大鯢肽醬香酒酶解工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究

陳 娟 ，喻仕瑞 ，朱思潔，余 宙，晏和運，石美美，劉 飛，李金凡

（1.茅臺學(xué)院食品科學(xué)與工程系，貴州仁懷 564501；2.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西南昌 330006）

大鯢（Andrias davidianus）俗稱娃娃魚，是我國二級水生野生保護動物名錄[1]，是一種名貴藥用動物，營養(yǎng)價值高并具有活性功能，大鯢的氨基酸營養(yǎng)價值較甲魚、鮑魚、燕窩和魚翅都高[2]，并具有抗衰老[3]、抗菌[4]、抗疲勞[5]、抗皮膚光老化[6]、增強免疫[7]等保健功效，大鯢肌肉、內(nèi)臟、骨骼、表皮及分泌物均可入藥[8]。貴州屬于典型的卡斯特地貌地區(qū)，山泉溶洞特多，水質(zhì)清澈富含礦物質(zhì)，特別適合娃娃魚的養(yǎng)殖繁殖，貴州有多個大鯢養(yǎng)殖基地。與野生大鯢相比，貴州人工養(yǎng)殖子二代大鯢的肌肉營養(yǎng)成分與野生大鯢相當[9]。人工養(yǎng)殖大鯢在醫(yī)療保健行業(yè)的具有潛在應(yīng)用價值和發(fā)展前景[10]。

中國大鯢作為我國重要的功能性食品原料之一，在營養(yǎng)保健食品工業(yè)有潛在的應(yīng)用價值[11]。研究表明，大鯢多肽具有良好的抗氧化活性[12-15]，不同來源的蛋白肽具有解酒或者預(yù)防酒精性肝損傷的作用[16-18]，市面上也有動物源肽保健酒產(chǎn)品，如蛇肽酒[19]、甲魚多肽酒[20]，醬香型白酒為純糧釀造并具有獨特風(fēng)味的，受到越來越多消費者的喜愛，并且醬香型白酒中的某些風(fēng)味成分本身就具有生理活性，如抗氧化[21]、抗炎癥[22]、抗癌[23]等。

本研究以貴州特色資源養(yǎng)殖大鯢和醬香型白酒為原料，制備抗氧化大鯢肽醬香酒。對酸水解、泡制處理、酶水解三種預(yù)處理方法進行比較，選出最佳預(yù)處理工藝后，在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面試驗對其酶解工藝條件進行優(yōu)化，篩選抗氧化活性高的最佳酶解工藝條件，為大鯢深加工的研究和應(yīng)用及醬香保健酒的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大鯢（Andrias davidianus）：貴州正安縣鸚鵡鎮(zhèn)大鯢養(yǎng)殖基地；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：美國Sigma公司；胰蛋白酶（5萬U/g）、堿性蛋白酶（20萬U/g）、胃蛋白酶（1 200 U/g）、木瓜蛋白酶（酶活力6 000 U/g）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；中性蛋白酶（20萬U/g）、牛血清蛋白標準品（純度≥98.0%）、福林酚：合肥博美生物有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TDL-80-2B離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；PHS-3C精密pH計：上海日島科學(xué)儀器有限公司；755紫外可見分光光度計：上海棱光技術(shù)有限公司；Labogene真空冷凍干燥機：上海帝博思生物科技有限公司；DK-98-II水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；ME240E電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；TDL-80-2B離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 大鯢肽醬香酒預(yù)處理

（1）酸水解法

稱取大鯢肉10 g→清洗→剁碎→按料液比1∶4（g∶mL）加2.5%或5.0%鹽酸40 mL→100 ℃水解9 h→1 mol/L NaOH中和至pH=7（邊攪拌，邊緩慢加入）→離心（4 000 r/min）→上清液冷凍干燥（-40 ℃、22 h）→大鯢凍干粉→按1∶100比例添加醬香型白酒→澄清（4 000 r/min離心10 min）→大鯢肽醬香酒

（2）泡制處理

稱取大鯢肉10 g→清洗→剁碎→按照料液比1∶10（g∶mL）加53%vol醬香型白酒→浸泡30 d→澄清（4 000 r/min離心10 min）→大鯢肽醬香酒

（3）酶水解法

稱取大鯢肉10 g→按照料液比1∶4（g∶mL）加水→調(diào)節(jié)pH→加入不同酶制劑→恒溫酶解→沸水浴滅酶10 min→離心（4 000 r/min）→上清液冷凍干燥（-40 ℃、22 h）→大鯢凍干粉→與醬香型白酒一定比例調(diào)配→澄清（4 000 r/min離心10 min）→大鯢肽醬香酒

酶制劑的種類和酶解條件見表1。

表1 蛋白酶的水解條件Table1 Enzymolysis conditions of proteases

1.3.2 大鯢肽醬香酒酶解工藝優(yōu)化單因素試驗

選擇最適蛋白酶，設(shè)定料液比（1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6（g∶mL））、酶添加量（4 000 U/g、5 000 U/g、6 000 U/g、7 000、8 000 U/g）、酶解時間（2 h、3 h、4 h、5h、6 h）、酶解溫度（45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃）、pH值（2 h、3 h、4 h、5 h、6 h）5個因素進行單因素試驗。以DPPH·清除率和多肽含量為考察指標，研究酶解工藝各因素對大鯢肽醬香酒抗氧化活性的影響。

1.3.3 大鯢肽醬香酒酶解工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以大鯢肽醬香酒DPPH·清除率（Y）為響應(yīng)值，選擇酶添加量（A）、酶解時間（B）、酶解溫度（C）及酶解pH（D）為自變量，進行4因素3水平Box-Behnken試驗，Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平見表2。

表2 酶解工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiments design for hydrolysis conditions optimization

1.3.4 大鯢肽醬香酒理化指標的測定

（1）多肽含量的測定[21]

牛血清蛋白標準曲線的繪制：配制20 mg/mL牛血清蛋白對照品溶液，精密移取對照液0.05 mL、0.10 mL、0.15 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL加入具塞試管中，分別加水至1 mL，再加堿性銅試液1 mL，放置10 min。再逐管加入0.5 mL福林酚試劑，立即混勻，30 min后于波長650 nm處測定吸光度值。以牛血清蛋白質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為橫坐標，繪制牛血清蛋白標準曲線，得標準曲線回歸方程y=0.239 9x+1.533 0，相關(guān)系數(shù)R2為0.992 9，按照標準曲線回歸方程計算樣品中多肽含量。

（2）理化指標的測定

根據(jù)中國酒業(yè)協(xié)會發(fā)布的T/CBJ 5102—2019《保健酒》，保健酒中的理化指標有酒精度、甲醇和氰化物，測定方法分別參照國標GB 5009.225—2016《食品安全國家標準酒中乙醇濃度的測定》，GB 5009.266—2016《食品安全國家標準食品中甲醇的測定》和GB 5009.36—2016《食品安全國家標準食品中氰化物的測定》。

1.3.5 大鯢肽醬香酒抗氧化活性測定

（1）DPPH自由基清除率測定

參照青維等[24]的方法略作修改，取2.0 mL樣品液，加2 mL濃度為0.2 mmol/L的DPPH自由基溶液，振蕩均勻，避光反應(yīng)30 min，離心取上清液，于波長517 nm處測吸光度值A(chǔ)i，取2.0 mL樣品液，加2 mL體積分數(shù)95%乙醇，測其吸光度值A(chǔ)j，以2 mL去離子水加入2 mL DPPH自由基溶液，作為對照組，測量其吸光度值A(chǔ)0。以維生素C（vitamin C，VC）為陽性對照，DPPH自由基清除率按以下公式計算：

式中：Ai為樣品+DPPH自由基的吸光度值；Aj為樣品+體積分數(shù)95%乙醇的吸光度值；A0為DPPH自由基+去離子水的吸光度值。

（2）羥自由基（·OH）清除率測定

取1.5 mmol/L 1，10-菲羅啉溶液1.5 mL置入試管中，加入pH 7.4 0.5 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液（hosphate buffered solution，PBS）2 mL和1 mL待測液，再加入1 mL 硫酸亞鐵溶液混勻，0.1%H2O2溶液1 mL，37 ℃水浴1 h，在波長536 nm條件下測定其吸光度值，以VC為陽性對照，羥自由基（OH·）清除率按以下公式計算：

式中：Ai為有樣品和H2O2測得吸光度值；As為無樣品，有H2O2測得吸光度值（用1 mL蒸餾水代替待測液）；A0為無樣品和H2O2的吸光度值（用蒸餾水替代待測液和H2O2）。

（3）鐵離子還原力測定

取待測液1 mL于試管中，依次加入（0.2 mol/L，pH=6.6）磷酸緩沖液和1%鐵氰化鉀各2.5 mL，于50 ℃水浴鍋中水浴20 min，冷卻后加入2.5 mL10%三氯乙酸溶液。上述溶液以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心10 min，取上清液5 mL，再加入蒸餾水4.0 mL和0.1%三氯化鐵1.0 mL，混勻，靜置10 min，在波長700 nm條件下測定其吸光度值A(chǔ)700nm，以VC為陽性對照，吸光度值A(chǔ)700nm越大表明其還原力即抗氧化性越強[25]。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

試驗設(shè)3次重復(fù)，采用SPSS19.0進行數(shù)據(jù)處理與分析，結(jié)果以“平均值±標準差”表示。采用Design Expert 10.0.4進行響應(yīng)面試驗的設(shè)計和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同預(yù)處理方式對大鯢肽醬香酒抗氧化活性的影響

通過DPPH·清除率和多肽含量兩個評價指標比較不同預(yù)處理對大鯢肽醬香酒抗氧化活性的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 不同預(yù)處理方法對DPPH·清除率和多肽含量的影響Fig.1 Effects of different pretreatment methods on DPPH radical scavenging rates and polypeptide contents

由圖1可知，酶解處理組的DPPH·清除率與多肽含量高于鹽酸水解組和未處理組；酶解組中DPPH·清除率最高（73.32%）的是木瓜蛋白酶組，其次為堿性蛋白酶組（64.13%）；胰蛋白酶組多肽含量最高（15.95 mg/mL），木瓜蛋白酶組次之（14.10 mg/mL）。

值得注意的是，多肽含量最高（15.95 mg/mL）的胰蛋白組DPPH·清除率較低（58.47%），其他組數(shù)據(jù)也顯現(xiàn)出酶解產(chǎn)物多肽含量與其清除自由基的能力不成正相關(guān)性的現(xiàn)象?？赡芤驗槎嚯那宄杂苫哪芰Σ粌H與多肽含量相關(guān)，還與其氨基酸組成和結(jié)構(gòu)、分子質(zhì)量大小等多種因素有關(guān)，而不同酶由于其酶切點不同，生成的多肽分子質(zhì)量、組成和結(jié)構(gòu)有較大區(qū)別，導(dǎo)致其抗氧化活性有較大差異。

綜合上述結(jié)果，選擇酶解方式對大鯢肉進行預(yù)處理，酶制劑選擇木瓜蛋白酶，其DPPH·清除能力最高，多肽含量也較高。

2.2 大鯢肽醬香酒酶解工藝優(yōu)化單因素試驗

2.2.1 料液比對DPPH·清除率和多肽含量的影響

圖2 料液比對DPPH·清除率和多肽含量的影響Fig.2 Effect of solid to liquid ratio on DPPH radical scavenging rates and polypeptide contents

由圖2可知，隨著酶解料液比在1∶2～1∶4（g∶mL）范圍內(nèi)的提高，大鯢肽醬香酒清除DPPH自由基能力逐漸升高，料液比1∶4（g∶mL）時達到最高，隨后下降；多肽含量隨料液比在1∶2～1∶5（g∶mL）范圍內(nèi)提高不斷升高，料液比1∶5（g∶mL）時多肽含量最高，隨后下降。因此，選擇料液比1∶3、1∶4、1∶5（g∶mL）三個水平進行響應(yīng)面試驗。

2.2.2 酶添加量對DPPH·清除率和多肽含量的影響

圖3 酶添加量對DPPH·清除率和多肽含量的影響Fig.3 Effect of enzyme addition on DPPH radical scavenging rates and polypeptide contents

由圖3可知，酶添加量在4 000～6 000 U/g范圍，隨酶添加量的增加，大鯢肽醬香酒清除DPPH自由基能力逐漸升高，酶添加量為6 000 U/g時達到最高，隨后下降，添加量為8 000 U/g時急劇下降；而多肽含量隨酶添加量呈現(xiàn)不規(guī)律的波動，添加量為5 000 U/g時多肽含量最高，6 000 U/g時多肽含量最低。因此，選擇酶添加量5 000 U/g、6 000 U/g、7 000 U/g三個水平進行響應(yīng)面優(yōu)化。

2.2.3 酶解時間對多肽含量和DPPH·清除率的影響

圖4 酶解時間對DPPH·清除率和多肽含量的影響Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis time on DPPH radical scavenging rates and polypeptide contents

由圖4可知，隨著酶解時間在2～4h范圍內(nèi)的增加，DPPH自由基清除率和多肽含量逐漸升高，并在酶解時間為4 h時，二者達到最高，酶解時間＞4 h后二者均開始下降。因此，選擇酶解時間3 h、4 h、5 h三個水平進行響應(yīng)面優(yōu)化。

2.2.4 酶解溫度對多肽含量和DPPH自由基清除率的影響

圖5 酶解溫度對DPPH·清除率和多肽含量的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on DPPH radical scavenging rates and polypeptide contents

由圖5可知，在酶解溫度為45～65 ℃時，隨著酶解溫度的知高，DPPH自由基清除率和多肽含量先逐漸升高，二者在55 ℃時達到最高，隨后均開始下降。因此，選擇酶解時間50 ℃、55 ℃、60 ℃三個水平進行響應(yīng)面優(yōu)化。

2.2.5 酶解pH值對DPPH·清除率和多肽含量的影響

由圖6可知，酶解pH值在4～5范圍內(nèi)，大鯢肽醬香酒清除自由基能力均較強，酶解pH值為5時最高，隨后下降；多肽含量在酶解pH在4～8范圍，先增加后減少，也在pH為5時達到最高。因此，選擇酶解pH4、5、6三個水平進行響應(yīng)面優(yōu)化。

圖6 酶解pH值對DPPH·清除率和多肽含量的影響Fig.6 Effect of hydrolysis pH on DPPH radical scavenging rates and polypeptide contents

2.3 大鯢肽醬香酒酶解工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗

2.3.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果及方差分析

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以大鯢肽醬香酒DPPH·清除率（Y）為響應(yīng)值，選擇酶添加量（A），酶解時間（B），酶解溫度（C）及酶解pH（D）為自變量，進行4因素3水平Box-Behnken試驗，Box-Behnken試驗結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表3 Box-Behnken試驗設(shè)計結(jié)果Table 3 Results of Box-Behnken experiments design

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

利用DesignExpert10.0.4軟件進行設(shè)計和擬合后，得多元回歸方程為Y=+76.37-1.02A+2.92B+0.51C-5.75D+2.53AB+3.24AC-3.21AD-1.09BC+0.68BD+0.22CD-5.44A2-9.38B2-3.68C2-5.59D2。

由表4可知，該模型方程P＜0.000 1，表明此模型有顯著意義，失擬項（P=0.376 5＞0.05）不顯著，說明該回歸模型能充分反映大鯢肽醬香酒清除DPPH自由基能力。決定系數(shù)R2=0.961 4，校正決定系數(shù)R2adj=0.922 9均＞0.9，說明模型擬合度好，能較好地反映因素和因變量的關(guān)系，可信度高，可用于大鯢肽醬香酒清除DPPH自由基能力的推測和分析。

一次項B和D對DPPH·清除效果影響極顯著（P＜0.01），交互項AC、AD對DPPH·清除效果影響極顯著（P＜0.01），二次項AB對DPPH·清除效果影響顯著（P＜0.05），A2、B2、C2和D2對DPPH·清除效果影響極顯著（P＜0.01）。各因素顯著性程度依次是pH＞酶解時間＞酶添加量＞酶解溫度。

2.3.2 各因素間的交互作用分析

響應(yīng)面三維圖譜可以直觀地反應(yīng)各因素間的交互作用，響應(yīng)曲面越陡峭，表明響應(yīng)值對因素變化越敏感；反之，曲面坡度相對平緩，則響應(yīng)值對因素變化不敏感。

由圖7可知，AB、AC、AD三組響應(yīng)曲面坡度較陡，表明酶添加量分別與酶解時間、酶解溫度和酶解pH三個因素對DPPH·清除率的交互作用顯著（P＜0.05）；其余三組因素對DPPH·清除率的交互作用不顯著（P＞0.05），這與表4方差分析結(jié)果一致。

圖7 各因素交互作用對大鯢肽醬香酒DPPH自由基清除率影響的響應(yīng)面及等高線Fig.7 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on DPPH radical scavenging rate of Andrias davidianus peptide of Moutai-flavor Baijiu

2.3.3 工藝參數(shù)優(yōu)化驗證試驗結(jié)果

通過Design-Expert對模型的分析，得到清除DPPH自由基最佳的大鯢肽醬香酒最佳酶解工藝條件為：酶添加量6 126 U/g、酶解時間4.15 h、酶解溫度55.43 ℃、酶解pH 4.46，大鯢肽醬香酒對DPPH自由基的清除率預(yù)測值為78.091%。為了便于實際操作，將最佳酶解工藝條件修正為酶添加量6 126 U/g、酶解時間4 h、酶解溫度55 ℃、酶解pH 4.5。在此條件下進行3次平行驗證試驗，得到大鯢酒對DPPH自由基的清除率為（77.98±0.99）%，與預(yù)測值接近，證明了此模型擬合準確、可行。

2.3.4 大鯢肽醬香酒體外抗氧化活性測定結(jié)果

以VC為陽性對照，測定DPPH·、·OH清除率和還原能力，結(jié)果見表5。由表5可知，本實驗選用的醬香型白酒DPPH·清除率、·OH清除率和Fe3+還原力（吸光度值A(chǔ)700nm）均很低，分別為（4.72±0.14）%、（3.98±0.11）%和0.010±0.001，而大鯢肽醬香酒DPPH·清除率、·OH清除率和Fe3+還原力（吸光度值A(chǔ)700nm）分別達到（77.98±0.99）%、（70.66±0.70）%和0.651±0.021，其抗氧化活性雖比VC低，但較醬香型白酒有顯著提高。

表5 大鯢肽醬香酒抗氧化活性測定結(jié)果Table 5 Results of antioxidant activity of Andrias davidianus peptide Moutai-flavor Baijiu

3 結(jié)論

通過比較酸水解、酶水解和直接泡制等不同預(yù)處理方法對大鯢肽醬香酒清除DPPH自由基能力和多肽含量的影響，發(fā)現(xiàn)酶水解法優(yōu)于其他兩個方法，木瓜蛋白酶為最適酶制劑，以DPPH自由基清除率為評價指標，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化得到大鯢肽醬香酒酶解工藝為：酶添加量6 126 U/g、酶解時間4 h、酶解溫度55 ℃、酶解pH 4.5。此優(yōu)化條件下，DPPH自由基的清除率為（77.98±0.99）%，羥自由基清除率為（70.66±0.70）%，F(xiàn)e3+還原能力（吸光度值A(chǔ)700nm）為0.651，多肽含量達（14.20±0.11）mg/mL，酒精度41.6%vol，甲醇含量0.27 g/L，氰化物未檢出，均符合T/CBJ 5102—2019《保健酒》的理化要求。結(jié)果表明此工藝生產(chǎn)的大鯢肽醬香酒具有較強體外抗氧化活性，活性肽含量較高，為養(yǎng)殖大鯢的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展和醬香保健酒的開發(fā)提供有利參考。