魏巍 張偉 吳國(guó)志 陳榮
海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院,570311
類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是以炎性滑膜炎反應(yīng)為主的系統(tǒng)性、自身免疫性疾病,常可在發(fā)病2年內(nèi)出現(xiàn)骨關(guān)節(jié)破壞,導(dǎo)致患者殘疾,嚴(yán)重影響日常生活[1]。維生素D是一種類固醇衍生物,其通過與維生素D受體(vitamin D receptor,VDR)相結(jié)合,可參與機(jī)體鈣磷代謝及骨鹽沉積,并可作用于機(jī)體免疫系統(tǒng),影響多種細(xì)胞增殖及分化,參與免疫調(diào)節(jié)[2]。25-羥維生素D[25-(OH)D]是維生素D中間代謝產(chǎn)物,被認(rèn)為是反映維生素D水平的一個(gè)最可靠指標(biāo)[3]。VDR廣泛分布于機(jī)體各組織細(xì)胞中,其可參與骨代謝及免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)[4],參與骨代謝的VDR基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)位點(diǎn)主要為FokI、BsmI及ApaI等。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。有研究表明[5],維生素D缺乏可加速類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎產(chǎn)生及惡化。但目前國(guó)內(nèi)關(guān)于維生素D水平及其受體基因多態(tài)性與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎骨侵蝕關(guān)系的研究尚少,基于此,本研究通過檢測(cè)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血清25-(OH)D水平及VDR基因多態(tài)性,并分析其與骨侵蝕的相關(guān)性,以期為臨床治療提供參考。
將本院2014年7月至2018年6月收治的94例類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者設(shè)為研究組,另將85例同期體檢健康者設(shè)為健康組。其中研究組男35例,女59例,漢族,年齡34~62歲,平均(46.28±7.21)歲,病程4~32個(gè)月,平均(20.12±3.34)個(gè)月,受累關(guān)節(jié)數(shù)5~23個(gè),平均(14.26±2.13)個(gè),改良28關(guān)節(jié)疾病活動(dòng)性評(píng)分(DAS28)[6]3.89~5.96分,平均(5.35±0.38)分;健康組男34例,女51例,漢族,年齡32~65歲,平均(47.93±7.45)歲。2組受試者在民族、性別及年齡方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),且本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。
納入標(biāo)準(zhǔn):研究組均符合類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[7],均經(jīng)X線檢查;近3個(gè)月內(nèi)均未接受維生素D類似物治療;所有受試者均知情同意,且均為漢族。
排除標(biāo)準(zhǔn):合并骨質(zhì)疏松以及其他與骨侵蝕有關(guān)疾病者;腫瘤、感染等引起關(guān)節(jié)疼痛者;不能正常飲食或不能接受戶外陽(yáng)光照射者;存在血緣關(guān)系者。
1.2.1血清25-(OH)D水平檢測(cè):均抽取受試者清晨空腹靜脈血3 mL,離心,分離血清,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)血清25-(OH)D水平(試劑盒購(gòu)于英國(guó)艾迪斯公司),所有步驟嚴(yán)格按照說明書執(zhí)行。
1.2.2VDR基因多態(tài)性檢測(cè):⑴血樣DNA提?。翰杉茉囌哽o脈血4 mL,根據(jù)Wizard Genonic DNA purification Kit(Promega公司)試劑盒說明書進(jìn)行操作,提取DNA并經(jīng)分光光度計(jì)定量及瓊脂糖凝膠電泳質(zhì)檢;⑵引物設(shè)計(jì)與合成:選擇3個(gè)VDR基因SNPs位點(diǎn),即FokI(rs2228570)位點(diǎn)、BsmI(rs154410)位點(diǎn)、ApaI(rs7975232)位點(diǎn),參照Mosaad等[9]設(shè)計(jì)的用于VDR基因擴(kuò)增引物,由北京奧科生物公司合成;⑶基因型檢測(cè):采用MassARRAY分子量陣列技術(shù)平臺(tái),通過引物延伸或切割反應(yīng)與MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合,而對(duì)所選VDR基因SNPs位點(diǎn)分型進(jìn)行檢測(cè),獲得分型結(jié)果。
1.2.3骨侵蝕分期:根據(jù)經(jīng)雙手X線片檢查分期(任意一個(gè)受累關(guān)節(jié))[8],Ⅰ期:無骨質(zhì)破壞性改變或關(guān)節(jié)端骨質(zhì)疏松;Ⅱ期:骨質(zhì)疏松、可有輕度軟骨破壞、伴或不伴輕度軟骨下骨質(zhì)破壞,可伴有關(guān)節(jié)活動(dòng)受限但無關(guān)節(jié)畸形等;Ⅲ期:骨質(zhì)疏松伴軟骨破壞,明顯關(guān)節(jié)軟骨下囊樣破壞,關(guān)節(jié)半脫位,關(guān)節(jié)間隙狹窄等;Ⅳ期:除了包含Ⅱ、Ⅲ期內(nèi)容外,且有纖維性或骨性強(qiáng)直;其中Ⅰ期與Ⅱ期歸為無骨侵蝕(25例),Ⅲ期與Ⅳ期歸為有骨侵蝕(69例)。
研究組與健康組血清25-(OH)D水平:其中<20 ng/mL記為缺乏,≥20 ng/mL且<30 ng/mL記為不足,≥30 ng/mL且≤100 ng/mL記為正常。研究組骨侵蝕者與無骨侵蝕者血清25-(OH)D水平。研究組與健康組基因型、等位基因分布:缺乏內(nèi)切酶FokI、BsmI、ApaI酶切位點(diǎn)用F、A、B表示,存在酶切位點(diǎn)用f、a、b表示。研究組骨侵蝕者與無骨侵蝕者基因型、等位基因分布。
采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,兩樣本計(jì)量資料與計(jì)數(shù)資料分別采用t檢與χ2檢驗(yàn),血清25-(OH)D水平、VDR基因多態(tài)性與骨侵蝕關(guān)系探討采用Logistic多元逐步回歸模型進(jìn)行分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
研究組血清25-(OH)D水平明顯低于健康組(P<0.05),見表1。
研究組骨侵蝕患者血清25-(OH)D水平明顯低于無骨侵蝕者(P<0.05),見表2。
表1 研究組與健康組血清25-(OH)D水平對(duì)比
表2 研究組骨侵蝕與無骨侵蝕者血清25-(OH)D水平對(duì)比
研究組BsmI位點(diǎn)基因型頻率及等位基因B頻率與健康組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),研究組FokI位點(diǎn)基因型FF、Ff及等位基因F占比均明顯高于健康組(P<0.05),研究組FokI位點(diǎn)基因型ff占比明顯低于健康組(P<0.05),研究組ApaI位點(diǎn)基因型AA、Aa及等位基因A占比均明顯高于健康組(P<0.05),研究組ApaI位點(diǎn)基因型aa占比明顯低于健康組(P<0.05),見表3。
表3 各位點(diǎn)基因型和等位基因分布Table 3 Genotype and allele distribution of each locus
續(xù)表3 各位點(diǎn)基因型和等位基因分布
研究組骨侵蝕患者FokI位點(diǎn)、ApaI位點(diǎn)、BsmI位點(diǎn)基因型出現(xiàn)頻率與無骨侵蝕患者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),研究組骨侵蝕患者FokI位點(diǎn)、ApaI位點(diǎn)、BsmI位點(diǎn)的等位基因F、B、A出現(xiàn)頻率與無骨侵蝕患者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表4。
表4 骨侵蝕與無骨侵蝕者各位點(diǎn)基因型和等位基因分布
續(xù)表4 骨侵蝕與無骨侵蝕者各位點(diǎn)基因型和等位基因分布
經(jīng)Logistic多元逐步回歸模型分析發(fā)現(xiàn),血清25-(OH)D<30 ng/mL、FokI位點(diǎn)基因型FF及Ff、ApaI位點(diǎn)基因型AA及Aa均是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病的危險(xiǎn)因素(OR=5.149、4.267、3.013、5.234、5.097,P<0.05),BsmI位點(diǎn)基因型BB及Bb與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病無明顯關(guān)系(OR=1.006、1.002,P>0.05),見表5。
表5 血清25-(OH)D水平、VDR基因不同SNPs位點(diǎn)基因型與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的關(guān)系
經(jīng)Logistic多元逐步回歸模型分析發(fā)現(xiàn),血清25-(OH)D<20 ng/mL是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎骨侵蝕的危險(xiǎn)因素(OR=3.987,P<0.05),F(xiàn)okI位點(diǎn)基因型FF及Ff、BsmI位點(diǎn)基因型BB及Bb、ApaI位點(diǎn)基因型AA及Aa均與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎骨侵蝕無明顯關(guān)系(OR=1.007、1.009、1.003、1.001、1.011、1.012,P>0.05),見表6。
表6 血清25-(OH)D水平、VDR基因不同SNPs位點(diǎn)基因型與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎骨侵蝕的關(guān)系
類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病可能與遺傳、多種免疫因素等有關(guān),其病理變化主要為間質(zhì)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、滑膜襯里細(xì)胞增生以及骨和軟骨組織破壞等[10]。骨侵蝕患者的骨關(guān)節(jié)損傷不可逆,故早期診斷及干預(yù)極其重要。X線檢查是臨床診斷類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎骨侵蝕的常用手段,但經(jīng)X線檢查顯示異常者多已出現(xiàn)不可逆骨關(guān)節(jié)破壞,嚴(yán)重影響疾病恢復(fù)[11]。
本研究發(fā)現(xiàn),研究組血清25-(OH)D水平低于健康組(P<0.05),且骨侵蝕患者低于無骨侵蝕者(P<0.05)。另分析發(fā)現(xiàn)血清25-(OH)D<30 ng/mL是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病的危險(xiǎn)因素,血清25-(OH)D<20 ng/mL是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎骨侵蝕的危險(xiǎn)因素,提示類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血清25-(OH)D水平降低,且在伴骨侵蝕患者中降低更加明顯,血清25-(OH)D水平缺乏可增加骨侵蝕發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。維生素D是骨正常鈣化及礦物質(zhì)代謝所必需的,可促進(jìn)骨形成,而血清25-(OH)D是維生素D的活性形式,其水平的降低表明維生素D減少[11]。有研究顯示[12],T、B淋巴細(xì)胞以及其相關(guān)細(xì)胞因子在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。維生素D是抑制胸腺基質(zhì)樹突狀細(xì)胞分化成熟的主要因子,可直接作用于Th1、Th2及Th17細(xì)胞,減少炎性細(xì)胞因子分泌,并促進(jìn)抗炎細(xì)胞合成[14]。因此,維生素D既可改善關(guān)節(jié)骨質(zhì)破壞,亦具有免疫抑制作用。當(dāng)25-(OH)D水平降低,則維生素D調(diào)節(jié)骨骼及鈣磷代謝作用減弱,影響關(guān)節(jié)骨質(zhì)破損的修復(fù),且免疫抑制功能下降,炎性反應(yīng)加重,則病情進(jìn)一步發(fā)展,關(guān)節(jié)損傷程度加重[15]。有研究發(fā)現(xiàn)[16],類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血清25-(OH)D水平越低,其關(guān)節(jié)破壞程度越嚴(yán)重,此與本研究結(jié)果相符合。因此,類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血清25-(OH)D水平減低,且其缺乏可增加骨侵蝕發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。
本研究還發(fā)現(xiàn),研究組FokI位點(diǎn)基因型FF、Ff與等位基因F以及ApaI位點(diǎn)基因型AA、Aa與等位基因A頻率均明顯高于健康組(P<0.05),研究組基因型ff、aa占比均明顯低于健康組(P<0.05),且分析發(fā)現(xiàn)FokI位點(diǎn)基因型FF及Ff、ApaI位點(diǎn)基因型AA及Aa均是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病的危險(xiǎn)因素,提示類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病可能與VDR基因FokI位點(diǎn)等位基因F、ApaI位點(diǎn)等位基因A有關(guān)?;蚨鄳B(tài)性可改變VDR mRNA表達(dá)水平,進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄水平上影響VDR蛋白表達(dá),促使VDR蛋白在數(shù)量及活力上出現(xiàn)不同,影響維生素D發(fā)揮效應(yīng)[17]。VDR是糖皮質(zhì)激素、甲狀腺激素等受體基因超家族成員,存在多個(gè)SNPs位點(diǎn),不同基因型的VDR可對(duì)維生素D產(chǎn)生不同的生物效應(yīng)[18]。本研究還發(fā)現(xiàn),研究組骨侵蝕患者FokI位點(diǎn)、ApaI位點(diǎn)、BsmI位點(diǎn)基因型等級(jí)分布及等位基因出現(xiàn)頻率均與無骨侵蝕患者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),且分析發(fā)現(xiàn)其均與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎骨侵蝕無明顯關(guān)系,提示VDR基因多態(tài)性與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎骨侵蝕的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)。
綜上,類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血清25-(OH)D水平降低,且其缺乏可增加類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎骨侵蝕發(fā)生風(fēng)險(xiǎn),另VDR基因FokI位點(diǎn)等位基因F及ApaI位點(diǎn)等位基因A雖可增加類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病風(fēng)險(xiǎn),但與骨侵蝕無關(guān)。臨床工作者需及早監(jiān)測(cè)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血清25-(OH)D水平并適時(shí)補(bǔ)充維生素D,另需提高對(duì)含VDR基因FokI位點(diǎn)等位基因F及ApaI位點(diǎn)等位基因A者的警惕。但本研究樣本量較小,可能會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)偏差,后續(xù)需擴(kuò)大樣本量進(jìn)行相關(guān)性研究。