分別為10 493（79.35%）和4779（36.13%）個（表4）。來源于甘蔗基因組高質量參考序列的7624對SSR引物在2個基因組中的有效擴增位點比例分別為96.81%和99.60%，有效標記數為6024（79.01%）和7118（93.36%）個。

對這些SSR引物在2個基因組的擴增情況進一步分析表明，部分SSR引物表現出特異性擴增。這些特異性SSR位點標記可作為特征標記，用于栽培種甘蔗遺傳圖譜構建過程中的基因遺傳來源劃分。源于割手密的SSR引物中共有1368對僅在割手密基因組中單位點擴增，其中有196對可同時在2個基因組中單位點擴增;源于甘蔗的SSR引物中有556對可同時在割手密和甘蔗基因組高質量參考序列中單位點擴增，有1420對僅在甘蔗嵌合單倍體序列中單位點擴增（表5）。這些SSR引物來源于具有單個或多個SSR位點的割手密基因和甘蔗基因，3540個SSR位點來源于2677個單位點基因和363個多位點基因，平均SSR位點密度為1.16（表5）。

對割手密和甘蔗單擴增SSR標記擴增位點在基因組上的分布、標記來源基因對應高粱同源基因在高粱基因組上的分布分析表明：來源于割手密和甘蔗的單基因組擴增標記和雙基因組標記擴增位點分布于割手密、甘蔗基因組上并覆蓋全部染色體，并且標記來源基因對應的同源高粱基因在也均勻分布于高粱全部染色體上（圖3）。割手密和甘蔗SSR擴增位點及同源高粱基因在1～4號染色體上的數量分布具有較高的一致性，占比范圍為55%～58%，表明1～4號染色體在進化過程中可能具有較高的穩(wěn)定性。此外，甘蔗SSR擴增位點和同源高粱基因在染色上的數量分布基本一致，表明甘蔗單倍體基因組與高粱基因組具有較高的一致性（圖3）。這些SSR標記擴增位點在基因組上的位置及其同源基因在高粱基因組上的位置，在栽培種甘蔗高密度遺傳圖譜構建過程中，可作為錨定標記為同源連鎖群的劃分提供參考。

2.4 ?割手密和甘蔗單擴增標記在禾本科作物基因組中的特異性

為進一步驗證割手密和甘蔗單擴增標記的基因組特異性，在水稻、玉米和高粱基因組中對這些標記進行e-PCR檢測，結果表明，割手密單基因組SSR和雙基因組SSR中特異性SSR分別占95.24%（1303）和76.53%（150），甘蔗單基因組SSR和雙基因組SSR中特異性SSR分別為95.49%（1356）和87.10%（540）。這些單擴增SSR標記在3個禾本科作物基因組中擴增位點數排序為：高粱>玉米>水稻（圖4），這可能和割手密、甘蔗與其他禾本科作物的親緣關系遠近有關。其中割手密單擴增SSR標記Sspon8B0134，甘蔗單擴增標記sh030317和sh020847在水稻、玉米和高粱基因組中均能單位點擴增，推測這幾個位點可能是禾本科作物進化過程中的保守位點。

3 ?討論

栽培種甘蔗來源于大約8000年前多倍體甘蔗熱帶原種（Saccharum officinarum L.， 2n=8x= 80， x=10）和多倍體野生種割手密（2n=5x=40～16 x=128）種間的一系列雜交、回交事件[24-25]，這導致栽培種甘蔗基因組高度雜合非整倍體，染色體數目在100～150條之間，其中約80%的染色體來源于熱帶種，10%～15%來源于割手密，5%～10%來自于染色體重組[24-26]。栽培種甘蔗多倍體、非整倍體、種間雜交，同源或部分同源染色體多達10～12條的基因組結構制約著甘蔗遺傳圖譜的發(fā)展。栽培種甘蔗基因組過大，實現對10 Gb基因組的完全覆蓋難度大[2]，在圖譜構建過程中，遺傳距離較遠的標記很難連鎖上圖，造成大量的標記浪費;基因組高度同源，不同來源的遺傳成分混雜，很難在遺傳圖譜上得到區(qū)分，遺傳標記在基因組上的擴增位點過多，讀帶困難;遺傳標記有限且在基因組上分布不均勻，同一染色體上的標記分布在多條連鎖群上。

微衛(wèi)星序列或簡單重復序列是重要的通用標記來源，開發(fā)的SSR標記具有多態(tài)性高，重復性好、共顯性遺傳等特點，已廣泛的應用與甘蔗遺傳分析和遺傳改良實踐。本研究利用割手密基因組中具有1個等位位點基因在染色體上的不均勻分布（割手密基因組18.7%的基因具有1個同源等位基因）及其與高粱基因的同源性，開發(fā)了1564個單位點擴增SSR標記，還利用栽培種甘蔗嵌合單體中的基因信息與高粱基因的同源性，開發(fā)了1976個甘蔗SSR標記，進一步豐富了甘蔗的分子標記。前人利用不同分子標記對27個甘蔗商業(yè)種進行遺傳多樣性分析顯示，與RAPD標記（0.59～ 0.83）[27]，AFLP標記（0.40～0.73）[28]相比，甘蔗SSR標記的遺傳相似性范圍更廣（0.15～0.98）[29-30]，表明甘蔗SSR標記具有更高的檢測精度。

Singh等[30]利用甘蔗EST數據開發(fā)的361個SSR標記擴增結果表明，這些EST-SSR等位位點范圍為2～15個，平均每個EST-SRR檢測7.40個等位位點;Aitken等[9]利用40對AFLP標記對IJ76-514和Q165檢測表明，2個品種間的多態(tài)性條帶范圍為13～39。與這些標記相比，本研究開發(fā)的SSR標記擴增位點較少、特異性更高，并且定位于特定染色體上，這些標記的使用降低了帶型統(tǒng)計的難度，有助于進一步認識甘蔗基因組中來源于割手密部分的遺傳結構。

此外，本研究開發(fā)的標記中有1420個SSR標記為甘蔗特異性標記，在割手密基因組中無擴增位點，推測這部分標記可能是甘蔗基因組中來源于熱帶原種的部分。來源于甘蔗和割手密SSR標記在2個基因中的擴增情況，可用于區(qū)分栽培種甘蔗遺傳圖譜構建過程中的基因遺傳來源。且甘蔗SSR標記在甘蔗嵌合單倍體中的位置，及同源高粱基因在高粱基因組中的位置，為栽培種甘蔗遺傳圖譜構建中同源連鎖群的區(qū)分提供了重要的參考信息。

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