黃芩素與黃芩苷微生物和肝臟代謝異同研究

解立科 田小亭郭小珍劉 歡王洋洋陳明蒼*包海鷹*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林長春 130300； 2.中國科學(xué)院上海藥物研究所，上海 201203）

黃芩為唇形科黃芩屬植物黃芩Scutellaria baicalensisGeorgi 的干燥根，可清熱燥濕、涼血解毒、瀉火安胎等［1］，其主要黃酮類成分黃芩素和黃芩苷具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、保肝等活性［2-7］。

黃芩苷是由黃芩素與一分子葡萄糖醛酸結(jié)合形成的糖苷類化合物，大鼠分別靜脈注射等量的黃芩苷和黃芩素后在血中均能同時(shí)檢測(cè)到兩者，表明它們可以在體內(nèi)相互轉(zhuǎn)化［8］，但體內(nèi)藥效并不一致。在飲水電擊沖突實(shí)驗(yàn)中，黃芩素、黃芩苷抗焦慮的藥效劑量分別為10、20 mg／kg［9］，這可能與黃芩素有比黃芩苷更高的生物利用度有關(guān)，為后者的236%［10］。目前，盡管已有多篇文獻(xiàn)對(duì)動(dòng)物口服黃芩苷或黃芩素的體內(nèi)代謝物進(jìn)行了系統(tǒng)研究［11-12］，但并不能明確其具體的生成位點(diǎn)，需要借助體外代謝工具進(jìn)行驗(yàn)證。針對(duì)黃芩苷和黃芩素的體外代謝，僅有文獻(xiàn)鑒定前者在人體外腸道菌中的代謝物［13］，尚未比較兩者在大鼠肝臟和腸道菌的體外代謝。

近年來，LC-MS 由于其靈敏高、速度快、準(zhǔn)確度好等優(yōu)勢(shì)，在藥物代謝物鑒定方面廣泛應(yīng)用［14］。質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)的可靠性和可信度取決于所用的儀器，其中LC-Q-TOF 因其高分辨數(shù)據(jù)和快速掃描速度，成為高效率的代謝物鑒定工具；相比于低分辨數(shù)據(jù)，Q-TOF 質(zhì)量分析器可提供精確的分子量，生成分子離子和碎片離子的元素組成式，區(qū)分具有相似分子量的化合物［15］。

本研究擬采用大鼠腸道菌和肝勻漿體外孵育模型，利用高分辨質(zhì)譜HPLC-Q-TOF 鑒定黃芩苷、黃芩素微生物和肝臟代謝產(chǎn)物的異同，以期為闡釋兩者體內(nèi)外代謝規(guī)律提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 系列高效液相色譜儀與具有雙噴Jet stream 離子源的Agilent 6530 Q-TOF 相連（美國Agilent 公司）；高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；精密天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；超純水器（美國Millipore 公司）；真空濃縮儀（美國Thermo Fisher 公司）；Vortex-Genie 振蕩器（美國Scientific 公司）；超純水器（美國Millipore 公司）。

1.2 試劑與藥物 黃芩苷（純度≥98%，批號(hào)MUST-14083014）、黃芩素 （純度≥98%，批號(hào)MUST-17031608） 對(duì)照品均購自上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司。乙腈（色譜純，德國Merck 公司）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。還原輔酶Ⅱ四鈉鹽（NADPH）（純度＞95%，瑞士羅氏公司）；磷酸緩沖液（美國GE 公司）；DMSO （美國Sigma 公司）；厭氧培養(yǎng)液（批號(hào)20180616，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司）。

1.3 動(dòng)物 SD 大鼠［生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （滬）2017-0005，體質(zhì)量（200±20） g］購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，飼養(yǎng)于中國科學(xué)院上海藥物研究所屏障環(huán)境實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室 ［溫度 （24±2） ℃，相對(duì)濕度（70±5）%］。

2 方法

2.1 溶液制備

2.1.1 供試品溶液 精密稱取適量黃芩素、黃芩苷對(duì)照品，DMSO 溶解后加入磷酸緩沖液制成400 μmol／L，即得（DMSO＜1／1 000）。

2.1.2 還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADPH） 溶液 精密稱取適量NADPH，加磷酸鹽緩沖液制成1 mg／150 μL，即得，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.1.3 厭氧培養(yǎng)液 稱取厭氧培養(yǎng)液9.5 g，加熱攪拌溶于1 000 mL 蒸餾水中，121 ℃高壓滅菌15 min，即得。

2.2 大鼠肝勻漿和腸道菌制備 空白大鼠過夜禁食，自由飲水，無菌條件下腹主動(dòng)脈取血處死，迅速剪開腹腔取出肝臟，立即放于冰塊上，用預(yù)冷生理鹽水沖洗至灰色，稱定質(zhì)量，去除粘連組織后剪碎，加入5 倍量磷酸緩沖溶液，放入勻漿機(jī)中制備勻漿。

另取空白組大鼠過夜禁食，自由飲水，無菌條件下腹主動(dòng)脈取血處死，取腸道內(nèi)容物，腸壁用少量（生理鹽水） 沖洗，與腸道內(nèi)容物合并，按1 g／5 mL劑量加入無菌生理鹽水，快速攪拌均勻，醫(yī)用紗布過濾得腸道菌溶液。所有操作均在厭氧條件下進(jìn)行。

2.3 大鼠肝勻漿和腸道菌孵化反應(yīng)體系 肝勻漿孵化體系的總反應(yīng)體積為200 μL。分為空白組（不含黃芩苷、黃芩素） 和400 μmol／L 黃芩苷、黃芩素組。先將50 μL 肝勻漿液加入EP 管中，再依次加入黃芩苷、黃芩素供試品溶液，NADPH 溶液，緩沖液各50 μL，反復(fù)吹打混勻以防止產(chǎn)生氣泡，在37 ℃恒溫?fù)u床中孵育，于10、30、60、120 min時(shí)加入200 μL 預(yù)冷乙腈終止反應(yīng)，4 ℃下14 000 r／min 離心10 min，取上清液待分析。所有樣品平行制備3 份。

取厭氧培養(yǎng)液18 mL，加入腸道菌及黃芩素、黃芩苷供試品溶液各1 mL，使其終濃度為16 μmol／L，置于厭氧培養(yǎng)罐中，迅速放入?yún)捬醍a(chǎn)氣袋中，封閉體系，在37 ℃下厭氧培養(yǎng)，于0、1、2、4、8、12、24 h 加3 倍量冰乙腈終止反應(yīng)，14 000 r／min離心10 min，取上清液待分析。所有樣品平行制備3 份。

2.4 分析條件

2.4.1 色譜條件 ACE Excel 3 super C18色譜柱（100 nm×2.1 nm，3.0 μm）；流動(dòng)相0.1% 甲酸（A） -乙腈（B），梯度洗脫（0～2 min，80% A；2～3 min，70%A；3～10 min，70%A；10～12 min，10%A；12～15 min，10% A；15～16 min，80% A；16～20 min，80%A）；體積流量0.35 mL／min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.4.2 質(zhì)譜條件 ESI 離子源，正離子檢測(cè)模式；毛細(xì)管電壓4 kV；噴霧電壓5 000 V；出口電壓110 V；霧化氣壓力35 Pa；氮?dú)怏w積流量5 L／min，溫度300 ℃；鞘氣體積流量11 L／min，溫度350 ℃。采用高分辨全掃描，一級(jí)掃描分辨率30 000，二級(jí)掃描分辨率15 000，質(zhì)量掃描范圍m／z100～1 200。

2.5 數(shù)據(jù)分析 利用Qualitative Analysis B.06.00和MetaboliteID B.04.00 工作站進(jìn)行處理。

3 結(jié)果

3.1 檢測(cè)條件優(yōu)化及其裂解規(guī)律推斷 本研究考察了不同比例甲酸作為流動(dòng)相改性劑對(duì)色譜-質(zhì)譜分析的影響，發(fā)現(xiàn)0.1%甲酸可獲得良好的色譜峰形和質(zhì)譜響應(yīng)信號(hào)。黃芩苷、黃芩素在正離子下產(chǎn)生的碎片離子種類和強(qiáng)度相關(guān)優(yōu)于負(fù)離子，因此檢測(cè)均采用正離子模式。另外，鑒于原形和代謝物具有共同骨架，后者推測(cè)要依賴于前者裂解途徑。

原形成分M0-1黃芩素準(zhǔn)分子離子峰為［M ＋H］＋m／z271.060 3，保留時(shí)間12.174 min，分子式C15H10O5。其裂解途徑遵循黃酮類化合物的經(jīng)典RDA 裂解。從C 環(huán)1，3 位裂解，生成一對(duì)互補(bǔ)離子，即含有A 環(huán)的離子m／z169.012 8 和含有B 環(huán)的離子m／z103.053 9。碎片離子m／z169.012 8 相繼脫去 H2O、CO 分子，形成碎片離子m／z151.002 2、123.007 2。準(zhǔn)分子離子還可以先脫去一分子水形成碎片離子m／z253.049 8，并相繼脫去 CO、CO 生成碎片離子m／z225.054 4、197.053 9。其裂解規(guī)律見圖1A。

原形成分M0-2黃芩苷準(zhǔn)分子離子峰為［M ＋H］＋m／z447.091 9，保留時(shí)間為6.920 min，分子式C21H18O11。黃芩苷為黃芩素的葡萄糖醛酸化，因此在二級(jí)質(zhì)譜圖上首先脫去一分子葡萄糖醛酸（176 Da），形成基峰m／z271.059 5。碎片離子m／z271.059 5 的裂解途徑同黃芩素一致，其裂解規(guī)律見圖1B。

圖1 各成分質(zhì)譜裂解規(guī)律Fig.1 Framentation rules of various constituents

3.2 黃芩素、黃芩苷代謝產(chǎn)物在肝勻漿孵育體系中的分析鑒定 以黃芩苷和黃芩素的裂解規(guī)律為基礎(chǔ)，根據(jù)精準(zhǔn)分子質(zhì)量數(shù)據(jù)結(jié)合質(zhì)譜裂解碎片信息，在黃芩素、黃芩苷肝勻漿孵育樣品中分別鑒定出12、15 個(gè)代謝物，離子流圖見圖2，各代謝產(chǎn)物質(zhì)譜數(shù)據(jù)見表1，兩者在肝勻漿中的代謝途徑見圖3。

M1準(zhǔn)分子離子峰為［M＋H］＋m／z287.055 6，保留時(shí)間6.329 min，分子式C15H10O6。從分子式上看M1與黃芩素相差一個(gè)氧原子。二級(jí)質(zhì)譜上準(zhǔn)分子離子峰脫去一分子H2O，生成碎片離子m／z269.040 0，碎片離子m／z269.040 0 繼續(xù)脫去CO、CO 生成碎片離子m／z241.045 8、213.049 7。另外M1可發(fā)生RDA 裂解生成帶有A 環(huán)的碎片離子m／z169.014 2 和帶有B 環(huán)的碎片離子m／z119.050 4。因此，確定羥基化發(fā)生在B 環(huán)上，M1為黃芩素的羥基化產(chǎn)物。

M2、M8準(zhǔn)分子離子峰分別為［M ＋H］＋m／z433.112 6、433.114 1，保留時(shí)間分別為6.924、8.543 min，分子式C21H20O10。二級(jí)圖譜上，M2準(zhǔn)分子離子峰脫去一分子葡萄糖（162 Da） 形成基峰m／z271.058 1?；逡来蚊撊2O、CO、CO形成碎片離子m／z253.046 8、225.052 5、197.059 4，也可發(fā)生RDA 裂解碎片離子m／z169.011 4、103.050 2。因此，確定M2、M8分別為黃芩素的糖基化反應(yīng)產(chǎn)物。

M0-2、M9準(zhǔn)分子離子峰分別為［M＋H］＋m／z447.092 6、447.093 0，分子式C21H18O11，保留時(shí)間分別為6.920、8.636 min，與對(duì)照品比對(duì)，鑒定M0-2為黃芩苷。M9二級(jí)質(zhì)譜圖給出基峰m／z271.060 7，為準(zhǔn)分子離子峰脫去葡萄糖醛酸（176 Da） 形成，基峰接連脫去H2O、CO、CO 生成碎片離子m／z253.049 5、225.054 2、197.059 4。因此，確定M9為黃芩素的葡萄糖醛酸化產(chǎn)物。

M3準(zhǔn)分子離子峰為［M＋H］＋m／z255.066 9，分子式C15H10O4，保留時(shí)間7.324 min。準(zhǔn)分子離子峰接連脫去CO、CO 生成碎片離子m／z227.075 3、119.074 2，發(fā)生RDA 裂解生成碎片離子m／z153.073 6、103.054 3，表明M3的分子式及其碎片離子均比黃芩苷少了一個(gè)氧原子。因此，確定M3為黃芩素脫羥基化產(chǎn)物。

M4一級(jí)質(zhì)譜圖中給出的準(zhǔn)分子離子峰［M＋H］＋m／z447.130 7，分子式C22H22O10，保留時(shí)間7.935 min。二級(jí)質(zhì)譜圖給出的基峰m／z285.067 9，與準(zhǔn)分子離子峰相差一分子葡萄糖（162 Da），碎片離子m／z285.067 9 繼續(xù)脫去甲基基團(tuán)形成m／z270.043 1。因此，確定M4為黃芩素的甲基化糖基化反應(yīng)產(chǎn)物。

M5、M10一級(jí)質(zhì)譜圖中給出的準(zhǔn)分子離子峰分別為［M＋H］＋m／z403.103 8、403.104 0，保留時(shí)間分別為8.131、9.040 min，分子式C20H18O9。M5、M10的準(zhǔn)分子離子峰脫掉分子量為132 Da 的基團(tuán)后形成的碎片離子m／z271.058 4、271.059 0，即黃芩素的準(zhǔn)分子離子峰。因此，確定M5、M10為黃芩素的糖基化（阿拉伯糖或木糖） 反應(yīng)產(chǎn)物。

M6準(zhǔn)分子離子峰為［M＋H］＋m／z461.108 1，保留時(shí)間8.139 min，分子式C22H20O11。二級(jí)圖譜給出的碎片m／z285.075 1，為準(zhǔn)分子離子峰脫去葡萄糖醛酸 （176 Da） 形成，碎片離子m／z285.075 1 繼續(xù)脫去甲基基團(tuán)形成碎片離子m／z270.053 1。因此，確定M6為黃芩苷的甲基化葡萄糖醛酸化。

圖2 各成分提取離子流圖Fig.2 Extracted ion current chromatograms of various constituents

M7準(zhǔn)分子離子峰［M＋H］＋m／z431.097 7，分子式C21H18O10，保留時(shí)間8.204 min。二級(jí)圖譜上基峰m／z255.064 9 為準(zhǔn)分子離子峰脫去葡萄糖醛酸（176 Da） 形成。基峰發(fā)生RDA 裂解可生成碎片離子m／z153.016 9、103.051 9，推測(cè)M7在A環(huán)上發(fā)生了還原反應(yīng)，丟失了羥基。因此，確定M7為黃芩苷的脫羥基反應(yīng)產(chǎn)物。

M11、M16準(zhǔn)分子離子峰分別為［M＋H］＋m／z301.072 2、301.070 3，分子式C15H8O4，保留時(shí)間分別為11.766、13.592 min。M11準(zhǔn)分子離子峰脫去甲基基團(tuán)形成基峰m／z286.048 1，基峰脫去CO生成m／z258.053 2?；灏l(fā)生RDA 裂解生成碎片m／z169.009 4、119.085 4。因此，確定M11為黃芩素羥基化甲基化代謝產(chǎn)物，M16為其同分異構(gòu)體。

M12準(zhǔn)分子離子峰為［M＋H］＋m／z253.048 8，分子式C15H8O40，保留時(shí)間12.523 min。從分子式上看，M12與黃芩素相差一個(gè)H2O 分子。M12二級(jí)質(zhì)譜給出的碎片離子m／z225.058 1、197.062 9為準(zhǔn)分子離子峰接連脫去CO 生成。M12也可發(fā)生RDA 裂解，生成碎片離子m／z169.014 2、103.055 4。因此，確定M12為5-羥基，6，7-環(huán)氧-2 苯基色原酮或7-羥基，5，6-環(huán)氧-2 苯基色原酮。

M0-1、M13準(zhǔn)分子離子峰分別為［M＋H］＋m／z271.059 9、271.059 6，分子式C15H10O5，保留時(shí)間分別為12.574、13.491 min。與對(duì)照品比對(duì)，M0-1為黃芩素。M13準(zhǔn)分子離子峰相繼丟失H2O、CO、CO，分別生成碎片m／z253.044 3、225.058 6、197.062 9，發(fā)生RDA 裂解生成碎片離子m／z169.062 9、103.055 6。鑒于M13的裂解途徑與黃芩素保持一致，但具有不同的保留時(shí)間，因此確定M13為黃芩素同分異構(gòu)體。

M15準(zhǔn)分子離子峰為［M＋H］＋m／z285.076 7，分子式C16H12O5，保留時(shí)間14.240 min。分子式與黃芩素相比相差一個(gè)甲基基團(tuán)。M15準(zhǔn)分子離子峰丟失一個(gè)甲基基團(tuán)后形成基峰離子m／z271.049 6，基峰的裂解途徑與黃芩素一致，即形成碎片離子m／z242.058 0、224.046 7、196.053 1、168.005 1 的碎片離子。因此，確定M15為黃芩素的甲基結(jié)合物。

3.3 黃芩素、黃芩苷代謝產(chǎn)物在腸道菌孵育體系中的分析鑒定 以黃芩苷、黃芩素的裂解規(guī)律為基礎(chǔ)，根據(jù)精準(zhǔn)分子質(zhì)量數(shù)據(jù)結(jié)合質(zhì)譜裂解碎片信息，在黃芩素、黃芩苷腸道菌孵育樣品中分別鑒定出3、4個(gè)代謝物，離子流圖見圖4，各代謝產(chǎn)物質(zhì)譜信息見表2，兩者在腸道菌中的代謝途徑見圖5。

M16準(zhǔn)分子離子峰為［M＋H］＋m／z287.053 7，保留時(shí)間7.739 min，分子式C15H10O6。M16與黃芩素在分子式上相差一個(gè)氧原子，推測(cè)為發(fā)生羥基化反應(yīng)。M16準(zhǔn)分子離子峰發(fā)生RDA 裂解生成帶有A環(huán)的基峰m／z185.006 3 和帶有B 環(huán)的碎片離子m／z103.054 3，基峰繼續(xù)脫去H2O、CO 形成m／z166.996 8、139.001 4。因此，確定M16羥基化發(fā)生在A 環(huán)上，為黃芩素的羥基化產(chǎn)物5，6，7，8-四羥基黃酮。

表1 黃芩素、黃芩苷肝勻漿代謝產(chǎn)物質(zhì)譜信息Tab.1 MS information of baicalein and baicalin metabolites in rat liver homogenate

M17準(zhǔn)分子離子峰為［M＋H］＋m／z301.069 6，保留時(shí)間11.97 7 min，分子式C16H12O6。M17準(zhǔn)分子離子峰脫去甲基基團(tuán)生成碎片離子m／z286.045 5，也可發(fā)生RDA 裂解生成帶有A 環(huán)的基峰m／z183.998 9和帶有B 環(huán)的碎片離子m／z119.085 4。因此，確定M17的甲基化發(fā)生在A 環(huán)上，羥基化發(fā)生在B 環(huán)上，為黃芩素的甲基化、羥基化結(jié)合物。

M18準(zhǔn)分子離子峰為［M＋H］＋m／z255.064 9，分子式C15H10O4，保留時(shí)間14.504 min。準(zhǔn)分子離子峰接連發(fā)生RDA 裂解，生成帶有A 環(huán)的基峰m／z153.017 4 和碎片離子m／z103.054 0，基峰可脫去一分子水形成碎片離子m／z135.044 8。因此，確定M18為黃芩素脫羥基化產(chǎn)物。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)建立HPLC-Q-TOF／MS 法研究黃芩苷、黃芩素在體外肝勻漿和腸道菌中的代謝情況，發(fā)現(xiàn)18 個(gè)代謝產(chǎn)物，包括在體外報(bào)道過的3 個(gè)［13］、體內(nèi)報(bào)道過的11 個(gè)［11-12］，其中M4、M5、M10、M16為首次發(fā)現(xiàn)。

圖3 各成分肝勻漿中代謝途徑Fig.3 Metabolic pathways of various constituents in liver homogenates

圖4 各成分經(jīng)腸道菌代謝產(chǎn)物提取離子流圖Fig.4 Extracted ion chromatogram of various constituents in intestinal bacteria

在黃芩素、黃芩苷肝勻漿孵育液中分別檢測(cè)到12、15 個(gè)代謝物。黃芩素主要經(jīng)歷的Ⅰ相反應(yīng)有脫水反應(yīng)、羥基化、脫羥基化反應(yīng)，Ⅱ相反應(yīng)有糖基化、葡萄糖醛酸化、甲基化等反應(yīng)；黃芩苷主要經(jīng)歷的Ⅰ相反應(yīng)有羥基化和脫羥基反應(yīng)，Ⅱ相反應(yīng)類型有糖基化、甲基化、葡萄糖醛酸化等。肝臟所含豐富的Ⅰ相、Ⅱ相代謝酶是黃芩苷、黃芩素發(fā)生廣泛代謝途徑的主要原因［16］，其中共有的有12 個(gè)（M0-1、M0-2、M1、M2、M3、M4、M5、M8、M11、M13、M14、M15），而M6、M7、M9、M10只存在于黃芩苷肝勻漿孵育液中，M12只存在黃芩素肝勻漿孵育液中。黃芩苷、黃芩素在各自肝勻漿孵育體系中均能檢測(cè)到，表明兩者在肝臟中可相互轉(zhuǎn)化，也可能是有上述共同代謝物的原因之一。

表2 黃芩素、黃芩苷腸道菌代謝產(chǎn)物質(zhì)譜信息Tab.2 MS information of baicalein and baicalin metabolites in intestinal bacteria

圖5 各成分經(jīng)大鼠腸道菌代謝途徑Fig.5 Metabolic pathways of various constituents in intestinal bacteria

在黃芩苷的腸道菌孵育液中檢測(cè)到其脫糖代謝物黃芩素，在腸道菌的作用下可繼續(xù)發(fā)生甲基化、羥基化、脫羥基化代謝反應(yīng)。但在黃芩素的大鼠腸道菌孵育液中并沒有檢測(cè)到黃芩苷，表明在大鼠腸道菌作用下它僅能單向生成黃芩素，而后者卻不能代謝生成前者。

綜上所述，本研究通過HPLC-Q-TOF 法鑒定黃芩苷、黃芩素在肝勻漿、腸道菌孵育液中的代謝物，明確了兩者代謝物的生成位點(diǎn)，可為闡釋其體內(nèi)代謝行為提供依據(jù)。