酸棗仁提取物通過調(diào)節(jié)Gi/o蛋白表達(dá)抑制cAMP-PKA通路促進(jìn)小鼠骨骼增長的研究①

吳曉龍，謝 艷，鄒吉鋒，李少俠，薛彩霞，寧桃麗，王 娜

(河南省洛陽正骨醫(yī)院(河南省骨科醫(yī)院)，河南 洛陽 471000)

人的高矮普遍被關(guān)注。而矮小身材常伴有體力差弱或智商低下等身體不良素質(zhì)。許多國家都很重視本國人民的身高，例如白俄羅斯將身材高挑的美女列為國家“戰(zhàn)略資源”[1],而日本更是通過每日一包奶提高中小學(xué)生身高發(fā)育。生長激素是促進(jìn)人體長高的第一要素，其主要在睡眠，尤其是慢波睡眠(SWS)期間分泌[2]。多數(shù)兒童在慢波睡眠期間分泌每日總量的50%～70%[3]。我們的前期實驗發(fā)現(xiàn)，酸棗仁皂苷A可以促進(jìn)慢波睡眠的延長，其機(jī)制是引起腦組織5-羥色胺1A受體(5-HT1AR)表達(dá)上調(diào)，同時生長激素分泌旺盛，小鼠體長較對照組增長[4],此次我們發(fā)現(xiàn)腦組織Gi/o蛋白表達(dá)上調(diào)，而且我們的實驗發(fā)現(xiàn)藥物可以引起腦組織AC(腺苷酸環(huán)化酶)、cAMP(環(huán)磷酸腺苷)及PKA(蛋白激酶A)含量下降，這一切暗示藥物的作用途徑可能與cAMP-PKA通路相關(guān)?；诖耍疚奶接懰釛椚侍崛∥锿ㄟ^調(diào)控Gi/o蛋白表達(dá)抑制cAMP-PKA通路促進(jìn)小鼠骨骼增長的作用機(jī)制，為其他有類似作用的藥物尋求作用靶點并提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

健康昆明種小鼠32只，SPF級，雄性，體重15～17g，動物許可證號SCXK(豫)2015-0001。動物飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～24℃，濕度50%～70%，12h明暗交替，光照7：00～19:00，噪音<50dB。

1.2 藥物與試劑

酸棗仁皂苷A(中國食品藥品檢定研究院，批號A0274)，純度>98%。酸棗仁提取物(陜西斯諾特生物技術(shù)有限公司)。小鼠生長激素(GH)ELISA試劑盒(上海紀(jì)寧實業(yè)有限公司，批號201511)；小鼠5-羥色胺(5-HT)ELISA試劑盒(上海紀(jì)寧實業(yè)有限公司，批號201510)；磷酸酶抑制劑蛋白濃度測定試劑盒(Servicebio公司，貨號G2026)；TEMED (Amresco公司，貨號Amresc00761)；蛋白marker(Therm 公司，貨號26616)；PVDF膜(Millipore，貨號IPVH00010)；兔多抗GAPDH(杭州賢至生物有限公司，AB-P-R 001)；兔多抗5-HT1AR(Bioss公司，貨號Bs-1124r)；HRP標(biāo)記山羊抗兔(Servicebio公司，貨號GB23303)。

1.3 主要儀器

酶標(biāo)儀(Labsystems Multiskan MS，芬蘭，352型)；雙垂直電泳儀(北京六一儀器廠，型號DYCZ-24DN)；轉(zhuǎn)印電泳儀(北京六一儀器廠，型號DYCZ-40D)；脫色搖床(Servicebio公司，型號TSY-B)；冷凍離心機(jī)(heal force公司，型號neofuge 13R)；掌上離心機(jī)(Servicebio公司，型號D1008E)。

1.4 方法

1.4.1 動物分組

來自同一天出生的8窩小鼠，4只/窩，隨機(jī)分為4組，分別是空白對照組、用藥組(酸棗仁提取物組)、陽性對照組(酸棗仁皂苷A組)、Gi/O蛋白選擇性抑制劑組，每組8只，保證同一窩4只小鼠隨機(jī)分在不同的組，以去除遺傳的影響。用藥組灌胃酸棗仁提取物水溶液，按照0.320mg/g體重灌胃；陽性對照組灌胃酸棗仁皂苷A水溶液，藥物用純凈水溶解，按照0.013mg/g體重灌胃；Gi/O蛋白選擇性抑制劑組也灌胃酸棗仁提取物水溶液，方法同上，并于末次灌胃后側(cè)腦室注射百日咳毒素(PTX)0.4μg/只。

1.4.2 藥物對小鼠發(fā)育期體長的影響

4組小鼠原始體長不存在統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。小鼠適應(yīng)環(huán)境1周后開始進(jìn)行灌胃操作，1次/日，灌胃后第20天分別麻醉動物，測量小鼠體長，從頭部最頂端到小鼠臀尾交接處即為小鼠體長，數(shù)據(jù)精確到1mm。

1.4.3 測定小鼠血中生長激素GH的含量

各組小鼠在測定體長后麻醉狀態(tài)下進(jìn)行眼眶取血，在室溫下待血液自然凝固20min后，以離心半徑3 000r/min離心20min，收集上清液，采用ELISA試劑盒測定GH含量。

1.4.4 Gi/O蛋白蛋白質(zhì)印跡法(westernblot)檢測小鼠腦組織

眼眶取血后的小鼠立即脫頸椎處死，將一半腦組織稱重，RIPA充分裂解提取蛋白。將等量的2×SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)蛋白上樣緩沖液加入到收集的蛋白樣品中，用沸水浴加熱10min，使蛋白變性。等待樣品冷卻到室溫后，將蛋白樣品上樣加入到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)，15μL/孔。濃縮膠電壓為80V，跑膠0.5h；分離膠電壓為120V，時間1.5h。將預(yù)先裁好的濾紙和PVDE在甲醇中浸泡3min，然后浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡5min。將轉(zhuǎn)膜裝置放置好，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，把蛋白膜立即放置到Western洗滌液中進(jìn)行漂洗，時間為5min。隨后加入5%脫脂奶粉，在搖床上緩慢搖動1h，進(jìn)行封閉。按照一抗、二抗說明書進(jìn)行操作。TBST洗滌液進(jìn)行洗滌，10min每次，×3次。顯影、定影，沖洗膠片。用BandScan分析膠片灰度值。

1.4.5小鼠腦組織AC活性、cAMP、PKA含量的檢測

剩余的一半腦組織加入PBS中冰浴條件下勻漿，離心，取上清液，按照ELISA試劑盒操作說明進(jìn)行腦組織AC活性、cAMP、PKA含量檢測。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 藥物對小鼠體長的影響

灌胃20d后陽性對照組、用藥組小鼠體長明顯大于空白對照組，存在明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；用藥組和陽性對照組比較，存在統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。抑制劑組與用藥組結(jié)果相當(dāng)。見表1。

表1 藥物對小鼠體長的影響

2.2 Gi/o蛋白western blot檢測結(jié)果

小鼠腦組織Gi/o蛋白western blot結(jié)果顯示，用藥組和陽性對照組明顯比空白對照組含量高。證明藥物可以增加腦組織內(nèi)Gi/o蛋白含量。而其抑制劑組Gi/o蛋白含量并不降低，因為蛋白抑制劑主要是通過抑制其受體表達(dá)從而抑制Gi/o蛋白所影響的信號通路的。

1 2 3 4

圖1 Gi/o蛋白western blot 檢測結(jié)果

注：1.空白對照組 2. 陽性對照組 3. 用藥組 4. Gi/o 蛋白抑制劑組

2.3 藥物對小鼠血清生長激素含量的影響

由于溶血，每組8個樣本中各丟失了幾個樣本。用藥組血清生長激素含量在數(shù)值上明顯高于其他組，特別是空白對照組，但差別不具備統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

表2 藥物對小鼠血清生長激素含量的影響

2.4 藥物對小鼠腦組織AC活性、cAMP含量、PKA含量的影響

用藥組和陽性對照組腦組織AC活性明顯低于空白對照組，而Gi/o蛋白抑制劑組與空白對照組相當(dāng)，明顯高于用藥組；用藥組和陽性對照組腦組織cAMP含量均較空白對照組有所降低，存在明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)，Gi/o蛋白抑制劑可以抑制這一現(xiàn)象，含量與空白對照組相當(dāng)；藥物引起小鼠腦組織PKA活性降低，與空白對照組比較(P<0.01)，數(shù)值上顯示用藥組PKA活性較陽性對照組高，但是無統(tǒng)計學(xué)差異。而Gi/o蛋白抑制劑可以逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。見表3。

表3 藥物對小鼠腦組織AC活性、cAMP含量、PKA含量的影響

3 討論

本實驗首先驗證了酸棗仁提取物促進(jìn)小鼠體長增長的作用，說明酸棗仁提取物可以明顯增加生長發(fā)育期小鼠的體長。由于側(cè)腦室注射Gi/o蛋白抑制劑會引起動物癱瘓，所以我們只是在第20天灌胃后進(jìn)行了一次側(cè)腦室注射，由于之前與用藥組一樣灌胃了20d藥物，所以體長與用藥組無統(tǒng)計學(xué)差異。用藥組血清生長激素含量雖然在數(shù)值上高于其他各組，但是無統(tǒng)計學(xué)差異，這可能是由于我們以往都是給藥后30min檢測血中生長激素含量，而此次，我們?yōu)榱吮M快取腦組織檢測其他指標(biāo)，在給藥20min后就采血檢測了血清生長激素含量，可能藥效還沒達(dá)到峰值。實驗中檢測生長激素含量時，因為眼眶采血有時會由于血液碰到周圍毛發(fā)及胡須而溶血，故脫落了幾例數(shù)據(jù)。實驗發(fā)現(xiàn)，酸棗仁提取物可以引起Gi/o蛋白高表達(dá)，降低腦組織AC活性，再引起cAMP含量下降，使得PKA含量下降，與我們前期實驗相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)這一系列現(xiàn)象會引起腦組織5-HT1AR高表達(dá)，從而引發(fā)慢波睡眠，引起生長激素含量升高最終引起動物體長增長[5]。

cAMP-PKA屬細(xì)胞經(jīng)典途徑之一，其過程為G蛋白偶聯(lián)受體將信號首先傳至AC,控制cAMP的含量，PKA的活性由cAMP所決定，PKA負(fù)責(zé)受體，離子通道，轉(zhuǎn)錄因子等很多蛋白的磷酸化，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的生物活性反應(yīng)及平衡。G蛋白發(fā)揮主要介導(dǎo)機(jī)制的是Gα亞基，根據(jù)偶聯(lián)的性質(zhì)，可以分為Gs、Gi/o和Gq。Gs為興奮性偶聯(lián)，可以激活下游偶聯(lián)的腺苷酸環(huán)化酶(AC)，使細(xì)胞內(nèi)第二信使cAMP濃度升高，繼而激活PKA-CREB等通路。Gi/o為抑制性偶聯(lián)，抑制AC活性，導(dǎo)致cAMP濃度下降。Gq偶聯(lián)磷脂酶PLCβ，結(jié)果導(dǎo)致DG和IP3增多，繼而激活PKC，下游底物被磷酸化后，信號得到級聯(lián)放大。因此，我們的實驗證明藥物引起了Gi/o蛋白的高表達(dá)，引起抑制cAMP-PKA途徑，引發(fā)覺醒減少，從而睡眠，特別是慢波睡眠增加引起動物身高增高的，這與報道相符[6]。

由于目前沒有市售的促進(jìn)慢波睡眠的成藥和中草藥及單體成分。既往研究[7]發(fā)現(xiàn)酸棗仁皂苷A的具有促進(jìn)慢波睡眠和生長激素分泌作用。文中所用藥物為酸棗仁提取物，其總皂苷含量為5%，而酸棗仁提取物中具有促進(jìn)睡眠的作用主要是皂苷A和皂苷D，而且研究表明皂苷A作用更好[8]。文中實驗中酸棗仁提取物的用量是將酸棗仁提取物折合成酸棗仁皂苷A的含量。而實驗發(fā)現(xiàn)其促進(jìn)小鼠增高作用與酸棗仁皂苷A相當(dāng)。由于提取物比單體成分價格低廉，這就大大降低了以后臨床使用的成本。本實驗進(jìn)一步驗證了其作用通路，為今后研究藥物通過促進(jìn)慢波睡眠促進(jìn)骨骼增高提供了研究思路，為以Gi/o蛋白、cAMP-PKA通路上如cAMP、AC、PKA為靶點的促進(jìn)慢波睡眠的藥物研究提供了研究基礎(chǔ)。