沉默重組蛋白2對NCI-H1688細胞的抑制作用及其Wnt/β連環(huán)蛋白信號通路機制

陳 艷，潘殿柱，劉 忠，馬艷梅，張 嵐

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸科，遼寧 錦州 121000)

T細胞淋巴瘤常見重排蛋白(frequently rearranged in advanced T-cell lymphomas，F(xiàn)rat)最早作為T細胞淋巴瘤原癌基因被發(fā)現(xiàn)，后來證實Frat為Wnt信號通路的重要組成部分。Frat包括Frat1和Frat2，研究[1-2]證實：Frat1通過Wnt信號通路在多種惡性腫瘤中發(fā)揮作用。張勇等[3]研究發(fā)現(xiàn)：Frat1在非小細胞肺癌組織中異常表達，其表達水平與肺癌細胞的侵襲和遷移等關(guān)系密切。Frat2也是Wnt信號通路的正向調(diào)節(jié)因子，但Frat2在肺癌中的作用尚不清楚。Wnt信號通路在小細胞肺癌細胞的增殖中發(fā)揮重要作用[4-5]，而Frat2主要通過Wnt信號通路發(fā)揮作用，故本研究對NCI-H1688細胞中Frat2的表達及沉默F(xiàn)rat2對NCI-H1688細胞增殖及Wnt信號通路的影響進行研究，探討Frat2對小細胞肺癌的可能作用機制。XAV939為 Wnt/β連環(huán)蛋白(β-catenin)信號通路抑制劑，可抑制 Wnt/β-catenin的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，本研究同時對NCI-H1688細胞給予XAV939處理，進一步驗證Frat2對小細胞肺癌的作用是否與 Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器人小細胞肺癌NCI-H1688細胞和正常支氣管上皮樣細胞HBE細胞(中國科學(xué)院上海細胞庫)。Frat2-siRNA慢病毒及陰性對照慢病毒(上海吉凱基因構(gòu)建制備)，逆轉(zhuǎn)錄(reverse transcription，RT)試劑盒、TRIzol試劑、聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)試劑盒和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國BPB公司)，Wnt信號通路抑制劑XAV939、胰蛋白酶、MTT試劑和DMEM培養(yǎng)基(美國Sigma公司)，鼠抗人Frat2單克隆抗體(貨號：SC-100437)、鼠抗人增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)單克隆抗體(貨號：SC-103214)、鼠抗人c-myc單克隆抗體(貨號：SC-100801)、鼠抗人細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)單克隆抗體(貨號：SC-100025)、鼠抗人β-catenin單克隆抗體(貨號：SC-100183)和鼠抗人磷酸化糖原合成酶激酶3(phosphorylated glycogen synthase kinase 3，pGSK-3β)單克隆抗體(貨號：SC-10427)(美國Invitrogen公司)。PCR擴增儀(美國Gibco公司)，流式細胞儀和酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 Western blotting法檢測NCI-H1688細胞和HBE細胞中Frat2蛋白表達水平取生長良好的NCI-H1688細胞和HBE細胞，加入蛋白裂解液裂解后， 12 000 r·min-1離心10 min，取上清液采用BCA法測定蛋白濃度，在SDS-PAGE凝膠中加入30 μg蛋白樣品，電泳、轉(zhuǎn)膜，加入封閉液封閉2 h，加入一抗：兔抗人Frat2單克隆抗體(1∶200)過夜孵育，加入含辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育1 h，ECL發(fā)光。以β-actin為內(nèi)參，實驗重復(fù)7次，采用凝膠電泳成像儀采集圖像，Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度值。Frat2蛋白表達水平以Frat2條帶灰度值/β-actin條帶灰度值比值表示。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-Time RT-qPCR)法檢測NCI-H1688細胞和HBE細胞中Frat2 mRNA表達水平取生長良好的NCI-H1688細胞和HBE細胞加入TRIzol裂解液充分裂解，加入氯仿震蕩15 s、靜止3 min，2 000 r·min-1離心10 min，吸取上層水相溶液、異丙醇沉淀，乙醇洗滌，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進行Real-Time RT-qPCR，以GAPDH為內(nèi)參。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性60 s，60℃變性30 s，60℃退火30 s，共42個循環(huán)。引物序列：Frat2，上游5′-GTGGCTTCTCACCGAATCCAG-3′，下游5′-AGTGACTGAGTCCGGTCCG-3′，擴增長度325 bp;GAPDH，上游5′-GAAGTGAAGGTCGGAGTCA-3′，下游5′-TTCACACCCATGACGAACAT-3′，擴增長度402 bp。每組實驗重復(fù)7次，以2-ΔΔCt法計算Frat2 mRNA表達水平。

1.4 細胞分組和慢病毒轉(zhuǎn)染將NCI-H1688細胞隨機分為空白對照組、陰性對照組、Frat2-siRNA組和Frat2-siRNA+XAV組?？瞻讓φ战M細胞不轉(zhuǎn)染，陰性對照組細胞轉(zhuǎn)染陰性對照慢病毒，F(xiàn)rat2-siRNA組細胞轉(zhuǎn)染Frat2-siRNA慢病毒，F(xiàn)rat2-siRNA+XAV組細胞轉(zhuǎn)染Frat2-siRNA慢病毒并同時加入4 μmol·L-1的Wnt信號通路抑制劑XAV939處理[5]。具體步驟：將各組NCI-H1688細胞洗滌，以5×104個/孔接種至6孔板中，吸出培養(yǎng)液上清后加入適量病毒液，使感染復(fù)數(shù)(MOI)為20，培養(yǎng)12 h，顯微鏡下觀察各組細胞生長情況，轉(zhuǎn)染4 d后檢測轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染效率高于90%時用于實驗。

1.5 轉(zhuǎn)染效果測定取上述穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的各組NCI-H1688細胞，采用Western blotting法和Real-Time RT-qPCR法測定各組NCI-H1688細胞中Frat2蛋白和mRNA表達水平，具體步驟同“1.2”和“1.3”。

1.6 MTT法檢測各組NCI-H1688細胞增殖活性將上述各組轉(zhuǎn)染后細胞接種到96孔板中，每孔1×104個細胞，培養(yǎng)24、48和72 h時分別在每孔細胞中加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸取培養(yǎng)液上清液，加入150 μL二甲基亞砜，震蕩反應(yīng)10 min，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定490 nm波長處吸光度(A)值，代表細胞增殖活性，每組實驗重復(fù)7次。

1.7 流式細胞術(shù)檢測各組不同細胞周期細胞百分率取上述轉(zhuǎn)染后各組NCI-H1688細胞，2 000 r·min-1離心10 min，棄去上清液，加入PBS液，調(diào)整細胞濃度為5×105mL-1，加入乙醇固定12 h，加入PBS液重懸細胞，加入碘化丙啶染色液孵育30 min，采用流式細胞儀檢測各組不同細胞周期NCI-H1688細胞百分率，每組實驗重復(fù)7次。

1.8 Western blotting法檢測各組NCI-H1688細胞中PCNA、c-myc、Cyclin D1、β-catenin和pGSK-3β蛋白表達水平取各組轉(zhuǎn)染后NCI-H1688細胞，采用Western blotting法測定各蛋白濃度，一抗分別為兔抗人PCNA單克隆抗體、兔抗人c-myc單克隆抗體、兔抗人Cyclin D1單克隆抗體、兔抗人β-catenin單克隆抗體和兔抗人pGSK-3β單克隆抗體。具體方法同“1.2”。

2 結(jié) 果

2.1 NCI-H1688細胞和HBE細胞中Frat2蛋白和mRNA表達水平NCI-H1688細胞中Frat2蛋白和mRNA表達水平明顯高于HBE細胞(P<0.01)。見表1和圖1。

表1 NCI-H1688細胞和HBE細胞中Frat2蛋白和mRNA表達水平

Lane 1：NCI-H1688 cells；Lane 2：HBE cells.

2.2 Frat2-siRNA轉(zhuǎn)染效果與空白對照組和陰性對照組比較，F(xiàn)rat2-siRNA組NCI-H1688細胞中Frat2蛋白和mRNA表達水平明顯升高(P<0.05)；與空白對照組比較，陰性對照組NCI-H1688細胞中Frat2蛋白和mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2和圖2。

表2 各組NCI-H1688細胞中Frat2蛋白和mRNA表達水平

2.3 各組NCI-H1688細胞增殖活性細胞培養(yǎng)24 h時，各組細胞增殖活性比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。細胞培養(yǎng)48和72 h時，與空白對照組和陰性對照組比較，F(xiàn)rat2-siRNA組和Frat2-siRNA+XAV組細胞增殖活性降低(P<0.05)；與Frat2-siRNA組比較，F(xiàn)rat2-siRNA+XAV組細胞增殖活性降低(P<0.05)；與空白對照組比較,陰性對照組細胞增殖活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

2.4 各組不同細胞周期NCI-H1688細胞百分率與空白對照組和陰性對照組比較，F(xiàn)rat2-siRNA組和Frat2-siRNA+XAV組細胞中G0/G1期細胞百分率明顯升高(P<0.05)，S期和G2/M期細胞細胞百分率明顯降低(P<0.05)；與Frat2-siRNA組比較，F(xiàn)rat2-siRNA+XAV組細胞中G0/G1期細胞百分率升高(P<0.05)，S期和G2/M期 細胞百分率降低(P<0.05)；與空白對照組比較，陰性對照組不同周期細胞百分率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4和圖3。

2.5 各組NCI-H1688細胞中PCNA、c-myc和Cyclin D1蛋白表達水平與空白對照組和陰性對照組比較，F(xiàn)rat2-siRNA組和Frat2-siRNA+XAV組細胞中PCNA、c-myc和Cyclin D1蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)；與Frat2-siRNA組比較，F(xiàn)rat2-siRNA+XAV組細胞中PCNA、c-myc和Cyclin D1蛋白表達水平進一步降低(P<0.05)；與空白對照組比較，陰性對照組細胞中PCNA、c-myc 和Cyclin D1蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表5和圖4。

表3 各組NCI-H1688細胞增殖活性

表4 各組不同細胞周期NCI-H1688細胞百分率

A: Blank control group;B: Negative control group; C:Frat2-siRNA group; D:Frat2-siRNA+XAV group.

表5 各組NCI-H1688細胞中PCNA、c-myc和Cyclin D1蛋白表達水平

Lane 1：Blank control group；Lane 2：Negative control group; Lane 3：Frat2-siRNA group; Lane 4：Frat2-siRNA+XAV group.

2.6 各組NCI-H1688細胞中β-catenin和pGSK-3β蛋白表達水平與空白對照組和陰性對照組比較，F(xiàn)rat2-siRNA組和Frat2-siRNA+XAV組細胞中β-catenin和pGSK-3β蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)；與Frat2-siRNA組比較， Frat2-siRNA+XAV組細胞中β-catenin和pGSK-3β蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)；與空白對照組比較，陰性對照組細胞中β-catenin和pGSK-3β蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表6和圖5。

表6 各組NCI-H1688細胞中β-catenin和pGSK-3β蛋白表達水平

3 討 論

小細胞肺癌雖占全部肺癌的比例較少，但其發(fā)展快，惡性程度高，在早期可發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，大部分患者確診時已有血行或淋巴轉(zhuǎn)移，自然病程比較短；小細胞肺癌雖對放化療比較敏感，但大部分患者治療后可出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[6]。因此探討小細胞肺癌的發(fā)生發(fā)展機制，對小細胞肺癌的診斷及治療具有重要意義。Frat位于第10號染色體長臂上，其主要功能是與GSK3結(jié)合，抑制GSK3對β-catenin的磷酸化，在wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起正向調(diào)節(jié)作用。Frat包括Frat1和Frat2，F(xiàn)rat1由279個氨基酸構(gòu)成，相對分子質(zhì)量為29 000；Frat2由233個氨基酸構(gòu)成，相對分子質(zhì)量為24 000。Frat1和Frat2有77%的氨基酸構(gòu)成相同，與GSK-3β結(jié)合區(qū)的氨基酸全部相同；Frat1和Frat2均為Wnt信號通路的正向調(diào)節(jié)因子[7]。目前關(guān)于Frat1在惡性腫瘤中作用的研究較多，如MiR-34a-3p靶向Frat1可改變腦膜瘤細胞的增殖和凋亡[8]；Frat1過表達可調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細胞的增殖[9]；沉默F(xiàn)rat1可抑制SGC7901人胃腺癌細胞增殖[10]；敲低Frat1可通過抑制肝細胞癌細胞中的Wnt /β-catenin信號通路抑制缺氧誘導(dǎo)的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[11]；沉默F(xiàn)rat1基因可通過下調(diào)β-catenin表達影響結(jié)腸癌HT-29細胞增殖和凋亡[12]；Frat1參與了前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過程[13]。關(guān)于Frat2的研究較少，STOOTHOFF 等[14]研究發(fā)現(xiàn)：Frat2與GSK-3β結(jié)合導(dǎo)致底物發(fā)生磷酸化從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。但Frat2在肺癌中的作用尚不清楚。本研究結(jié)果顯示：沉默F(xiàn)rat2后NCI-H1688細胞中Frat2表達水平降低，NCI-H1688細胞增殖活性降低，表明Frat2可能參與小細胞肺癌的發(fā)生發(fā)展過程。

Lane 1：Blank control group；Lane 2：Negative control group; Lane 3：Frat2-siRNA group; Lane 4：Frat2-siRNA+XAV group.

PCNA是DNA復(fù)制過程中所必需的蛋白，相對分子質(zhì)量為36 000，在細胞核中合成，在G0/G1期細胞中表達不明顯，在G1晚期細胞中表達水平增加，S期細胞中表達水平達高峰，G2/M期細胞中表達水平明顯降低，與DNA的變化一致，是細胞增殖狀態(tài)的標(biāo)志物之一[15-16]。c-myc為myc家族成員，既是一種可易位基因，也是一種可調(diào)節(jié)基因，可使細胞獲得永生化功能，使細胞無限增殖，促進細胞分裂，可決定細胞周期能否從G0/G1期向S期過渡，是一種細胞惡性的標(biāo)志物之一，與惡性腫瘤細胞的惡性增殖關(guān)系密切[17-18]。Cyclin D1為G1/S期特異性周期蛋白D1，屬于高度保守的細胞周期家族成員之一，主要功能為促進細胞增殖，其作用在于作為細胞周期蛋白依賴性激酶的調(diào)控者，結(jié)合并激活G1期細胞特有的周期蛋白依賴性激酶CDK4，磷酸化G1期周期抑制蛋白，使其從所結(jié)合的E2F上解離，推動細胞周期從G1期進入S期[19-20]。本研究結(jié)果顯示：沉默F(xiàn)rat2后NCI-H1688細胞中PCNA、c-myc和Cyclin D1蛋白表達水平降低，表明沉默F(xiàn)rat2可通過阻止G1期細胞向S期過渡進而抑制NCI-H1688細胞的增殖。

Wnt信號通路在惡性腫瘤細胞增殖中發(fā)揮重要作用，在肺癌的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮重要作用。β-catenin為Wnt信號通路的關(guān)鍵調(diào)控因子，Wnt信號通路在正常成熟細胞中處于關(guān)閉狀態(tài)，在病理狀態(tài)下，Wnt信號通路被激活，β-catenin去磷酸化，進入細胞核與T細胞因子(T cell factor,TCF)/淋巴增強因子(lymphoid enhancer factor,LEF)結(jié)合開啟下游的PCNA、c-myc和Cyclin D1等靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而抑制惡性腫瘤細胞的增殖[21-22]。pGSK-3β是Wnt通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，通過影響β-catenin參與調(diào)控細胞增殖和凋亡；經(jīng)典Wnt通路激活后抑制由GSK-3β和軸蛋白等組成的復(fù)合體中的GSK-3β磷酸化，避免β-catenin被泛素蛋白酶體識別及降解，并與TCF/LEF結(jié)合導(dǎo)致細胞增殖異常，從而促進惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展[23-24]。Wnt/β-catenin信號通路在肺癌細胞的增殖中發(fā)揮重要作用，且位于Frat2和Frat1與GSK-3β結(jié)合區(qū)的氨基酸全部相同，F(xiàn)rat2也可與GSK-3β結(jié)合發(fā)揮作用，進而調(diào)節(jié)Wnt信號通路，因此推測Frat2可能通過Wnt/β-catenin信號通路影響小細胞肺癌細胞的增殖。本研究結(jié)果顯示：沉默F(xiàn)rat2后NCI-H1688細胞中β-catenin和pGSK-3β蛋白表達水平降低；對NCI-H1688細胞給予Wnt信號通路抑制劑XAV939后，NCI-H1688細胞的增殖能力降低，細胞被阻止在G0/G1期，細胞中PCNA、c-myc、Cyclin D1、β-catenin和pGSK-3β蛋白水平降低，表明沉默F(xiàn)rat2及給予Wnt信號通路抑制劑處理均可抑制小細胞肺癌細胞增殖、阻止細胞周期進程、抑制Wnt/β-catenin信號通路激活。由此可見Frat2可能通過Wnt/β-catenin信號通路抑制NCI-H1688細胞增殖。

綜上所述，F(xiàn)rat2在小細胞肺癌NCI-H1688細胞中高表達，沉默F(xiàn)rat2可通過Wnt/β-catenin信號通路抑制NCI-H1688細胞增殖。Frat2有望成為小細胞肺癌治療的潛在靶點。