白細(xì)胞分化抗原36的棕櫚?；稽c(diǎn)突變對(duì)HepG2細(xì)胞自噬的影響*

俞 婷， 夏 珺， 趙 蕾

（重慶醫(yī)科大學(xué)脂糖代謝性疾病重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400016）

自噬是細(xì)胞利用溶酶體降解自身受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的過程，是一種正常的生理現(xiàn)象［1］。自噬參與了各種疾病的發(fā)生發(fā)展，包括腫瘤、非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）等［2-3］。

白細(xì)胞分化抗原36（cluster of differentiation 36，CD36）是一種模式識(shí)別受體，能識(shí)別多種內(nèi)源性和外源性有害物質(zhì)，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［4］。既往研究表明，在肝細(xì)胞中過表達(dá)CD36 可以抑制自噬，下調(diào)CD36 的表達(dá)則可激活自噬［5］。我們課題組近期研究表明CD36 棕櫚?；揎椗c其功能密切相關(guān)，CD36 棕櫚?；揎椖軌蚋淖兤湓诩?xì)胞膜上的定位，增加細(xì)胞對(duì)游離脂肪酸的攝取，抑制脂肪酸β 氧化，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚和炎癥，而CD36 棕櫚?；稽c(diǎn)突變能減少CD36在細(xì)胞膜上的定位，降低細(xì)胞對(duì)脂肪酸的攝取，改善細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚和炎癥［6］。然而，目前尚不清楚CD36 棕櫚?；揎椩谧允芍械淖饔?。因此本研究擬通過構(gòu)建CD36 棕櫚?；稽c(diǎn)突變的HepG2細(xì)胞，探討CD36棕櫚?；稽c(diǎn)突變對(duì)HepG2細(xì)胞自噬的影響及其分子機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞

參照本實(shí)驗(yàn)室已發(fā)表文獻(xiàn)［6］，構(gòu)建過表達(dá)野生型CD36（WT-CD36）和棕櫚?；稽c(diǎn)突變型CD36（AA-SS）的HepG2細(xì)胞。用PCI-CD36作為模板和突變引物，用多點(diǎn)定向誘變?cè)噭┖校≦uick Change ⅡXL，Agilent Technologies）生成 CD36 突變體。慢病毒構(gòu)建體由上海基因化學(xué)公司提供，包括GV341 空載體（陰性對(duì)照，negative control，NC）、含WT-CD36的 GV341 載體（WT-CD36）及含 AA-SS 的 GV341 載體。按MOI=10來感染HepG2細(xì)胞，并用Sangon提供的嘌呤霉素篩選細(xì)胞，分別命名為NC-HepG2、WTCD36-HepG2和AA-SS-HepG2。

2 主要試劑

棕櫚酸（palmitate acid，PA）和牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）購(gòu)于Sigma；GFP-mRFP標(biāo)記的微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）雙熒光腺病毒購(gòu)于上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司；BCA 蛋白定量檢測(cè)試劑盒和兔抗人β-actin 多克隆抗體購(gòu)于北京鼎國(guó)公司；兔抗人轉(zhuǎn)錄因子EB（transcription factor EB，TFEB）多克隆抗體購(gòu)自于Proteintech；兔抗人FAT/CD36 和鼠抗人FAT/CD36 單克隆抗體購(gòu)于Novus；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG 抗購(gòu)于北京中杉金橋公司；TRIT 熒光Ⅱ抗購(gòu)于北京中杉金橋公司；PVDF 膜和磁珠購(gòu)于Millipore；ECL 化學(xué)發(fā)光試劑購(gòu)于Bio-Rad；羥胺（hydroxylamine，HAM）購(gòu)于Sigma。

3 主要方法

3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞用含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。

3.2 熒光共聚焦顯微鏡檢測(cè)自噬小體和自噬-溶酶體以及TFEB核轉(zhuǎn)位 將WT-CD36-HepG2和AA-SSHepG2 細(xì)胞分別種到共聚焦皿中，待細(xì)胞完全貼壁后，加入 LC3 雙熒光腺病毒（1∶20 000），72 h 后，0.2% BSA 饑餓處理 12 h，0.2 mmol/L PA 處理24 h，通過共聚焦顯微鏡觀察熒光情況，反映細(xì)胞自噬狀態(tài)（紅色熒光增強(qiáng)，同時(shí)綠色熒光增強(qiáng)，表明自噬小體形成增加，自噬-溶酶體形成減少；紅色熒光增強(qiáng)伴綠色熒光減弱，表明自噬小體形成增加，自噬-溶酶體形成增加）。另將WT-CD36/AA-SS-HepG2 細(xì)胞種到共聚焦皿，0.2% BSA 饑餓處理12 h，0.2 mmol/L PA 處理 24 h，冰甲醇固定細(xì)胞，3% BSA 封閉，TFEB 抗體（1∶50）4℃孵育過夜，熒光Ⅱ抗室溫孵育30 min，DAPI 染色5 min，共聚焦顯微鏡下觀察TFEB的核轉(zhuǎn)位情況。

3.3 免疫共沉淀-酰基-生物素置換實(shí)驗(yàn)（IPABE） 用含有蛋白酶抑制劑和N-乙基馬來酰亞胺的裂解緩沖液提取總蛋白質(zhì)。用抗CD36 抗體和磁珠沉淀CD36 蛋白后，將樣品用緩沖液重懸。在pH 7.2 緩沖液稀釋的樣品中加入羥胺（+HAM）或加入羥胺緩沖液（-HAM），室溫旋轉(zhuǎn)混勻50 min。加入生物素BMCC 緩沖液，4℃旋轉(zhuǎn)混勻50 min，然后用樣品緩沖液煮沸來洗脫磁珠上的蛋白質(zhì)，通過SDSPAGE 分離上清液，并將其電轉(zhuǎn)至PVDF 膜。檢測(cè)棕櫚?；腃D36 時(shí)，將膜與HRP 偶聯(lián)的鏈霉親和素（streptavidin，Strep）在37℃下孵育1 h；檢測(cè)總CD36時(shí)，將膜與抗CD36抗體4℃孵育過夜，隨后用HRP偶聯(lián)的Ⅱ抗室溫孵育1 h。

3.4 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá) 用試劑盒提取蛋白質(zhì)，用BCA 試劑盒檢測(cè)并標(biāo)化蛋白，SDS-PAGE 分離蛋白，PVDF膜轉(zhuǎn)膜后用3%BSA于37℃封閉1 h，I抗4℃孵育過夜，HRP 標(biāo)記的Ⅱ抗室溫孵育1 h，TBST 洗膜，ECL 試劑顯影。通過ImageJ 軟件分析條帶。

3.5 免疫共沉淀檢測(cè)CD36/Fyn 共聚體的形成 將裂解好的蛋白與抗體孵育（4℃）過夜，然后添加蛋白A/G 磁珠，4℃旋轉(zhuǎn)混勻1～3 h。在SDS 樣品緩沖液中煮沸5 min，洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)，并通過SDS-PAGE 分離上清液，PVDF 膜轉(zhuǎn)膜后用3% BSA 于37℃封閉1 h，I 抗4℃孵育過夜，HRP 標(biāo)記的Ⅱ抗室溫孵育1 h，使用ECL試劑進(jìn)行檢測(cè)。通過ImageJ分析條帶。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所得到的數(shù)值均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示。兩組間均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，多重比較采用Tukey檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 構(gòu)建過表達(dá)野生型/棕櫚酰化位點(diǎn)突變型CD36的HepG2細(xì)胞

Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，與NC 組相比，WTCD36 和 AA-SS 組 CD36 蛋白的表達(dá)均顯著增加（P＜0.01），見圖1A；IP-ABE 檢測(cè)到在 WT 組中 CD36 蛋白發(fā)生了棕櫚酰化修飾，而在AA-SS 組中CD36 未發(fā)生棕櫚酰化修飾（P＜0.01），表明模型構(gòu)建成功，見圖1B。

Figure 1.Identification of HepG2 cells overexpressing wild-type CD36（WT-CD36）/mutated CD36 at palmitoylation sites（AA-SS）.A:the protein expression of CD36 in NC，WT-CD36 and AA-SS cell lines；B:palmylation modification in WT-CD36 and AA-SS cell lines.HAM:hydroxylamine；Strep:streptavidin.Mean±SEM. n=3.**P＜0.01 vs NC group；##P＜0.01 vs WTCD36-HAM group；△△P＜0.01 vs WT-CD36+HAM group.圖1 HepG2細(xì)胞中過表達(dá)野生型CD36/棕櫚?；稽c(diǎn)突變型CD36細(xì)胞的鑒定

2 HepG2 細(xì)胞中CD36 的棕櫚?；稽c(diǎn)突變可以增強(qiáng)自噬

與WT-CD36 組細(xì)胞比，AA-SS 組細(xì)胞紅色熒光顯著增強(qiáng)，綠色熒光顯著減弱（P＜0.01），自噬小體增加，且自噬-溶酶體也增加，自噬-溶酶體流增強(qiáng)，見圖2。

3 HepG2 細(xì)胞中CD36 的棕櫚?；稽c(diǎn)突變可以促進(jìn)TFEB核轉(zhuǎn)位

AA-SS 組細(xì)胞中紅色熒光（TFEB）較WT-CD36組明顯增強(qiáng)，且紅色熒光與細(xì)胞核的共定位也明顯增強(qiáng)，即TFEB核轉(zhuǎn)位顯著增加（P＜0.05），見圖3。

4 CD36 的棕櫚?；稽c(diǎn)突變對(duì)LKB1/AMPK 途徑的影響

Western blot 結(jié)果顯示，與WT-CD36 組相比，AA-SS 組p-LKB1/LKB1 比值顯著降低（P＜0.01），p-AMPK/AMPK比值顯著升高（P＜0.01），見圖4。

5 CD36 的棕櫚?；稽c(diǎn)突變使CD36/Fyn 的蛋白共聚體減少

免疫共沉淀的結(jié)果表明，與WT-CD36 組相比，AA-SS 組的CD36/Fyn 共聚體形成顯著減少（P＜0.01），見圖5。

Figure 2.Effect of palmitoylation site mutation of CD36 on the autophagy of HepG2 cells.A:autophagy in WT-CD36/AA-SS-HepG2 cells was detected by dual fluorescent adenovirus（scale bar=10 μm）；B，C:the Pearson correlation coefficient and correlation rate.Mean±SEM. n=3.**P＜0.01 vs WT-CD36 group.圖2 CD36蛋白棕櫚?；稽c(diǎn)突變對(duì)HepG2細(xì)胞自噬的影響

Figure 3.Effect of palmitoylation site mutation of CD36 on TFEB nuclear translocation in HepG2 cells.Scale bar=10 μm.Mean±SEM. n=3.*P＜0.05 vs WT-CD36 group.圖3 CD36蛋白棕櫚酰化位點(diǎn)突變對(duì)HepG2細(xì)胞中TFEB核轉(zhuǎn)位的影響

Figure 4.Effect of CD36 palmitoylation site mutation on LKB1/AMPK pathway in HepG2 cells.Mean±SEM. n=3.**P＜0.01 vs WTCD36 group.圖4 CD36蛋白棕櫚?；稽c(diǎn)突變對(duì)HepG2細(xì)胞中LKB1/AMPK通路的影響

討 論

自噬與NAFLD 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，自噬不僅影響肝細(xì)胞中脂質(zhì)的降解，還參與肝細(xì)胞損傷和肝臟炎癥的發(fā)生和發(fā)展［3］。本研究構(gòu)建了WT-CD36-HepG2 和 AA-SS-HepG2 細(xì)胞，LC3 雙熒光腺病毒結(jié)果顯示，與WT-CD36 組相比，AA-SS 組自噬小體增加，且自噬-溶酶體也增加，表明CD36 棕櫚?；稽c(diǎn)缺失會(huì)增強(qiáng)HepG2細(xì)胞的自噬-溶酶體流。

TFEB屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子家族，TFEB 的核轉(zhuǎn)位是啟動(dòng)溶酶體生物發(fā)生和調(diào)控自噬-溶酶體流的關(guān)鍵因素［7］。TFEB 的核轉(zhuǎn)位受到磷酸化修飾的嚴(yán)密調(diào)控。當(dāng)TFEB 發(fā)生去磷酸化時(shí)，其進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與核內(nèi)自噬相關(guān)基因結(jié)合，啟動(dòng)自噬；而磷酸化的TFEB 則滯留在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，不能與核內(nèi)自噬相關(guān)基因結(jié)合，從而使自噬處于較低水平［7］。生物能量代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵分子AMPK 可以通過抑制哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR），抑制 TFEB 的磷酸化，增加TFEB 核轉(zhuǎn)位［8］。本研究結(jié)果顯示，AA-SS 組 AMPK的磷酸化水平比WT-CD36 組明顯增加，TFEB 在細(xì)胞核的定位也顯著增加，表明了CD36棕櫚?；稽c(diǎn)突變可能通過激活A(yù)MPK 通路，促進(jìn)TFEB 的核轉(zhuǎn)位。

Figure 5.Effect of CD36 palmitoylation site mutation on formation of CD36/Fyn complex in HepG2 cells.Mean±SEM. n=3.**P＜0.01 vs WT-CD36 group.圖5 CD36 棕櫚?；稽c(diǎn)突變對(duì)HepG2 細(xì)胞中CD36/Fyn蛋白共聚體形成的影響

研究表明，CD36 能與 Fyn 形成共聚體［6］，促進(jìn)LKB1 的磷酸化，促使LKB1 進(jìn)入細(xì)胞核，抑制AMPK磷酸化［9-10］。在本研究中，我們探討了CD36 棕櫚?；稽c(diǎn)突變激活A(yù)MPK 的可能機(jī)制。與WT-CD36-HepG2 細(xì)胞相比，AA-SS-HepG2 細(xì)胞 CD36/Fyn 蛋白共聚體顯著減少，p-LKB1/LKB1 的明顯降低，表明CD36 棕櫚?；稽c(diǎn)突變可能通過抑制LKB1 的磷酸化促進(jìn)AMPK的活化。

綜上所述，CD36的棕櫚?；稽c(diǎn)突變可通過減少CD36/Fyn 蛋白共聚體的產(chǎn)生，抑制LKB1 的磷酸化，從而激活A(yù)MPK，促進(jìn)TFEB 核轉(zhuǎn)位，最終引起HepG2細(xì)胞自噬增加。