腎臟疾病代謝組學研究的進展

邱丹丹 綜述 蔣 松 審校

隨著系統(tǒng)生物學的突飛猛進，以及核磁共振(NMR)和質(zhì)譜分析(MS)技術(shù)的不斷普及，作為基因組學、轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學下游的代謝組學應運而生。代謝組學能夠反映體內(nèi)實時的生化反應過程，還可整合內(nèi)生性和外源性代謝產(chǎn)物水平的變化，反映飲食、環(huán)境及腸道微生物等因素對疾病的影響。此外，代謝與腎臟之間也存在密切的聯(lián)系，多種代謝產(chǎn)物由腎臟代謝或排泄，腎功能的下降廣泛影響代謝產(chǎn)物的水平。代謝組學研究顯示，隨著慢性腎臟病(CKD)的進展，可出現(xiàn)精氨酸代謝改變、凝血/炎癥途徑代謝增加、羧酸陰離子轉(zhuǎn)運障礙、腎上腺激素產(chǎn)生減少以及犬尿素途徑色氨酸代謝產(chǎn)物增加等改變[1]。而某些代謝產(chǎn)物本身也可促進腎臟疾病的進展及其并發(fā)癥的發(fā)生。因此，代謝組學技術(shù)在腎臟領(lǐng)域的分子標志物和分子機制的研究中具有十分廣闊的前景。本文擬簡介代謝組學技術(shù)及腎臟疾病相關(guān)代謝組學研究進展。

代謝組學

代謝組學是指利用高通量檢測技術(shù)識別和定量生物樣本中全部或特定類別代謝產(chǎn)物的方法，可以檢測分子量<1 500 D的代謝產(chǎn)物，主要包括糖類、氨基酸、核苷酸、?；鈮A、脂類等物質(zhì)。根據(jù)樣本類型不同，目前可被識別的代謝產(chǎn)物數(shù)量可從數(shù)千至數(shù)萬不等，收錄于《Human Metabolome Database》、《METLIN》、《LipidMaps》等多個數(shù)據(jù)庫中。無法被識別的代謝產(chǎn)物，只能以色譜分析停留時間、質(zhì)量以及離子特征裂解方式等信息標注，稱為未知代謝產(chǎn)物。識別未知代謝產(chǎn)物仍是一項艱巨任務。目前代謝組學主要采用NMR和MS兩種方法。

NMR技術(shù)利用1H、13C、31P等原子核的磁性自旋特性確定代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和豐度。NMR技術(shù)無需預先色譜分析，樣本處理步驟相對較少，可對代謝產(chǎn)物進行絕對定量，且無需標準品即可識別產(chǎn)物結(jié)構(gòu)。但該方法靈敏度較差，僅能檢測出豐度較高的物質(zhì)，在體液標本中可檢測出的代謝產(chǎn)物一般小于100個。

MS技術(shù)靈敏度較高，結(jié)構(gòu)識別性也較好。但在分析之前需要液相色譜(LC)或氣相色譜(GC)分離技術(shù)以降低樣本的復雜性，而化學衍生和淬火等過程有可能改變代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，導致錯誤結(jié)果。MS技術(shù)有靶向和非靶向兩種模式。靶向模式的通量較高，質(zhì)譜分析儀只檢測預先設(shè)定的代謝產(chǎn)物。例如液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)技術(shù)每周大概可檢測800個樣本。靶向分析通常采用三重串聯(lián)四級桿質(zhì)譜分析方法，將先驅(qū)離子裂解為產(chǎn)物離子，通過先驅(qū)離子/產(chǎn)物離子對代謝產(chǎn)物進行識別，可一次性檢測幾十至一百多對先驅(qū)離子/產(chǎn)物離子組合，在代謝產(chǎn)物識別方面具有較高的靈敏度和準確性，但質(zhì)量準確度相對較差。非靶向模式的通量相對較低，例如LC-MS技術(shù)每周只可檢測約150個樣本。非靶向分析方法常采用飛行時間質(zhì)譜和離子阱質(zhì)譜，這兩種方法無需離子裂解，在保證質(zhì)量準確度的前提下，每次檢測可產(chǎn)生成百上千個分析物峰。由于代謝產(chǎn)物在分子量、極性和濃度等方面存在很大的不同，目前尚無一種方法能夠精確檢測全部的代謝產(chǎn)物。每種檢測方法均有各自的優(yōu)缺點，可根據(jù)研究目的、樣本類型以及實驗室條件等多種因素進行選擇[2](圖1)。

圖1 不同代謝組學檢測方法的優(yōu)缺點比較[3]

代謝組學技術(shù)在腎臟疾病的應用

腎臟疾病代謝組學研究具有獨特的優(yōu)勢。腎臟是調(diào)節(jié)機體物質(zhì)代謝的重要器官，代謝組學常用的尿液標本是腎臟多組分協(xié)同合作的結(jié)果，而尿液樣本獲取簡單且無創(chuàng)傷性，是尋找腎臟疾病分子標志物理想的樣本類型。血液和腎組織也是常用的研究樣本。下文將著重概述近年來腎臟疾病代謝組學研究成果。

色氨酸代謝產(chǎn)物多項研究表明CKD患者體內(nèi)色氨酸代謝產(chǎn)物水平升高，其中硫酸吲哚酚是一種潛在的尿毒癥毒素。2009年，Kikuchi等[3]利用LC-MS方法檢測5/6腎切除大鼠的血清，證實硫酸吲哚酚是主要的尿毒癥毒素之一。硫酸吲哚酚與血清白蛋白結(jié)合率高，難以通過血液透析技術(shù)清除。體外實驗證實硫酸吲哚酚具有誘導內(nèi)皮細胞功能紊亂、白細胞粘附、氧化應激及腎近端小管細胞老化等多種功能[4]。

犬尿素通路是色氨酸重要的代謝途徑[2](圖2)，該通路代謝產(chǎn)物水平升高是發(fā)生CKD的風險因子。在奧格斯堡S4/F4合作醫(yī)療研究中，研究者運用LC-MS方法檢測了1 104例患者血清的代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)在校正估算的腎小球濾過率(eGFR)和其他風險因素后，血清中犬尿素/色氨酸比值升高組發(fā)生CKD的風險是比值未升高組的1.36倍(OR=1.36，P=0.003)[5]。弗雷明漢心臟研究隊列1 434例患者血漿的LC-MS檢測結(jié)果顯示，犬尿素(OR=1.49，P<0.001)及其下游代謝產(chǎn)物犬尿酸(OR=1.53，P<0.001)均是發(fā)生CKD的風險因子[6]。此外，慢性腎功能不全研究隊列的代謝組學研究結(jié)果也表明，色氨酸水平與eGFR成正相關(guān)，犬尿素以及犬尿酸水平與eGFR成負相關(guān)[7]。有研究證實犬尿酸可作為白細胞中G蛋白偶聯(lián)受體35的配體促進炎癥反應，而犬尿素則可促進血管內(nèi)皮松弛[8-9]，這些作用均有可能引起腎臟疾病的惡化。

圖2 色氨酸代謝途徑示意圖[3]色氨酸可通過腸道微生物代謝產(chǎn)生硫酸吲哚酚、吲哚-3-丙酸、血清素和5-羥基吲哚乙酸(灰色虛線箭頭)。色氨酸還可通過犬尿素通路代謝(灰色實線箭頭)，其中吲哚胺2，3二氧化酶1(IDO1)是該通路的第一限速酶(黑色實線箭頭)

氧化三甲胺(TMAO)TMAO主要由腎臟排泄，GFR下降可引起血清TMAO水平升高。多項研究表明血清TMAO水平升高可增加CKD患者心血管事件和死亡的發(fā)生風險。一項橫斷面研究發(fā)現(xiàn)，在220例接受過冠狀動脈造影術(shù)的CKD患者中，血清TMAO濃度與患者動脈粥樣硬化負荷以及長期死亡率有關(guān)[10]。一項針對179例CKD患者的研究同樣證實了血TMAO水平與全因死亡率密切相關(guān)[11]。Kim等[12]在隨訪3年的2 529例CKD3b期和4期患者中，利用LC-MS檢測方法發(fā)現(xiàn)，血TMAO水平是CKD患者心血管事件的獨立風險因子(HR=1.23，P<0.006)。

然而TMAO與終末期腎病(ESRD)患者心血管結(jié)局的關(guān)系并未得到一致結(jié)論。Kaysen等[13]和Kalim等[14]分別在235例和500例透析患者中發(fā)現(xiàn)，TMAO水平與心血管事件和全因死亡之間沒有相關(guān)性。Shafi等[15]利用LC-MS方法對1 232例長期透析患者的血漿進行檢測，結(jié)果則顯示TMAO水平與心血管事件相關(guān)。以上結(jié)果的不一致可能與研究的樣本量大小、種族構(gòu)成以及受試者殘余腎功能有關(guān)。TMAO水平與ESRD患者心血管事件之間的關(guān)系還有待進一步證實。

目前認為TMAO可成為CKD患者心血管事件發(fā)生的風險因素，主要與TMAO可以抑制膽固醇逆轉(zhuǎn)運，增加血小板高反應性，以及促進巨噬泡沫細胞形成等作用有關(guān)[16]。

線粒體損傷和氧化代謝異常Sharma等[17]利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)對受試者尿液中94種代謝產(chǎn)物進行了靶向檢測，與健康對照組以及糖尿病無CKD組(DM-CKD)相比，糖尿病合并CKD組(DM+CKD)尿液中分別有13種和12種代謝產(chǎn)物出現(xiàn)下降，而這些代謝產(chǎn)物均與線粒體代謝有關(guān)。而對糖尿病腎病(DN)患者腎組織和尿液的相關(guān)檢測也再次證實DN患者腎臟中線粒體活性下降。急性腎損傷(AKI)也可出現(xiàn)腎小管線粒體破壞和氧化代謝異常。PGC1α是線粒體生物合成的重要調(diào)節(jié)分子，全身敲除PGC1α的小鼠更容易出現(xiàn)AKI。Tran等[18]利用LC-MS技術(shù)，檢測PGC1α敲除小鼠以及在此基礎(chǔ)上通過缺血再灌注誘導的AKI小鼠的腎組織勻漿，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PGC1α下游產(chǎn)物煙酰胺水平均出現(xiàn)顯著下降。而對PGC1α敲除小鼠靜脈灌注煙酰胺后，可減輕腎臟損傷程度，并可阻止缺血再灌注誘導的AKI的發(fā)生。

延胡索酸是三羧酸循環(huán)重要的中間產(chǎn)物。代謝組學研究發(fā)現(xiàn)CKD患者血清的延胡索酸水平與長期死亡率密切相關(guān)[19]。與db/m小鼠相比，6～8周齡db/db小鼠的血清中延胡索酸水平顯著升高[20]。此外，在足細胞特異性過表達NADPH氧化酶4(NOX4)的DN小鼠模型尿液中，也可檢測到包括延胡索酸在內(nèi)的多種三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物的上升。在DN狀態(tài)下，延胡索酸可刺激內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，引起細胞外基質(zhì)產(chǎn)生增多，并誘導低氧誘導因子1α(HIF-1α)和轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)的表達增加[21]。此外，延胡索酸還可共價修飾半胱氨酸殘基，介導琥珀酸酯化，影響細胞的抗氧化反應[22]。

尿素循環(huán)代謝產(chǎn)物尿素循環(huán)可將體內(nèi)的氨轉(zhuǎn)化為尿素，其中鳥氨酸、瓜氨酸和精氨酸是其重要的中間產(chǎn)物[23](圖3)。Shah等[24]利用GC-MS以及LC-MS方法，檢測了30例不同分期的CKD患者的血漿結(jié)果顯示，與CKD 2期相比，CKD 3期和4期患者的鳥氨酸水平下降，而瓜氨酸、精氨酸以及二甲基精氨酸水平均出現(xiàn)升高。Duranton等[25]利用LC-MS方法證實，隨著CKD的進展，血漿中瓜氨酸/鳥氨酸、瓜氨酸/精氨酸以及非對稱性/對稱性二甲基精氨酸(ADMA/SDMA)比值增加。此外，Benito等[26]利用LC-MS技術(shù)對精氨酸-肌酸代謝通路進行的靶向性研究也表明，在兒童CKD患者血清中瓜氨酸和ADMA水平上升。有研究認為血漿中瓜氨酸以及瓜氨酸/精氨酸比值升高與CKD患者血壓異常密切相關(guān)，有潛力成為CKD患者心血管事件的預測標志物[23]。而ADMA可由腎臟中高表達的二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶1(DDAH1)催化水解成二甲胺和瓜氨酸，也可經(jīng)腎臟直接排泄到尿中。腎功能受損可直接引起血漿中ADMA水平升高。ADMA可抑制一氧化氮合成酶(NOS)的活性，導致一氧化氮(NO)合成減少，與腎臟疾病伴發(fā)的高血壓、心血管事件和免疫功能紊亂密切相關(guān)[27]。

圖3 尿素循環(huán)示意圖[29] ADMA：非對稱性二甲基精氨酸；SDMA：對稱性二甲基精氨酸；PRMT：蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶；DDAH：二甲基精氨酸-二甲基賴氨酸水解酶；NOS：一氧化氮合成酶；NO：一氧化氮；ASL：精氨琥珀酸裂解酶；ASS：精氨琥珀酸合成酶；OCT：鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶

腸源性代謝產(chǎn)物與腎臟疾病

腸道和腎臟之間存在密切的聯(lián)系，稱為腎-腸軸。在CKD患者中胃腸道失調(diào)引起的菌群紊亂以及內(nèi)毒素的產(chǎn)生，可增加腸道的通透性，誘導體內(nèi)慢性炎癥，增加心血管風險并加重尿毒癥癥狀。代謝組學可反映腸道來源的代謝產(chǎn)物與腎臟疾病之間的關(guān)系。

代謝組學研究揭示多種腸道微生物產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物具有毒性。例如近期一項代謝組學研究，利用LC-MS技術(shù)，通過檢測對健康對照、結(jié)腸切除術(shù)患者以及維持性血液透析患者的血尿標本，識別了60種具有毒性的結(jié)腸微生物來源的代謝產(chǎn)物，其中有33種物質(zhì)具有已知的化學結(jié)構(gòu)，包括硫酸吲哚酚、對甲酚硫酸鹽和TMAO[28]。此外，一項利用LC-MS技術(shù)的非靶向代謝組學研究證實腸道微生物來源的苯硫酸鹽與糖尿病腎病患者的基線白蛋白尿水平密切相關(guān)，并可預測患者2年后白蛋白尿的進展，在糖尿病腎病小鼠模型中抑制苯硫酸鹽可減輕白蛋白尿水平，可成為糖尿病腎病治療的潛在靶點[29]。與此同時，具有腎臟保護作用的短鏈脂肪酸(SCFAs)在ESRD患者中則產(chǎn)生減少[30]。SCFAs由飲食中的纖維(復合碳水化合物)經(jīng)腸道細菌發(fā)酵產(chǎn)生，主要包括醋酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽，具有抗炎、抑制組蛋白去乙酰化酶的作用，并可保護缺血再灌注引起的急性腎損傷。動物研究表明，與無特定病原體級的腎衰小鼠相比，無菌級腎衰小鼠的腸道微生物來源的尿毒癥毒素雖產(chǎn)生較少，卻因缺乏具有腎臟保護作用的SCFAs等物質(zhì)而表現(xiàn)出更嚴重的腎臟損傷[31]。隨著代謝組學研究的不斷深入，腸道微生物與腎臟疾病之間的關(guān)系將會得到更為全面的剖析。

與其他組學聯(lián)合的多組學研究

基因組學、轉(zhuǎn)錄組學和蛋白組學均可與代謝組學聯(lián)合分析。例如，Suhre等[32]利用全基因組關(guān)聯(lián)研究和非靶向質(zhì)譜為基礎(chǔ)的代謝組學研究，證實單羧基轉(zhuǎn)運蛋白9可作為肉堿外流性轉(zhuǎn)運蛋白在游離肉堿的腸道吸收和腎臟重吸收中起到重要作用。Sas等[33]結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學、代謝組學以及代謝流分析等方法證實在糖尿病腎臟中糖酵解、脂肪酸β氧化、三羧酸循環(huán)等途徑代謝流增加，尿液中三羧酸循環(huán)代謝產(chǎn)物的濃度增加可預測糖尿病腎病的疾病進展。Simic等[34]則是聯(lián)合蛋白組學和代謝組學識別并證實急性腎損傷時腎臟來源的3-磷酸甘油可促進成纖維細胞因子23的合成。多組學聯(lián)合分析可從分子多層面進行結(jié)果驗證，使得到的結(jié)果更為可靠。由于代謝組學反映體內(nèi)實時的生化反應過程，將代謝組學與其他組學聯(lián)合分析是目前組學研究的趨勢。

前景與展望

由于腎臟和代謝之間存在密切關(guān)聯(lián)，代謝組學技術(shù)在腎臟疾病的研究方面具有極大的潛能。但由于檢測方法本身的局限性，以及未知代謝產(chǎn)物識別的艱巨性，代謝組學研究仍面臨著巨大挑戰(zhàn)。加快對未知代謝產(chǎn)物的識別，以及與基因組學、轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學等多組學的結(jié)合，有助于增加結(jié)果的可靠性，促進研究結(jié)果向臨床的轉(zhuǎn)化。