miR-216a-5p和WASL在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)及其調(diào)控子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的分子機(jī)制

秦巧紅，張 楠，趙書君，李紅雨

(鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南 鄭州450052)

子宮內(nèi)膜癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居女性生殖系統(tǒng)腫瘤的第4位，并且有逐年上升的趨勢(shì)，且發(fā)病人群呈年輕化趨勢(shì)[1]。雖然通過早期的診斷和規(guī)范化治療，子宮內(nèi)膜癌患者5年生存率逐年升高，但目前對(duì)子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制認(rèn)識(shí)不足，晚期子宮內(nèi)膜癌患者的治療效果仍不理想[2-3]。因此，研究子宮內(nèi)膜癌的分子機(jī)制對(duì)于子宮內(nèi)膜癌的早期診斷及治療均具有非常重要的意義。

微小RNA(microRNA，miRNA) 是一類長(zhǎng)度為18～25 nt的高度保守的非編碼小RNA，可組裝成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，進(jìn)而通過翻譯抑制或mRNA裂解作用于特定的基因靶點(diǎn)，在細(xì)胞分化、轉(zhuǎn)移、發(fā)育和凋亡中發(fā)揮重要作用[4-5]。miR-216家族是miRNA的一種，周胤健等[6]在研究子宮內(nèi)膜癌miRNA表達(dá)譜時(shí)發(fā)現(xiàn)：miR-216b在子宮內(nèi)膜癌中低表達(dá)，但miR-216a-5p在子宮內(nèi)膜癌中的作用機(jī)制尚不清楚。濕疹血小板減少伴免疫缺陷綜合征樣蛋白(Wiskott-Aldrich syndrome like protein，WASL)屬于濕疹血小板減少伴免疫缺陷綜合征蛋白(Wiskott-Aldrich syndrome protein，WASP)家族蛋白之一，參與調(diào)控肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白2/3(actin-related protein 2/3,ARP 2/3)相關(guān)通路[7-9]并參與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展。

miR-216a-5p在不同癌癥中的作用與其靶基因有關(guān)，關(guān)于其在子宮內(nèi)膜癌中的靶基因及其影響子宮內(nèi)膜癌的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。本研究探討miR-216a-5p與WASL是否存在靶向關(guān)系，并進(jìn)一步分析miR-216a-5p靶向WASL對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，以期為子宮內(nèi)膜癌的預(yù)防和治療提供新的靶點(diǎn)和方向。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、組織標(biāo)本和主要試劑子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院(上海)生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究所。組織標(biāo)本為本院2017年8月—2018年5月手術(shù)切除的47例子宮內(nèi)膜癌患者癌組織及癌旁組織，于-80 ℃條件下保存。本研究經(jīng)本醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者及家屬均簽署知情同意書。胎牛血清、胰蛋白酶和改良Eagle培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，miR-216a-5p模擬物(miR-216a-5p)、miR-216a-5p 抑制物(anti-miR-216a-5p)、模擬物陰性對(duì)照(miR-con)、抑制物陰性對(duì)照(anti-miR-con)和小干擾RNA(siRNA)片段購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司，pcDNA3.1載體和LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，psiCHECK2載體購(gòu)自美國(guó)Promega公司，MTT試劑盒、DMSO、BCA試劑盒和PBS緩沖液購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京白奧萊博科技有限公司，TRIzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司，RIPA蛋白裂解液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，抗體購(gòu)自北京博奧森生物科技有限公司。Transwell小室(8.0 μm孔徑)和基質(zhì)膠購(gòu)于美國(guó)BD公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司，倒置熒光顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司，多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自德國(guó)BMG LabTech公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B細(xì)胞采用含10%胎牛血清的改良Eagle培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d更換 1次培養(yǎng)基。選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用0.25 %胰蛋白酶進(jìn)行消化，然后接種于96孔板中，待細(xì)胞融合至70%～80%時(shí)，分為miR-216a-5p組、miR-con組、anti-miR-con組、anti-miR-216a-5p組、沉默對(duì)照(si-con)組、沉默WASL的siRNA(si-WASL)組和共轉(zhuǎn)染miR-216a-5p+pcDNA組及miR-216a-5p+pcDNA-WASL組，將上述各組不同轉(zhuǎn)染質(zhì)粒與不完全培養(yǎng)基混合后，加入各組HEC-1-B細(xì)胞中，滴加至24孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。參照LipofectamineTM2000試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time RT-qPCR)法檢測(cè)組織和細(xì)胞中miR-216a-5p和WASL mRNA表達(dá)水平收集適量子宮內(nèi)膜癌組織及癌旁組織和處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，充分研磨后加入TRIzol裂解細(xì)胞，參照RNA抽提試劑盒說明書進(jìn)行操作。檢測(cè)RNA純度和濃度合格后，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。擴(kuò)增條件：94℃、 30 s， 64℃、30 s，72 ℃、40 s，共34個(gè)循環(huán)；72 ℃ 、8 min。以β-actin和U6為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算miR-216a-5p和WASL mRNA表達(dá)水平。WASL引物：F 5′-TCCACACAACTCAGGTCCTC-3′，R 5′-GTGGTGTAGACTCTTGGCCA-3′； β-actin引物：F 5′-GGACCTGACTGACTACCTC-3′，R 5′-TACTCCTGCTTGCTGAT-3′； miR-216a-5p引物：F 5′-TGTCGCAAATCTCTGCAGG，R 5′-CAGAGCAGGGTCCGAGGTA；U6引物：F 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，R 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.4 靶基因預(yù)測(cè)和驗(yàn)證通過生物信息學(xué)在線靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站Target genes(http://www.Targetscan.org/)預(yù)測(cè)miR-216a-5p的靶基因，并確定其與靶基因的結(jié)合位點(diǎn)。

1.5 Western blotting法檢測(cè)組織和細(xì)胞中WASL蛋白表達(dá)水平收集適量子宮內(nèi)膜癌組織及癌旁組織和處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞后離心提取總蛋白，采用BCA試劑盒參照說明書對(duì)蛋白進(jìn)行定量。蛋白樣品SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記)室溫孵育1 h，TBST洗膜后加入顯影混合液顯影。以β-actin為內(nèi)參，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)分析蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值比值代表蛋白表達(dá)水平。

1.6 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性收集適量培養(yǎng)24、48和72 h的各組細(xì)胞，分別加入20 μL MTT溶液，孵育4 h后棄掉上清，加入150 μL DMSO振蕩反應(yīng)10 min。采用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)細(xì)胞吸光度(A)值，以A值代表各組細(xì)胞增殖活性。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞中遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)收集適量處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，胰酶消化后重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105mL-1。取400 μL細(xì)胞懸液于Transwell小室的上室內(nèi)，取600 μL培養(yǎng)基于下室內(nèi)，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)過夜。取出小室，棄掉培養(yǎng)基，用棉簽小心地擦掉上室內(nèi)的細(xì)胞后用PBS沖洗3次，加入4 %多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，PBS沖洗3次。顯微鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野拍照，計(jì)算小室下表面附著的細(xì)胞數(shù)，即遷移細(xì)胞數(shù)。

取100 μL冰上融化的基質(zhì)膠加入300 μL預(yù)冷的培養(yǎng)基，混合均勻，加入小室的上室內(nèi)，使其均勻覆蓋，室溫干燥備用。調(diào)整細(xì)胞密度后參照上述細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)過程進(jìn)行，顯微鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野拍照，計(jì)算小室下表面附著的細(xì)胞數(shù)，即侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)取適量對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期miR-Con和miR-216a-5p組細(xì)胞，psiCHECK2載體以螢火蟲熒光素酶活性為內(nèi)參，野生型WASL基因表達(dá)載體psiCHECK2-WASL-3′UTR WT(WT-WASL)和突變型WASL基因表達(dá)載體psiCHECK2-WASL -3′UTR MUT (MUT-WASL)的表達(dá)為對(duì)照，參照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，首先加入1×Passive Lysis Buffer置于4℃保持20 min后得到細(xì)胞裂解液，然后吸取40 μL細(xì)胞裂解液與20 μL螢火蟲熒光素酶緩沖液，混合均勻，檢測(cè)螢火蟲熒光酶熒光值；再加入20 μL 海腎熒光素酶緩沖液，混合均勻，檢測(cè)海腎熒光酶熒光值。

2 結(jié) 果

2.1 子宮內(nèi)膜癌組織和癌旁組織中miR-216a-5p和WASL mRNA及蛋白表達(dá)水平Real-Time RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示：與癌旁組織比較，子宮內(nèi)膜癌組織中miR-216a-5p表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，WASL mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)。Western blotting 法檢測(cè)結(jié)果顯示：與癌旁組織比較，子宮內(nèi)膜癌組織中WASL蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。見圖1和表1。子宮內(nèi)膜癌組織中miR-216a-5p表達(dá)水平與WASL mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.317，P<0.01)。見圖2。

2.2 各組HEC-1-B細(xì)胞中WASL蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞增殖活性、遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)與miR-con組比較，miR-216a-5p組細(xì)胞中WASL蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞增殖活性、遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯降低(P<0.05)。與si-con組比較，si-WASL組細(xì)胞中WASL蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞增殖活性、遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)進(jìn)一步降低(P<0.05)。見圖3和圖4(插頁十)及表2。

Lane 1：Adjacent tissue；Lane 2：Endometrial carcinoma tissue.

表1 子宮內(nèi)膜癌組織和癌旁組織中miR-216a-5p和WASL mRNA及WASL蛋白表達(dá)水平

2.3 各組細(xì)胞雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)結(jié)果顯示：WASL與miR-216a-5p之間存在結(jié)合位點(diǎn)(圖5)。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染野生型WASL基因表達(dá)載體WT-WASL后，與miR-con組比較，miR-216a-5p組WT-WASL載體的細(xì)胞熒光活性明顯降低(P<0.01)；而轉(zhuǎn)染突變型WASL基因表達(dá)載體MUT-WASL后，與miR-con組比較，miR-216a-5p組MUT-WASL載體的細(xì)胞熒光活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。Western blotting法檢測(cè)結(jié)果顯示：與miR-con組比較，miR-216a-5p組細(xì)胞中WASL蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與anti-miR-con組比較，anti-miR-216a-5p組細(xì)胞中WASL蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，表明miR-216a-5p可靶向調(diào)控WASL的表達(dá)。見圖6和表4。

圖2 子宮內(nèi)膜癌組織中miR-216a-5p與WASL mRNA表達(dá)水平相關(guān)性分析

Lane 1: MiR-con group; Lane 2: MiR-216a-5p group; Lane 3: Si-con group; Lane 4: Si-WASL group.

表2 各組細(xì)胞中WASL蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞增殖活性、遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)

圖5 miR-216a-5p與WASL互補(bǔ)的核苷酸序列信息

表3 各組細(xì)胞雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

2.4 共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中WASL蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞增殖活性、遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)與miR-216a-5p + pcDNA組比較，miR-216a-5p + pcDNA-WASL組細(xì)胞中WASL蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)，細(xì)胞增殖活性、遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)明顯增加(P<0.05或P<0.01)，表明過表達(dá)WASL可逆轉(zhuǎn)miR-216a-5p對(duì)子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B細(xì)胞增殖活性、遷移和侵襲能力的抑制作用。見圖7和圖8(插頁十)及表5。

Lane 1：MiR-con group;Lane 2：MiR-216a-5p group; Lane 3：Anti-miR-con group; Lane 4：Anti-miR-216a-5p group.

表4 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞中WASL蛋白表達(dá)水平

Lane 1:MiR-216a-5p + pcDNA group;Lane 2:MiR-216a-5p + pcDNA-WASL group.

表5 共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中WASL蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞增殖活性、遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)

3 討 論

子宮內(nèi)膜癌是威脅女性生命健康的惡性腫瘤之一，采用傳統(tǒng)的手術(shù)聯(lián)合放療和化療治療效果不明顯且對(duì)人體傷害較大，新型靶向治療的出現(xiàn)可以在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)減少對(duì)正常細(xì)胞的損傷，是目前子宮內(nèi)膜癌防治的研究方向和熱點(diǎn)[10]。miRNA表達(dá)異常參與多種癌癥的進(jìn)展，影響腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)移、侵襲和凋亡[11]。邵煥軍等[12]研究顯示：膀胱癌組織中miR-216a-5p表達(dá)降低，上調(diào)miR-216a-5p表達(dá)可抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；ZHANG等[13]研究顯示：乳腺癌患者癌組織中miR-216a-5p低表達(dá)，通過靶向p21蛋白激活激酶2(p21 protein activated kinase 2，PAK2)調(diào)控乳腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。在宮頸癌細(xì)胞中miR-216a-5p也呈低表達(dá)[14]，但miR-216a-5p在子宮內(nèi)膜癌中的作用尚未見報(bào)道。本研究結(jié)果顯示：與癌旁組織比較，miR-216a-5p在子宮內(nèi)膜癌組織中低表達(dá)，WASL mRNA高表達(dá)，兩者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，表明子宮內(nèi)膜癌發(fā)展過程中miR-216a-5p與WASL mRNA異常表達(dá)有關(guān)；過表達(dá)miR-216a-5p可抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖和細(xì)胞遷移侵襲。miR-216a-5p在不同腫瘤中的作用及靶基因不同。本研究中靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果顯示：miR-216a-5p與WASL之間存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)一步將野生型和突變型WASL表達(dá)載體與miR-con、miR-216a-5p共轉(zhuǎn)染后檢測(cè)熒光素酶活性，結(jié)果證明WASL是miR-216a-5p的靶基因。

WASL蛋白是調(diào)節(jié)ARP2/3的信號(hào)分子，其介導(dǎo)從細(xì)胞表面受體到肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的信號(hào)，進(jìn)而通過激活A(yù)RP2/3復(fù)合物加速肌動(dòng)蛋白的聚合[15-16]。已有研究[17]表明：癌細(xì)胞的細(xì)胞膜受體數(shù)量、癌細(xì)胞形狀及癌大小與癌細(xì)胞的侵襲能力有關(guān)。MORRIS等[18]和WANG等[19]發(fā)現(xiàn)：WASL蛋白在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移和食管鱗癌組織中均有表達(dá)。YANG等[20]研究發(fā)現(xiàn):WASL蛋白在肝癌中廣泛存在; PENG等[21]也發(fā)現(xiàn):在葡萄膜黑素瘤組織中WASL高表達(dá)，抑制其表達(dá)可抑制癌細(xì)胞的增殖。本研究結(jié)果顯示：沉默WASL后子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖活性、遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯降低，說明WASL與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生有關(guān)；進(jìn)一步將miR-216a-5p 和 pcDNA-WASL共轉(zhuǎn)染子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞，miR-216a-5p對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的抑制作用得到部分逆轉(zhuǎn)。

綜上所述，WASL是miR-216a-5p的靶基因，過表達(dá)miR-216a-5p可通過靶向負(fù)調(diào)控WASL的表達(dá)抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖活性、遷移和侵襲能力，進(jìn)而影響子宮內(nèi)膜癌的進(jìn)展。本研究結(jié)果為miR-216a-5p靶向防治子宮內(nèi)膜癌提供了一個(gè)新的方向。