維生素D受體激活對小鼠膽管結(jié)扎所致肝纖維化的影響及其機制

楊 帆，李麗華

(錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細胞生物學(xué)教研室，遼寧 錦州 121000)

肝纖維化是一種世界范圍內(nèi)的高發(fā)病率的肝臟疾病，威脅患者生命。肝纖維化具有可逆性特征，因此肝纖維化的研究已經(jīng)成為近年來研究的熱點。肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)是肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)激活，激活的HSC釋放細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，導(dǎo)致ECM在肝內(nèi)累積，形成肝纖維化[1]。維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)是核激素受體超家族的一員,可被帕立骨化醇特異性激活。最近研究[2]表明: VDR可明顯降低HSC促纖維化因子膠原蛋白Ⅰ(collagen Ⅰ，Col Ⅰ) 的表達，緩解硫代乙酰胺導(dǎo)致的肝纖維化。VDR對膽總管結(jié)扎(bile duct ligation， BDL)導(dǎo)致的肝纖維化的作用機制尚不清楚。越來越多文獻[3]證明：在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，過量的氧自由基(reactive oxygen species，ROS)可以通過調(diào)節(jié)信號通路，激活HSC, 形成肝纖維化。VDR可以抑制線粒體膜電位，從而抑制ROS的產(chǎn)生，保護細胞免受氧化應(yīng)激損傷[4]。此外，研究[5]顯示：VDR激活過氧化物酶體增殖物激活受體-γ共激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1，PGC-1α)使線粒體沉默交配型信息調(diào)節(jié)3(silence mating type information regulation 3，Sirt3)表達水平升高，降低骨骼肌中的氧化應(yīng)激反應(yīng)。Sirt3屬于sirtuin家族，可調(diào)節(jié)線粒體蛋白的乙?；p少氧化應(yīng)激[6]。Sirt3還參與通過調(diào)控琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase，SDH)活性抑制HSC的激活，減輕肝纖維化[7]。本文作者探討激活的VDR通過調(diào)控Sirt3蛋白表達對BDL導(dǎo)致肝纖維化的影響，為其臨床治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器SPF級C57BL/6小鼠60只，體質(zhì)量22～25 g，7～8周齡，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2016-0006。小鼠在標準環(huán)境下飼養(yǎng), 飲食自由。帕立骨化醇粉末 (美國Sigma公司)，HE染色試劑盒(北京索萊寶)，二氫乙啶(dihydroethidium，DHE)染色試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，天狼猩紅(Sirus red)試劑盒(北京索萊寶公司)，Sirt3抗體和Col Ⅰ抗體(美國Abcam公司)，8-羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶1(8-oxoguanine DNA glycosylase 1,OGG1)抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶 (glyceraldehyde-3 -phosphate dehydrogenase，GADPH)抗體、α-平滑肌蛋白(alpha-smooth muscle，α-SMA)抗體和肌動蛋白β(beta actin，β-actin)抗體及HRP標記羊抗兔二抗和HRP標記羊抗鼠二抗均購買自美國Proteintech公司， ECL顯影液(美國Bio-Rad公司)。ECL發(fā)光成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司),Thermo Multisan MK3酶標儀(美國Thermo公司)，Olympus BX-53型顯微鏡和Olympus DP-73倒置熒光顯微鏡均購自日本Olympus公司。

1.2 實驗動物分組和藥品配制60只C57BL/6小鼠隨機分為假手術(shù)組、假手術(shù)后給藥組、模型組和治療組，每組15只。實驗中動物飼養(yǎng)及使用均符合錦州醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會要求。將帕立骨化醇粉末溶于60%的丙二醇溶液中，存儲于-80℃冰箱。腹腔注射使用的溶液需要進一步用生理鹽水稀釋。根據(jù)有關(guān)文獻[8]將帕立骨化醇的小鼠劑量確定為200 ng·kg-1。

1.3 BDL模型制備和用藥小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周進行實驗。所有小鼠術(shù)前8 h禁食，手術(shù)時室內(nèi)溫度保持在25℃左右。腹腔注射戊巴比妥鈉(65 mg·kg-1)麻醉小鼠，乙醇消毒皮膚。模型組小鼠從劍突到恥骨聯(lián)合進行腹部正中切口，暴露膽總管，雙線結(jié)扎膽總管并中間離斷，腹部縫合。假手術(shù)組和假手術(shù)后給藥組小鼠除雙線結(jié)扎膽管并中間離斷外，其他手術(shù)過程均與模型組小鼠相同。假手術(shù)后給藥組和治療組小鼠在手術(shù)前3 d腹腔注射200 ng·kg-1帕立骨化醇溶液，每周3次，觀察小鼠狀態(tài)。手術(shù)結(jié)束后恢復(fù)性飼養(yǎng)，治療組小鼠繼續(xù)注射帕立骨化醇，于手術(shù)后的第5天取材。

1.4 HE染色觀察小鼠肝組織病理形態(tài)表現(xiàn)用4%多聚甲醛固定小鼠肝組織，梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后切片，石蠟烤片60℃過夜，二甲苯脫蠟梯度酒精復(fù)水后進行HE染色，顯微鏡下拍照，觀察小鼠肝組織病理形態(tài)表現(xiàn)。依據(jù)《病毒性肝炎防治方案》[9], 將肝纖維化程度分為S0～S4期。S0期：匯管區(qū)無或輕微炎癥，無纖維增生；S1期：匯管區(qū)輕微炎癥、匯管區(qū)及中央靜脈纖維化;S2期:匯管區(qū)炎癥較輕，但其周圍有纖維化并有纖維間隔形成；S3期：匯管區(qū)炎癥較重、纖維間隔形成，無肝硬化；S4期：匯管區(qū)炎癥嚴重, 假小葉形成。

1.5 天狼猩紅染色觀察小鼠肝組織纖維化程度冰凍切片恢復(fù)至室溫，4%多聚甲醛固定組織, 用1×PBS洗滌3次, 每次5 min。天狼猩紅染液染30 min。無水乙醇直接脫水，二甲苯透明后中性樹膠封片。熒光顯微鏡下觀察, 并采用圖像分析系統(tǒng)進行分析。

1.6 DHE染色檢測小鼠肝組織中ROS水平用4%多聚甲醛固定組織，30%蔗糖脫水，組織切片8 μm，4% 多聚甲醛固定組織15 min, 用1×PBS洗15 min，滴入DHE染液后37℃孵育30 min； 隨后切片再用1×PBS洗滌3次, 每次5 min, 熒光顯微鏡下觀察組織切片，并用Image J軟件分析紅色熒光強度，代表ROS水平。

1.7 Western blotting法檢測小鼠肝組織中Sirt3、OGG1、α-SMA和Col Ⅰ蛋白表達水平取小鼠肝組織0.02 g，加入200 μL蛋白裂解液，冰上充分勻漿裂解, 提取總蛋白液。BCA法進行蛋白定量，取約30 μg蛋白進行10% SDS-PAGE電泳，90 V恒壓濕轉(zhuǎn)90 min，10% BSA封閉2 h。 一抗 (Sirt3、OGG1、α-SMA、Col Ⅰ均為1∶1 000稀釋) 4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次5 min。室溫下二抗孵育2 h，TBST洗滌后ECL顯影，暗室曝光。用Image J軟件進行灰度值分析,目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參照條帶灰度值比值代表目的蛋白表達水平。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠肝組織病理形態(tài)表現(xiàn)和纖維化程度HE染色結(jié)果顯示：假手術(shù)組和假手術(shù)后給藥組小鼠肝細胞排列整齊, 無炎性細胞浸潤，無膽管增生；模型組小鼠肝組織炎性細胞浸潤增多, 膽管明顯增生；與模型組比較，治療組小鼠肝組織炎性細胞浸潤減少，肝組織壞死灶明顯縮小(圖1，見插頁二)。天狼猩紅染色結(jié)果顯示：假手術(shù)組和假手術(shù)后給藥組小鼠肝組織無紅色膠原纖維樣物質(zhì)圍繞在膽管和大的靜脈周圍；與假手術(shù)組和假手術(shù)后給藥組比較，模型組小鼠肝組織纖維化嚴重，在肝組織匯管區(qū)周圍有大量紅色膠原樣纖維物質(zhì)沉積；與模型組比較，治療組小鼠肝組織匯管區(qū)及其大膽管周圍紅色纖維樣物質(zhì)明顯減少，纖維化程度減輕(圖2，見插頁二)。

依據(jù)《病毒性肝炎防治方案》[9]，結(jié)合HE染色，將肝纖維化程度分為S0～S4期。假手術(shù)組和假手術(shù)后給藥組S0期和S1期肝纖維化小鼠所占百分率總和高于模型組；模型組S4期肝纖維化小鼠所占百分率為53.3%，治療組S4期肝纖維化小鼠所占百分率為6.6%，模型組S4期肝纖維化小鼠所占百分率遠高于治療組小鼠，肝纖維化嚴重。見表1。

表1 各組小鼠肝纖維化程度分期

2.2 各組小鼠肝組織中ROS水平DHE可以判斷細胞中ROS水平[10]。假手術(shù)組和假手術(shù)后給藥組小鼠匯管區(qū)及大膽管周圍紅色熒光弱；與假手術(shù)組和假手術(shù)后給藥組比較，模型組小鼠肝組織大膽管周圍及其匯管區(qū)紅色熒光增強，ROS水平升高；與模型組比較，治療組小鼠肝組織膽管周圍紅色熒光強度弱，ROS水平降低。見圖3(插頁三)。

2.3 各組小鼠肝組織中Sirt3、OGG1、α-SMA和Col Ⅰ蛋白表達水平與假手術(shù)組和假手術(shù)后給藥組比較，模型組小鼠肝組織中Sirt3蛋白表達水平明顯降低(P<0.05), OGG1、α-SMA和Col Ⅰ蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，治療組小鼠肝組織中Sirt3蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，OGG1、α-SMA和Col Ⅰ蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。見圖4和表2。

Lane 1: Sham operation group;Lane 2: Sham operation+paricalcitol group;Lane 3,4: Model group; Lane 5,6: Treatment group.

表2 各組小鼠肝組織中Sirt3、OGG1、α-SMA和Col Ⅰ蛋白表達水平

3 討 論

肝纖維化是一種發(fā)生于肝臟的炎癥反應(yīng)，多種疾病[11-12]均可導(dǎo)致肝纖維化。肝纖維化的過程涉及HSC的激活, α-SMA和Col Ⅰ是HSC激活的標志物[13-14]。正常的HSC處于靜息狀態(tài)，肝損傷時會激活HSC，HSC轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，后者釋放大量ECM[1]，ECM過度沉積，導(dǎo)致肝纖維化。膽汁淤積會導(dǎo)致肝細胞損傷，損傷持續(xù)性存在可激活HSC,形成肝纖維化。VDR具有抗肝纖維化作用。DING等[15]研究發(fā)現(xiàn)：VDR可降低HSC中轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)/Smad3 基因的表達，減輕肝纖維化；DURAN等[16]研究表明：重組人死骨片1(recombinant human sequestosome 1,rhSQSTM1)通過上調(diào)VDR抑制小鼠肝臟纖維化。然而，關(guān)于VDR抑制BDL導(dǎo)致的肝纖維化機制尚不清楚。隨著肝纖維化研究的深入，氧化應(yīng)激與肝纖維化的關(guān)系逐漸受到重視。氧化應(yīng)激造成過多ROS會刺激細胞引發(fā)脂質(zhì)過氧化，使細胞的結(jié)構(gòu)以及功能遭到破壞，造成肝細胞損傷及炎癥反應(yīng)，OGG1是氧化應(yīng)激的標志蛋白[14]，其表達水平變化可以反映機體的氧化應(yīng)激情況。QUE等[17]發(fā)現(xiàn)：ROS 會通過激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路，引發(fā)HSC的活化，導(dǎo)致肝纖維化。此外，VDR具有抗氧化應(yīng)激的作用，如VDR抑制肝臟缺血再灌注小鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)[18]；抑制多肽脯氨酰基順反異構(gòu)酶介導(dǎo)的線粒體氧化應(yīng)激來預(yù)防糖尿病內(nèi)皮功能障礙[19]；上調(diào)核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2 related factor 2,Nrf2)，抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞衰老[20]。然而，VDR是否通過調(diào)控BDL小鼠的氧化應(yīng)激緩解肝纖維化的情況尚不清楚。

VDR是核激素受體超家族的一員,可與帕立骨化醇特異性結(jié)合[21]。VDR與維生素D的活性形式結(jié)合后，從細胞質(zhì)進入細胞核，與維生素D受體反應(yīng)原件(vitamin D receptor elements,VDREs)結(jié)合，調(diào)控靶基因[22]。在肝臟中，VDR表達于肝非實質(zhì)細胞，如膽管上皮細胞、HSC和Kupffer細胞[23-25]。VDR在靜息HSC中表達量很高，而當HSC被激活時VDR表達量可降低。向激活的HSC中加入1,25 (OH)2-D3可刺激VDR的表達, 導(dǎo)致HSC趨于靜息狀態(tài)[2]。本研究結(jié)果顯示：與模型組比較，治療組小鼠肝組織中α-SMA和Col Ⅰ蛋白表達水平降低，表明激活的VDR可抑制HSC的激活。本研究中，HE染色和天狼猩紅染色顯示：與模型組比較，治療組小鼠肝損傷和纖維化程度明顯減輕；DHE染色結(jié)果顯示：與模型組比較，治療組小鼠肝組織DHE紅色熒光的強度較強。DHE可透過細胞膜進入細胞內(nèi)，并被細胞內(nèi)的ROS氧化，形成氧化乙啶；氧化乙啶可摻入染色體DNA中，產(chǎn)生紅色熒光[10]，根據(jù)紅色熒光的強度可以判斷細胞ROS水平。本研究結(jié)果表明：氧化應(yīng)激和肝纖維化有密切關(guān)聯(lián)，激活VDR可抑制氧化應(yīng)激導(dǎo)致的肝纖維化。

Sirt3是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (nicotinamide-adenine dinucleotide，NAD) 依賴的Ⅲ型組蛋白去乙?；?(histone deacetylase，HDAC),主要定位于細胞線粒體[26]。研究[5]顯示：VDR上調(diào)線粒體Sirt3蛋白的表達，抑制骨骼肌氧化應(yīng)激反應(yīng)。CHENARI等[27]研究發(fā)現(xiàn)：Sirt3抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，緩解肝硬化。但尚無文獻證明激活的VDR可以通過上調(diào)Sirt3蛋白抑制氧化應(yīng)激。研究[28-30]表明：Sirt3能直接與超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2,SOD2)的乙?；稽c結(jié)合,使SOD2去乙酰化,增加SOD2活性,形成重要的Sirt3-SOD2抗氧化通路 。此外，Sirt3刺激異檸檬酸轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸, 使NAD磷酸化水平和線粒體中還原氧化型谷胱甘肽的比例增加, 保護細胞免受氧化應(yīng)激的損傷[31]。本實驗結(jié)果顯示：Sirt3蛋白表達水平，BDL可導(dǎo)致小鼠肝組織中Sirt3蛋白表達水平降低，激活的VDR可以調(diào)Sirt3蛋白表達水平，同時降低OGG1表達，表明激活的VDR可抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，其機制是上調(diào)Sirt3蛋白。

本研究結(jié)果表明：在BDL小鼠模型中，激活的VDR通過上調(diào)Sirt3蛋白表達進而抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的肝纖維化。因此，VDR激活將為肝纖維化的治療提供一種新的思路。