牛肉加熱過程中低場核磁馳豫信號與品質(zhì)特征的動態(tài)分析

謝安國 王滿生 石曉微 王飛翔 康懷彬

(1. 河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 4710003； 2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，湖南 長沙 410205)

通常食物中的水分有結(jié)合水、半結(jié)合水和游離水等不同狀態(tài)。水分含量及其分布狀態(tài)對食品品質(zhì)有重要影響[1]，具體在肉制品中，水分狀態(tài)可能會影響滴水損失、色澤、嫩度等食用品質(zhì)，進(jìn)而影響消費者的購買和食用欲望[2]。因此在肉制品加工過程中，深入研究其水分含量與狀態(tài)變遷具有重要意義[3]。

目前，針對肉及肉制品水分含量大多采用國標(biāo)烘干法進(jìn)行測定，但這種方法并不能準(zhǔn)確表達(dá)不同狀態(tài)水的分布狀況及定量分析。低場核磁共振(Low-field nuclear magnetic resonance，LF-NMR)是指1H、13C、129Xe等原子核在恒定磁場和交變磁場的作用下發(fā)生共振吸收與發(fā)射過程，其中恒定磁場強(qiáng)度低于0.5 T。LF-NMR技術(shù)測試速度快、精確度高、對樣品無損耗，近年來逐漸被用于食品、紡織、建筑等多領(lǐng)域研究[3-4]。在食品加工方面，劉麗美等[5]基于LF-NMR技術(shù)探討了不同油炸溫度對牛肉干水分分布與品質(zhì)的影響，苗穎等[6]考察了不同熱燙溫度對纖絲干酪水分狀態(tài)的影響，姜秀麗等[7]研究了不同烘干溫度對牛肉干品質(zhì)及水分分布的影響，這些研究結(jié)果均表明，溫度對水分分布有顯著影響，且低場核磁能夠清晰、準(zhǔn)確地展示3種狀態(tài)水的分布情況。

但是在肉熟化過程中水分分布研究方面，大多數(shù)研究樣本數(shù)目較少，時間間隔較大，水分的動態(tài)變遷不夠清晰。另外，很多文獻(xiàn)[5,7]中只選取了低場核磁的峰面積比進(jìn)行了分析，只關(guān)注峰面積比所代表3種狀態(tài)水的分布情況，而信號峰的峰高、峰寬、峰位置等諸多參數(shù)被忽視，肉品熟化過程中，這些峰參數(shù)如何變化，它們與肉品品質(zhì)存在什么潛在關(guān)系等相關(guān)研究未見報道?；诖?，研究擬在牛肉水煮受熱6 min內(nèi)進(jìn)行高密度采樣，對牛肉低場核磁信號峰進(jìn)行全參數(shù)和動態(tài)連續(xù)分析，并研究核磁信號峰與肉品品質(zhì)之間的相關(guān)性，同時基于核磁信號參數(shù)模擬分析肉品受熱過程中水分、嫩度和色差的變化規(guī)律，為完善低場核磁共振分析方法和挖掘潛在信息價值提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

牛背最長肌肉(Longissimus dorsi，LD)：市售。

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平：JA5003B型，上海精科儀器有限公司；

鼓風(fēng)干燥箱：DHG9425A型，上海恒科學(xué)儀器公司；

電熱恒溫水浴鍋：HH-S4型，北京科偉永興儀器有限公司；

色差計：Xrite Color i5型，美國Xrite公司；

數(shù)顯式肌肉嫩度儀：LM3B型，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)工程學(xué)院；

低場核磁共振成像分析儀：MINI20-015V-I型，上海紐邁電子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 整體試驗過程 將牛肉里脊去除脂肪和結(jié)締組織，分割為4 cm×4 cm×2 cm的牛肉塊，裝入編號的蒸煮袋中并置于水浴鍋中蒸煮(99 ℃)。在受熱過程中進(jìn)行高密度采樣，由于肉品受熱初期物質(zhì)結(jié)構(gòu)變化劇烈而后期變化緩慢，因此采樣采取前期密集后期較稀疏的模式。具體試驗流程如圖1所示，1號樣品受熱0 s(鮮肉)，2號樣品受熱1 s，以此類推，第45號樣品受熱360 s，每個處理重復(fù)3次。最后對處理過的樣品分別進(jìn)行LF-NMR馳豫特征分析和肉品品質(zhì)評價。

圖1 試驗流程圖

1.3.2 牛肉低場核磁信號峰測定與分析 準(zhǔn)確稱量相同質(zhì)量(0.6 g)的牛肉條放入直徑為15 mm的玻璃管中，然后置于LF-NMR儀的磁體永久磁場中心位置，利用軟件分析自由感應(yīng)衰減(free induction decay，F(xiàn)ID)脈沖序列矯正系統(tǒng)參數(shù)，再利用自旋回波(carr-purcell-meiboom-gill，CPMG)脈沖序列采集樣品橫向弛豫時間(T2)，數(shù)據(jù)反演的迭代次數(shù)設(shè)為10萬次得到T2反演譜[3]，重復(fù)測定3次。

在核磁共振現(xiàn)象中，原子核從高能狀態(tài)恢復(fù)到低能狀態(tài)的現(xiàn)象稱為弛豫過程，包括縱向弛豫T1和橫向弛豫T2。弛豫時間是解析物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)的重要參數(shù)[8]，T1是旋轉(zhuǎn)核與周圍環(huán)境之間進(jìn)行能量交換，T2則是在自旋系統(tǒng)內(nèi)部發(fā)生的交換能量[9]。對于生物材料，T2對多相態(tài)的存在更敏感，變化范圍較大。因此利用LF-NMR分析技術(shù)，基于橫向弛豫時間(T2)來研究牛肉中的水分特征。

通常食品研究中，只需提取LF-NMR的峰面積，計算其對應(yīng)3種狀態(tài)水的變化[10-11]。試驗將提取和分析核磁信號峰的所有參數(shù)信息，包括峰面積(A)、峰面積比(AR)、峰高(H)、峰寬(W)和峰位置(P)。峰位置即波峰最大值對應(yīng)的馳豫時間。

1.3.3 牛肉理化指標(biāo)的測定

(1) 含水率：按GB 5009.3—2016的直接干燥法(105 ℃)執(zhí)行。

(2) 蒸煮失水率：根據(jù)文獻(xiàn)[12]。

(3) 肉品色差：用色差計測定[8]。

(4) 肉品剪切力：按NY/T 1180—2006執(zhí)行。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 利用SPSS軟件完成數(shù)據(jù)統(tǒng)計與Pearson相關(guān)性分析，利用Origin 2017進(jìn)行作圖。利用MATLAB2014a軟件編寫逐步回歸算法，對加熱過程中肉品建立數(shù)學(xué)模型，并模擬水分、色澤等指標(biāo)動態(tài)變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 核磁信號峰參數(shù)在加熱過程中的變化規(guī)律

通過LF-NMR的橫向弛豫時間(T2)分析了牛肉加熱過程中3種組分水的變化。橫向弛豫時間T2能反映樣品內(nèi)部質(zhì)子所受束縛力與自由度的大小，T2越大，水分的自由度越高。依照馳豫時間T21(<10 ms)、T22(10～100 ms)、T23(>1 000 ms)可以將牛肉中水分劃分為結(jié)合水、半結(jié)合水和自由水3種狀態(tài)[2,5]。

2.1.1 峰面積和峰面積比的變化 由圖2可知，隨著加熱時間的延長，峰面積A23顯著增加；A21峰、A22峰面積和峰總面積均沒有顯著變化。由圖3可知，T21峰緩慢減少，T22顯著減少，鮮肉中不存在T23峰，但受熱10 s后，T23峰面積占比顯著增加。T21是存在于細(xì)胞內(nèi)與大分子物質(zhì)和水合離子緊密結(jié)合的水，結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，因此加熱中T21變化較小。而T22被認(rèn)為是半結(jié)合水，分布在肌原纖維內(nèi)部，在肉品熟化過程中一部分不易流動水轉(zhuǎn)變成了自由水[12]，導(dǎo)致自由水含量增加。這部分水排出到肌原纖維網(wǎng)絡(luò)外，因此代表自由水的T23峰在受熱一段后出現(xiàn)，且比例增加。通過理化分析可知，受熱后肉品中總水分減小，但在熟化過程中總的峰面積變化不大。因此，低場核磁的峰面積數(shù)值并不能直接反映肉品中水分含量。此外，加熱中T21峰、T22峰及峰總面積變化不顯著，折算成3個峰的面積比后數(shù)值的變化規(guī)律顯著(P<0.01)。因此，面積比更能反映食品中水分結(jié)構(gòu)變化。

圖2 熱處理過程中牛肉低場核磁峰面積的變化

圖3 熱處理過程中牛肉低場核磁峰面積比的變化

2.1.2 峰高和峰寬的變化 肉品熟化過程中，核磁波峰形狀的變化大于峰面積的變化。對于T21峰，峰高和峰寬平均值未發(fā)生明顯變化(見圖4、5)，但峰寬的數(shù)值波動(方差)隨加熱時間的增加顯著增大。T21峰結(jié)合水是與食品成分中蛋白質(zhì)、黏多糖、磷脂及鹽類堅固結(jié)合，受到束縛的水；在肉品中主要是與肽鏈的羧基和氨基等離子基團(tuán)牢固結(jié)合。肉品受熱熟化時，結(jié)合水?dāng)?shù)量比例沒有發(fā)生顯著變化，但是水與蛋白質(zhì)結(jié)合的不穩(wěn)定性增加，因此數(shù)值方差增大。

圖4 熱處理過程中牛肉低場核磁峰高的變化

信號峰形狀變化最為明顯的是T22峰，峰寬度顯著增加且高度顯著降低(P<0.01)，說明數(shù)據(jù)集中度下降、多樣性增加。牛肉加熱中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)會發(fā)生較明顯變化[13]，蛋白質(zhì)離子鍵和氫鍵含量呈不斷下降的趨勢，疏水相互作用和二硫鍵含量顯著升高。熱處理過程中，肌原纖維蛋白的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生重排[14]，蛋白質(zhì)分子中N—H和C—N伸縮振動以及N—H彎曲振動比較活躍[15]；芳香族氨基酸殘基越來越多的暴露在蛋白分子的表面。前期研究結(jié)合核磁T22峰形狀特征可推斷：自然狀態(tài)下蛋白質(zhì)分子會折疊成有序的三維結(jié)構(gòu)[16]，疏水基團(tuán)在內(nèi)部，親水基團(tuán)在蛋白表面。水分子圍繞蛋白質(zhì)形成的親水層，水—氨基酸結(jié)合的氫鍵類型比較集中，因此核磁峰的寬度較窄、數(shù)據(jù)集中。當(dāng)?shù)鞍资軣嶙冃院?，形成大量無序卷曲，大量疏水鍵暴露，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。蛋白質(zhì)肽鏈與水分子形成氫鍵的類型增加，氫原子間距會發(fā)生相應(yīng)變化。因此核磁峰的寬度增加、多樣性增加。

圖5 熱處理過程中牛肉低場核磁峰寬的變化

T23峰加熱約25 s后出峰，寬度增加到一定數(shù)值后穩(wěn)定；高度會隨熟化程度緩慢增加。說明蛋白質(zhì)變性后，半結(jié)合水轉(zhuǎn)化為自由水后，自由水類型沒有發(fā)生明顯變化，而自由水?dāng)?shù)量的增加主要反映在信號峰的高度上。

2.1.3 峰位置的變化 由圖6可知，T21峰左移，方差增大，T22峰緩慢左移，T23峰出峰后顯著左移。結(jié)合水被認(rèn)為是圍繞肌肉固形物強(qiáng)極性基團(tuán)形成一個單分子層的水，半結(jié)合水是親水基團(tuán)周圍的多層水及鄰近水。蛋白質(zhì)變性后，特定空間結(jié)構(gòu)被破壞[12,17]，部分區(qū)域變成無序的線狀結(jié)構(gòu)。圍繞在肽鏈周圍的單層水和多層水形狀也會發(fā)生變化。因而蛋白質(zhì)與水分子的間距平均值縮短，可能是3個核磁峰左移、馳豫時間都縮短的原因。

圖6 熱處理過程中牛肉低場核磁峰位置的變化

2.2 核磁峰與肉品品質(zhì)的相關(guān)性分析

由表1可知，熟化過程中隨著熟化時間的增加蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性并伴隨著脂肪氧化，使肉品顏色發(fā)生改變，總體表現(xiàn)為亮度(L*)增加、紅度(a*)降低和黃度(b*)增加，這是由于隨著加熱時間的增加，肉品中的肌紅蛋白產(chǎn)生變性導(dǎo)致肌紅蛋白數(shù)量減少，所以肉品的表面顏色從鮮紅變?yōu)榘咨瑫r伴隨著脂肪氧化程度的增加，使肉品顏色的黃度(b*)增加。剪切力是模擬人咀嚼時咬斷肌纖維所需的力量，牛肉受熱熟化的過程中剪切力值發(fā)生顯著變化(P<0.01)，呈先升高后降低的趨勢。加熱初期，蛋白質(zhì)受熱變性形成凝膠，肌纖維收縮脫水，肌原纖維蛋白和結(jié)締組織蛋白的張力增加，剪切力逐漸增大肉品組織變硬。而后剪切力快速下降，可能是由于持續(xù)加熱使得蛋白質(zhì)持續(xù)降解，肌纖維變得松散甚至斷裂[18]。蛋白質(zhì)降解加劇，肌纖維受熱沖擊嚴(yán)重，導(dǎo)致剪切力值下降。

NMR技術(shù)通過對樣品中含氫流體的監(jiān)測，實現(xiàn)在無損條件下觀察樣品中含氫流體的分布和變化規(guī)律。雖然NMR信號主要反映食品水分的變化，但水分作為肌肉中的最主要成分，通過微觀結(jié)構(gòu)上的變化，可能對肉品色澤、嫩度、風(fēng)味、多汁性等多項口感品質(zhì)存在潛在影響。表1中分析了核磁信號峰各參數(shù)與肉品品質(zhì)指標(biāo)之間的相關(guān)關(guān)系，結(jié)果表明兩者的確存在許多顯著相關(guān)。肉品含水量、蒸煮損失率與12個峰參數(shù)中的9個呈極顯著相關(guān)，尤其是峰高、峰寬和峰位置與品質(zhì)指標(biāo)的相關(guān)性均大于峰面積比。剪切力與T22峰的峰高、峰寬，以及T23峰位置極顯著相關(guān)，可能是細(xì)胞膠態(tài)原生質(zhì)受熱后結(jié)構(gòu)被破壞，組織細(xì)胞的硬度和彈性發(fā)生改變[19]。Lab色澤系統(tǒng)中，b*值與核磁參數(shù)的相關(guān)性最大，L*值其次，a*值最小。肌紅蛋白的化學(xué)狀態(tài)決定了肌肉的顏色變化，說明這些信息可以反映在核磁峰信號上。

表1 LF-NMR峰參數(shù)與牛肉品質(zhì)指標(biāo)的相關(guān)性分析?

2.3 基于核磁信號峰參數(shù)建立對肉品理化指標(biāo)的回歸模型

核磁信號與肉品品質(zhì)之間存在大量潛在相關(guān)，因此試驗基于核磁信號參數(shù)對肉品理化指標(biāo)建立回歸模型。選擇逐步回歸法對多個變量進(jìn)行分析。逐步回歸的基本思想逐個剔除影響不顯著的變量，保留影響顯著的變量，最終使得回歸方程擬合趨于穩(wěn)定合理。回歸計算在MATLAB中進(jìn)行，核心代碼：stepwize(X,Y)。如表2所示，基于核磁參數(shù)對肉品品質(zhì)的數(shù)學(xué)模擬，含水量和蒸煮損失模擬效果最好，其次為色差L*和b*值，對a*值和剪切力模擬能力稍弱。通過剔除影響不顯著的峰參數(shù)，可知含水量和蒸煮損失受峰面積比和峰位置影響較大；色差L*和b*值主要受到峰高、峰寬和峰位置影響；剪切力受峰面積比和峰形狀參數(shù)的多重影響。

表2 基于LF-NMR峰參數(shù)對牛肉品質(zhì)指標(biāo)的數(shù)學(xué)模擬

3 結(jié)論

對牛肉加熱過程中的45個時間點進(jìn)行了高密度采樣，分析了信號峰的全部參數(shù)及肉品品質(zhì)變化，且所得實驗數(shù)據(jù)平滑合理，變化規(guī)律清晰。結(jié)果表明隨著加熱時間的增加，代表半結(jié)合的峰面積比下降，自由水的峰面積比增加。在峰形狀特征上，T22峰寬度增加、高度下降；T21峰寬度的數(shù)據(jù)波動增大；3個峰峰位置都顯著左移。研究還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)牛肉蛋白受熱變性后三級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，大量無序卷曲形成和大量疏水鍵暴露，導(dǎo)致肽鏈與水分子形成氫鍵的類型增加，氫鍵間距變化，使得相對應(yīng)的核磁峰寬度增加、多樣性增加。

此外，核磁峰參數(shù)與肉品多個品質(zhì)指標(biāo)之間存在極顯著相關(guān)，并且峰高、峰寬和峰位置與品質(zhì)指標(biāo)的相關(guān)性大于峰面積比。通過核磁信號峰參數(shù)建立的數(shù)學(xué)模型在含水量、蒸煮損失、色差L*值、a*值、b*值和剪切力等指標(biāo)上模擬效果理想，模擬值與實測值相關(guān)系數(shù)R2分別達(dá)到了0.943，0.936，0.791，0.717，0.876，0.694。因此，研究結(jié)果充分證實了，在食品核磁信號分析中，峰高、峰寬和峰位置等形狀特征參數(shù)所含的信息價值不低于峰面積，且為完善LF-NMR分析方法和挖掘潛在信息價值提供了一定的參考。