刺五加果水提物和醇提物對小鼠的鎮(zhèn)靜催眠作用及其機制

王晶瑤，趙 巖，蔡恩博，祝洪艷，李平亞，劉金平

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院, 吉林 長春 130118; 2.吉林大學藥學院新藥研究室, 吉林 長春 130021)

睡眠是人體十分重要的生理功能。隨著社會競爭的加劇，人們的壓力越來越大，熬夜的人群數(shù)量逐年遞增，失眠已經(jīng)十分普遍。睡眠亞健康狀態(tài)嚴重地影響著人們的生活質(zhì)量和身體健康。近年來，隨著失眠患者數(shù)量的增多和人們自我保健意識的建立，鎮(zhèn)靜催眠藥的需求量已經(jīng)逐年增加。西醫(yī)的鎮(zhèn)靜催眠藥物存在較多不良反應，如依賴性、成癮性和戒斷癥狀等[1]，因而其應用受到限制。近年來研究[2]顯示：許多天然藥物(中藥復方、中藥提取物及中藥活性成分)具有良好的鎮(zhèn)靜催眠作用，而且不良反應少，具有良好的開發(fā)利用價值，現(xiàn)已經(jīng)成為尋找潛在天然鎮(zhèn)靜催眠藥物的重要選擇。

五加科(Araliaceae)藥用植物刺五加[Acanthopanaxsenticosu(Rupr.et Maxim.) Harms]，也稱為“西伯利亞人參”，別名五加參、刺拐棒，為多年生落葉灌木，其根、莖、葉、皮和果實均可入藥[3]。研究[4]顯示：刺五加含有多種活性成分，自身毒性弱且不良反應少，在全球醫(yī)學界的應用已得到廣泛關注。現(xiàn)代藥理學研究[5-12]表明：刺五加葉具有血小板聚集、抗炎和α-葡萄糖苷酶抑制活性，刺五加根具有抗疲勞作用，刺五加莖皮具有抗胃潰瘍作用，刺五加果具有抗疲勞和降血脂活性，但是關于刺五加資源的應用主要是集中在其根、莖和葉部分，而有關刺五加果的藥理作用報道較少，以刺五加果為原料開發(fā)的產(chǎn)品較早是以藥酒的形式出現(xiàn)，到目前為止以刺五加果為原料開發(fā)的產(chǎn)品多為刺五加果酒和飲料等[13]。有研究[14-16]顯示：刺五加果提取物中含有多種人體必需微量元素、全部必需氨基酸、葡萄糖和果糖等單寡糖以及皂苷、維生素C等多種對機體有益的成分。也有研究[17]顯示：刺五加果口服液具有延長戊巴比妥鈉睡眠時間、縮短戊巴比妥鈉睡眠潛伏期及協(xié)同閾下劑量戊巴比妥鈉催眠的功效，提示刺五加果具有鎮(zhèn)靜催眠的作用，但其作用機制尚不清楚。為促進刺五加果的開發(fā)和利用，本研究利用刺五加果水提物(Acanthopanaxsenticosusfruit water extract,ASF-WE)和刺五加果醇提物(Acanthopanaxsenticosusfruit alcohol extract,ASF-AE)與5-羥色氨酸(5-hydroxytryptophan，5-HTP)、氟馬西尼(flumazenil，F(xiàn)LU)的聯(lián)合給藥實驗、ASF-WE和ASF-AE改善對氯苯丙氨酸(parachloropheny lalanine，pCPA)誘導失眠小鼠的睡眠實驗及觀察小鼠腦內(nèi)海馬區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)水平的變化，初步考察ASF-WE和ASF-AE的鎮(zhèn)靜催眠機制，為以刺五加果為原料的保健食品和藥品的研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器

ICR雄性小鼠，體質(zhì)量18～22 g，由長春億斯實驗動物技術有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK (吉) 2016-0003。小鼠在標準實驗室條件下(溫度25℃±2℃，相對濕度60%±5%，12 h光/12 h暗循環(huán))飼養(yǎng)，飼養(yǎng)期間隨意飲水攝食；馴化1周后，將所有小鼠隨機分為不同實驗組。刺五加果實采自吉林農(nóng)業(yè)大學藥用植物園，經(jīng)韓忠明副教授鑒定為五加科五加屬刺五加的果實，陰干備用。地西泮(diazepam，DZP)由太原振興制藥有限公司提供，戊巴比妥鈉購于上海默克化工技術有限公司，F(xiàn)LU注射劑由海南靈康制藥有限公司生產(chǎn)， pCPA和5-HTP均購自大連美隆藥業(yè)有限公司，ELISA試劑盒購自南京建成生物工程研究所。JA2003J電子天平購于上海舜宇恒平科學儀器有限公司，Avanti TM J-3OI冷凍離心機購于海南赫敏儀器有限公司，Spectra MAX 190酶標儀購于上海美谷分子儀器有限公司，DY89-1電動玻璃勻漿機購于寧波新芝生物科技股份有限公司，ZZ-6小鼠自主活動測試儀購于成都泰盟軟件有限公司。

1.2 ASF-WE和ASF-AE的制備

ASF-WE：干燥的刺五加果樣品粉碎(過40目篩)，取200 g加蒸餾水浸泡過夜，10倍量蒸餾水100℃蒸煮3次，每次1 h，過濾，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮后置于水浴鍋60°C蒸發(fā)至稠膏，即得水提浸膏，得率為22.3 %，按照參考文獻[18]中方法，測定ASF-WE總黃酮含量為4.50 %，總皂苷含量為2.65 %。

ASF-AE：干燥的刺五加果樣品粉碎(過40目篩)，取200 g加95%乙醇浸泡過夜，10倍量95%乙醇超聲波輔助(頻率100 Hz，溫度30℃)提取3次，每次1 h，過濾，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮后置水浴鍋60℃蒸發(fā)至稠膏，即得醇提浸膏，得率為6.8%，按照參考文獻[18]中方法，測定ASF-AE總黃酮含量為6.21%，總皂苷含量為3.79%。

1.3 實驗動物分組及給藥

1.3.1 自主活動儀測定小鼠自主活動次數(shù) 雄性ICR小鼠120只，適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為空白對照組、陽性對照(DZP)組、不同劑量(4、8、16、32和64 mg·kg-1)ASF-WE組和不同劑量(4、8、16、32和64 mg·kg-1)ASF-AE組。藥物以蒸餾水配置成相應濃度的藥液，各給藥組小鼠每日灌胃給予相應劑量的藥物，給藥量為0.1 mL·10 g-1；空白對照組小鼠給予等體積的蒸餾水，每天1次，連續(xù)給藥5 d；DZP組小鼠灌胃給予等體積生理鹽水，連續(xù)給予4 d，第5天一次性灌胃給予3 mg·kg-1DZP，給藥量為0.1 mL·10 g-1。末次給藥30 min后，將各組小鼠放置于自主活動記錄儀中，先適應10 min，再開始記錄，記錄各組小鼠5 min內(nèi)的自主活動次數(shù)[19]。在每次測量結束時，用75%酒精徹底清洗自主活動記錄儀外殼，以避免對下一只小鼠活動產(chǎn)生影響。

1.3.2 測定ASF-WE和ASF-AE協(xié)同閾下劑量戊巴比妥鈉誘導小鼠睡眠實驗中小鼠入睡率 分組及給藥方法同“1.3.1”，末次給藥前8 h小鼠禁食不禁水，末次給藥30 min后，各組小鼠分別腹腔注射閾下劑量戊巴比妥鈉(使90%～100%小鼠翻正反射不消失的最大劑量，預實驗測定最大劑量為28 mg·kg-1)。在30 min內(nèi)小鼠翻正反射消失達到1 min以上者視為發(fā)生睡眠現(xiàn)象，記錄睡眠小鼠數(shù)量。

1.3.3 測定ASF-WE和ASF-AE協(xié)同催眠劑量戊巴比妥鈉誘導小鼠睡眠實驗中小鼠睡眠潛伏期和睡眠時間 分組及給藥方法同“1.3.1”，末次給藥前8 h禁食不禁水，末次給藥30 min后，各組小鼠分別腹腔注射催眠劑量戊巴比妥鈉(使100% 小鼠入睡最小劑量，預實驗測定最小劑量為48 mg·kg-1)。以小鼠從腹腔注射戊巴比妥鈉到翻正反射消失的這段時間作為睡眠潛伏期，而翻正反射消失至恢復的時間作為小鼠的睡眠時間[20]，觀察并記錄小鼠睡眠潛伏期和睡眠持續(xù)時間。

1.3.4 測定亞催眠劑量ASF-WE和ASF-AE與5-HTP協(xié)同誘導小鼠睡眠實驗中小鼠睡眠潛伏期和睡眠時間 ASF-WE和ASF-AE的亞催眠劑量為 8 mg·kg-1，由“1.3.1～1.3.3”實驗確定。雄性ICR小鼠40只，適應性飼養(yǎng)1周后隨機分為4組，每組10只，分別為空白對照組、5-HTP組、ASF-WE(8 mg·kg-1)+5-HTP組和ASF-AE(8 mg· kg-1)+5-HTP組。各組小鼠每日灌胃給予相應劑量的藥物，給藥量為0.1 mL·10 g-1，空白對照組和5-HTP組小鼠給予等體積蒸餾水，每天1次，連續(xù)給藥5 d。末次給藥前8 h禁食不禁水，末次給藥30 min后，除空白對照組外各組小鼠分別給予5-HTP(2.5 mg·kg-1，腹腔注射)，間隔15 min后，再給予各組小鼠催眠劑量的戊巴比妥鈉(48 mg·kg-1，腹腔注射)，觀察并記錄各組小鼠睡眠潛伏期和睡眠持續(xù)時間[21]。

1.3.5 測定催眠劑量ASF-WE和ASF-AE改善pCPA誘導的失眠小鼠睡眠實驗中小鼠睡眠潛伏期和睡眠時間 由“1.3.1～1.3.3”實驗確定ASF-WE和ASF-AE的催眠劑量為32 mg· kg-1。雄性ICR小鼠40只，適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為4組，每組10只，分別為空白對照組、pCPA組、ASF-WE(32 mg· kg-1)+pCPA組和ASF-AE(32 mg· kg-1)+pCPA組。ASF-WE+pCPA組和ASF-AE+pCPA組小鼠每日上午灌胃給予相應劑量藥物，每天1次，連續(xù)給藥5 d；下午腹腔注射pCPA(100 mg·kg-1)，每天1次，連續(xù)給藥4 d。pCPA組小鼠每日腹腔注射pCPA(100 mg·kg-1)，每天1次，連續(xù)給藥4 d；空白對照組小鼠給予等量蒸餾水，每天1次，連續(xù)給藥5 d；各組小鼠給藥量均為0.1 mL·10 g-1。末次給藥前8 h禁食不禁水，末次給藥30 min后，各組小鼠給予催眠劑量的戊巴比妥鈉(48 mg·kg-1，腹腔注射)，觀察并記錄各組小鼠睡眠潛伏期和睡眠持續(xù)時間[22]。

1.3.6 測定催眠劑量ASF-WE和ASF-AE改善FLU誘導的失眠小鼠睡眠實驗中小鼠睡眠潛伏期和睡眠時間 雄性ICR小鼠80只，適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分成8組，每組10只，分別為空白對照組、FLU組、DZP組、ASF-WE(32 mg·kg-1)組、ASF-AE(32 mg·kg-1)組、 DZP+FLU組、ASF-WE(32 mg·kg-1)+FLU組和ASF-AE(32 mg·kg-1)+FLU組。各給藥組小鼠每日灌胃給予相應劑量的藥物；空白對照組和FLU組小鼠給予等體積蒸餾水，每天1次，連續(xù)給藥5 d；DZP組小鼠灌胃給予等體積生理鹽水，連續(xù)給予4 d，第5天一次性灌胃給予DZP(3 mg·kg-1)；各組小鼠給藥量均為0.1 mL·10 g-1。末次給藥前8 h禁食不禁水，末次給藥30 min后，F(xiàn)LU組和各聯(lián)合給藥組小鼠分別腹腔注射FLU(8 mg·kg-1)，間隔15 min后，各組小鼠給予催眠劑量的戊巴比妥鈉(48 mg·kg-1，腹腔注射)，觀察并記錄各組小鼠睡眠潛伏期和睡眠持續(xù)時間。

1.3.7 ELISA法檢測各組小鼠大腦海馬組織中5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)和γ-氨基丁酸(γ-amino butyric acid,GABA)水平 行為學實驗后，立刻同一時間斷頸處死小鼠，在冰盤上解剖分離小鼠大腦海馬組織，用冰涼生理鹽水沖洗海馬組織，勻漿，4℃、12 000 r·min-1離心10 min，收集上清液，采用ELISA法并按照試劑盒說明書操作，檢測小鼠海馬組織中5-HT和GABA水平，盡量在同一時間同一條件下檢測。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 各組小鼠自主活動次數(shù)

與空白對照組比較，DZP組小鼠自主活動次數(shù)明顯減少(P<0.01)，32、64 mg·kg-1ASF-WE組和16、32、64 mg·kg-1ASF-AE組小鼠自主活動次數(shù)不同程度減少(P<0.05或P<0.01)，32 mg·kg-1ASF-WE組和32 mg·kg-1ASF-AE組小鼠自主活動次數(shù)明顯減少(P<0.01)。見表1。

表1 各組小鼠自主活動次數(shù)

2.2 戊巴比妥鈉誘導正常小鼠睡眠實驗中各組小鼠入睡率、睡眠潛伏期和睡眠時間

給予各組小鼠亞催眠劑量戊巴比妥鈉后，與空白對照組比較， 16、32、64 mg·kg-1ASF-WE組和8、16、32、64 mg·kg-1ASF-AE組小鼠入睡率有不同程度增加，且呈一定的劑量依賴性。見表2。當給予各組小鼠催眠劑量戊巴比妥鈉后，與空白對照組比較，16、32、64 mg·kg-1ASF-WE組和16、32、64 mg·kg-1ASF-AE組小鼠睡眠潛伏期縮短(P<0.05或P<0.01)，睡眠持續(xù)時間延長(P<0.05或P<0.01)，且呈一定的劑量依賴性。32 mg·kg-1ASF-WE組和32 mg· kg-1ASF-AE組小鼠入睡潛伏期明顯縮短(P<0.01)，小鼠睡眠時間明顯延長(P<0.01)，故確定該劑量為催眠劑量；而ASF-WE和ASF-AE在8 mg·kg-1劑量以下各組小鼠，無論是睡眠潛伏期還是睡眠時間均無明顯改變，故確定該劑量為亞催眠劑量。見表3。

表2 給予亞催眠劑量戊巴比妥鈉后各組小鼠入睡率

表3 催眠劑量戊巴比妥鈉誘導小鼠睡眠實驗中各組小鼠睡眠潛伏期和睡眠時間

2.3 5-HTP誘導小鼠睡眠實驗中各組小鼠睡眠潛伏期和睡眠時間

為了確定ASF-WE和ASF-AE的催眠作用是否與5-HT能神經(jīng)系統(tǒng)有關，分別采用亞催眠劑量(8 mg·kg-1)ASF-WE和ASF-AE與亞有效劑量5-HTP(2.5 mg· kg-1)進行聯(lián)合給藥實驗，結果顯示：與空白對照組和5-HTP組比較，ASF-WE+5-HTP組和ASF-AE+5-HTP組小鼠睡眠潛伏期明顯縮短(P<0.01)，睡眠時間明顯延長(P<0.01)。見表4。

表4 5-HTP誘導小鼠睡眠實驗中各組小鼠睡眠潛伏期和睡眠時間

2.4 pCPA誘導失眠小鼠睡眠實驗中各組小鼠睡眠潛伏期和睡眠時間

與空白對照組比較， pCPA組小鼠睡眠潛伏期明顯延長(P<0.01)，睡眠時間明顯縮短(P<0.01)，表明失眠模型成功建立。與pCPA組比較， ASF-WE+pCPA組和ASF-AE+pCPA組小鼠睡眠潛伏期明顯縮短(P<0.05)，睡眠時間明顯延長(P<0.01)。見表5。

表5 pCPA誘導失眠小鼠睡眠實驗中各組小鼠睡眠潛伏期和睡眠時間

2.5 FLU誘導失眠小鼠睡眠實驗中各組小鼠睡眠潛伏期和睡眠時間

與空白對照組比較，F(xiàn)LU組小鼠睡眠潛伏期明顯延長(P<0.01)，睡眠時間明顯縮短(P<0.05)；與FLU組比較，DZP+FLU組、ASF-WE+FLU組和ASF-AE+FLU組小鼠睡眠潛伏期明顯縮短(P<0.05或P<0.01)，睡眠潛伏期明顯延長(P<0.01)；與DZP組比較，DZP+FLU組小鼠睡眠潛伏期明顯延長(P<0.05)，睡眠時間明顯縮短(P<0.01)。與ASF-WE組比較，ASF-WE+FLU組小鼠睡眠潛伏期明顯延長(P<0.05)，睡眠時間明顯縮短(P<0.01)。與ASF-AE組比較，ASF-AE+FLU組小鼠睡眠潛伏期雖有延長，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而睡眠時間明顯縮短(P<0.01)。見表6。

表6 FLU誘導失眠小鼠睡眠實驗中各組小鼠睡眠潛伏期和睡眠時間

2.6 各組小鼠海馬組織中5-HT和GABA水平

與空白對照組比較，5-HTP(2.5 mg·kg-1)組、ASF-WE(8 mg·kg-1)組和ASF-AE(8 mg·kg-1)組小鼠海馬組織中5-HT水平無明顯變化(P>0.05)；與5-HTP組比較，ASF-WE+5-HTP組和ASF-AE+5-HTP組小鼠海馬組織中5-HT水平明顯升高(P<0.05)。見圖1A。

與空白對照組比較，pCPA(100 mg·kg-1)組小鼠海馬組織中5-HT水平明顯降低(P<0.05)；與pCPA組比較，ASF-WE(32 mg·kg-1)+pCPA組和ASF-AE(32 mg·kg-1)+pCPA組小鼠海馬組織中5-HT水平明顯升高(P<0.05或P<0.01)。見圖1B。

與空白對照組比較，ASF-WE(32 mg·kg-1)組和ASF-AE(32 mg·kg-1)組小鼠海馬組織中GABA水平明顯升高(P<0.05)；與ASF-WE組和ASF-AE組比較，ASF-WE+FLU組和ASF-AE+FLU組小鼠海馬組織中GABA水平均明顯降低(P<0.05)。見圖1C。

A: 5-HT level (*P<0.05 vs blank control group; △P<0.05 vs 5-HTP group); B:5-HT level(*P<0.05, **P<0.01 vs blank control group; △P<0.05, △△P<0.01 vs pCPA group);C: GABA level(*P<0.05 vs blank control group; △P<0.05 vs ASF-WE group;#P<0.05 vs ASF-AE group).

3 討 論

本文作者通過小鼠自主活動實驗、激動劑拮抗劑聯(lián)合給藥實驗及對海馬區(qū)相關神經(jīng)遞質(zhì)影響實驗，評價ASF-WE和ASF-AE的鎮(zhèn)靜催眠活性，并探討了其初步作用機制。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性降低時，小鼠自主活動將減弱，小鼠的自主活動性通常作為評價試驗藥物是否具有鎮(zhèn)靜作用的指標[23]。戊巴比妥鈉誘導睡眠實驗以小鼠入睡率、入睡潛伏期和睡眠持續(xù)時間作為評價試驗藥物與戊巴比妥鈉的協(xié)同催眠作用效應指標[24]。本研究結果表明：ASF-WE和ASF-AE均能明顯減少小鼠自主活動次數(shù)，提高催眠劑量戊巴比妥鈉誘導睡眠的小鼠入睡率，縮短小鼠入睡潛伏期，延長睡眠持續(xù)時間，發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠作用，并且ASF-AE的鎮(zhèn)靜催眠作用一定程度上優(yōu)于ASF-WE。研究[25]顯示：刺五加中的異嗪皮啶可能是其發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠作用的主要有效成分，而異嗪皮啶作為香豆素類有機小分子，更易溶于乙醇而難溶于水，這可能是刺五加果在鎮(zhèn)靜催眠方面ASF-AE優(yōu)于ASF-WE的原因之一。

腦內(nèi)有多種中樞神經(jīng)遞質(zhì)參與個體的精神活動，其中5-HT是調(diào)節(jié)機體睡眠的主要神經(jīng)遞質(zhì)之一，直接或間接地參與睡眠-覺醒系統(tǒng)的功能。5-HTP可以在5-羥色胺脫羧酶作用下產(chǎn)生5-HT，提高腦組織中5-HT水平，研究[26]證實：小鼠注射5-HTP后腦組織中5-HT水平明顯升高，可緩解失眠癥狀，提高睡眠質(zhì)量。而pCPA是色氨酸羥化酶的抑制劑，可阻斷5-HT的合成，降低5-HT水平，從而縮短小鼠的睡眠時間[27]。本研究結果顯示：亞催眠劑量的ASF-WE和ASF-AE均可與5-HT前體物質(zhì)5-HTP發(fā)揮協(xié)同作用，使小鼠海馬組織中5-HT水平升高，進而促進小鼠的睡眠；進一步結合刺五加果提取物可改善由pCPA引起的小鼠失眠現(xiàn)象的實驗結果推測：ASF-WE和ASF-AE的鎮(zhèn)靜催眠作用與5-HT能神經(jīng)系統(tǒng)有密切關聯(lián)，其機制尚待進一步深入研究。

除5-HT外，GABA是與調(diào)節(jié)睡眠相關的另一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)。作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)最重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，GABA維持著腦內(nèi)興奮抑制的平衡，其水平低下時會導致其腦內(nèi)抑制功能不足，引起頭痛、焦慮、緊張不安和暴躁易怒等[28]。GABA可通過與GABA A型受體(GABAA)結合，導致大量Cl-內(nèi)流，引起細胞膜超極化使神經(jīng)元興奮性降低，發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠作用[29]。DZP作為一種具有代表性的鎮(zhèn)靜催眠藥，通過與GABAA-苯二氮卓類(BZD)受體結合釋放GABA，調(diào)節(jié)睡眠；相反，F(xiàn)LU作為一種特異性BZD拮抗劑，能有效誘導小鼠失眠[30]。本研究結果表明：FLU可抑制ASF-WE和ASF-AE的催眠作用，并可阻斷其對小鼠海馬組織中GABA水平的提升作用，說明ASF-WE和ASF-AE的鎮(zhèn)靜睡眠作用與GABA能系統(tǒng)也有密切關聯(lián)。

綜上所述，ASF-WE和ASF-AE均有良好的鎮(zhèn)靜催眠效果，并初步推測其鎮(zhèn)靜催眠作用與5-HT能和GABA能中樞神經(jīng)系統(tǒng)有關。本研究為促進刺五加果的開發(fā)，實現(xiàn)刺五加資源的綜合利用提供了科學依據(jù)。