微小RNA及其介導(dǎo)的競爭性內(nèi)源RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在意大利蜜蜂工蜂中腸發(fā)育過程中的潛在作用

杜宇，范小雪，蔣海賓，王杰，范元嬋，祝智威，周丁丁，萬潔琦，盧家軒，熊翠玲，鄭燕珍，陳大福，郭睿

（福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院（蜂學(xué)學(xué)院），福州 350002）

0 引言

【研究意義】意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica，簡稱意蜂）是具有重要生態(tài)、經(jīng)濟和科研價值的社會性昆蟲，廣泛應(yīng)用于我國和其他養(yǎng)蜂國家的養(yǎng)蜂生產(chǎn)[1]。成年蜜蜂的腸道分為前腸、中腸和后腸，其中中腸是食物消化、營養(yǎng)吸收以及免疫防御的主要部位，其內(nèi)壁富含幾丁質(zhì)的圍食膜具有分子篩功能，可保護中腸抵御病原侵染以及促進營養(yǎng)成分吸收[2-3]。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類高度保守的長度約為18—25 nt的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）[4]，主要通過特異性結(jié)合靶mRNA的3′ UTR，導(dǎo)致靶mRNA的翻譯抑制或降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平行使基因表達(dá)調(diào)控功能[5]。較多的研究結(jié)果表明miRNA廣泛參與昆蟲生長發(fā)育和免疫防御等生物學(xué)過程[6-7]。目前，蜜蜂腸道發(fā)育的分子機理尚不明確，ncRNA在蜜蜂腸道發(fā)育過程中的作用研究還很有限。對意蜂工蜂中腸發(fā)育過程的miRNA差異表達(dá)譜、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其差異表達(dá)miRNA（differentially expressed miRNA，DEmiRNA）的潛在作用進行全面分析和探討，可在miRNA組學(xué)層面進一步揭示意蜂工蜂中腸發(fā)育的分子機理。【前人研究進展】1993年，LEE等[8]首次報道lin-4在秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）體內(nèi)具有調(diào)節(jié)生長發(fā)育的作用。近十年來，隨著高通量測序技術(shù)的飛速發(fā)展，越來越多的miRNA在動物、植物和微生物中被鑒定出來[9-11]。但相比于果蠅（Drosophila melanogaster）[12]等模式生物，蜜蜂的miRNA研究相對滯后，涉及miRNA參與調(diào)控蜜蜂腸道發(fā)育的研究尤為缺乏。LIU等[13]研究發(fā)現(xiàn)與神經(jīng)發(fā)育相關(guān)的miR-31a、ame-miR-210和ame-miR-278等9個miRNA在意蜂哺育蜂與采集蜂頭部的差異表達(dá)，并推測它們可能影響蜜蜂的勞動分工過程；SHI等[14]研究發(fā)現(xiàn)ame-let-7、ame-miR-13b和ame-miR-279在意蜂工蜂腦部的表達(dá)具有顯著的時空特異性，且長度為22 nt的miRNA在蜂王與工蜂體內(nèi)的表達(dá)量存在顯著差異，作者推測這些miRNA參與調(diào)控與蜜蜂級型分化相關(guān)的信號通路；LOUREN?O等[15]研究發(fā)現(xiàn)，意蜂工蜂被革蘭氏陽性菌藤黃微球菌（Micrococcus luteus）和革蘭氏陰性菌粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）感染后miR-137等38個miRNA差異表達(dá)，并與Toll、Imd、JNK和Jak-STAT通路相關(guān)的25個mRNA之間存在潛在的調(diào)控關(guān)系，影響抗菌肽合成和黑化作用激活等免疫防御過程。2011年，SALMENA等[16]首次提出競爭性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）假說，認(rèn)為含有miRNA應(yīng)答元件（miRNA response element，MRE）的RNA，如長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）、環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）和假基因轉(zhuǎn)錄本等，可作為ceRNA競爭性結(jié)合miRNA，從而間接影響mRNA的表達(dá)。此后，該假說已被越來越多的研究結(jié)果[17-18]所證實，WANG等[18]研究發(fā)現(xiàn)自噬細(xì)胞自噬促進因子lncRNA-APF可直接結(jié)合miR-188-3p抑制其活性，從而間接調(diào)節(jié)ATG7的表達(dá)以調(diào)控自噬程序和自噬細(xì)胞死亡。前期研究中，筆者所在課題組運用二代測序技術(shù)及生物信息學(xué)方法系統(tǒng)解析了意蜂幼蟲腸道發(fā)育過程的DEmiRNA表達(dá)譜及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[19]，揭示了miR-342-y、ame-miR-6052、miR-iab-4-x、miR-281-x、novel-m0031-3p等DEmiRNA可能在幼蟲腸道發(fā)育中發(fā)揮重要的調(diào)控作用；此外，還相繼解析了意蜂工蜂中腸發(fā)育過程的差異表達(dá)lncRNA（differentially expressed lncRNA，DElncRNA）表達(dá)譜、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及潛在作用[20]，差異表達(dá)circRNA（differentially expressed circRNA，DEcircRNA）表達(dá)譜、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及潛在功能[21]，DEmRNA表達(dá)譜及ceRNA網(wǎng)絡(luò)[22]，在組學(xué)層面深入細(xì)致探討了mRNA和ncRNA介導(dǎo)的中腸發(fā)育機理，并篩選出若干功能研究的候選分子?！颈狙芯壳腥朦c】根據(jù)ceRNA機制，miRNA作為聯(lián)系mRNA與lncRNA和circRNA等ncRNA的橋梁，在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中具有核心地位。筆者所在課題組前期已在mRNA組學(xué)、lncRNA組學(xué)和circRNA組學(xué)層面對意蜂工蜂中腸發(fā)育機理進行了探究，本研究在此基礎(chǔ)上進一步對中腸發(fā)育過程miRNA差異表達(dá)譜、DEmiRNA介導(dǎo)的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以及DEmiRNA的潛在功能進行深入分析，從而將mRNA和ncRNA聯(lián)系起來，展示意蜂工蜂中腸發(fā)育過程的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)全貌。【擬解決的關(guān)鍵問題】利用small RNA-seq（sRNA-seq）技術(shù)、生物信息學(xué)方法和分子生物學(xué)手段對意蜂工蜂中腸發(fā)育過程DEmiRNA介導(dǎo)的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及潛在作用進行分析和驗證，進而與前期在DEmRNA、DElncRNA和DEcircRNA組學(xué)層面的研究結(jié)果進行比較分析和探討，以期在組學(xué)水平揭示DEmiRNA及復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)介導(dǎo)的中腸發(fā)育機理，為在分子水平闡明意蜂工蜂中腸的發(fā)育機理打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗于2017年9月至2019年10月在福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院（蜂學(xué)學(xué)院）蜜蜂保護實驗室完成。

1.1 供試生物材料

供試意蜂工蜂取自福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院（蜂學(xué)學(xué)院）教學(xué)蜂場。

1.2 中腸樣品制備與Illumina測序

按照筆者實驗室前期已建立的方法[20-22]進行意蜂的人工飼養(yǎng)。（1）從群勢較強且顯微鏡檢無東方蜜蜂微孢子蟲的3個蜂群中提取老熟封蓋子脾至實驗室恒溫培養(yǎng)箱（34±0.5）℃；（2）每30 min將剛出房的工蜂（記為0 d）放入四周打孔且已消毒的干凈塑料盒（35只/盒），每個塑料盒上方插入一支裝有50%（w/v）無菌糖水的飼喂器；每日檢查工蜂存活情況，及時清理死亡工蜂；（3）待工蜂出房7 d和10 d時，在超凈臺用干凈鑷子拉取工蜂中腸，放入滅菌后的RNA-Free的EP管，經(jīng)液氮速凍后迅速轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?，每只中腸的取樣時間嚴(yán)格控制在15 s以內(nèi)。進行3次生物學(xué)重復(fù)，每個生物學(xué)重復(fù)包含3只中腸樣品。7 d工蜂中腸樣品（Am7）的3個生物學(xué)重復(fù)：Am7-1、Am7-2和Am7-3；10 d工蜂中腸樣品（Am10）的3個生物學(xué)重復(fù)：Am10-1、Am10-2和Am10-3。文庫構(gòu)建方法如下：用Trizol法從上述樣本中提取total RNA，瓊脂糖凝膠電泳切膠選擇18—30 nt的片段。然后連接3′接頭，連接產(chǎn)物以15%變性PAGE膠電泳分離，切膠選擇36—44 nt目的條帶。回收切膠產(chǎn)物，連接5′接頭，然后對連接了兩側(cè)接頭的小RNA樣本進行反轉(zhuǎn)錄PCR。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物以3.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠選擇140—160 bp區(qū)域條帶，膠回收產(chǎn)物即為終文庫。建好的文庫委托廣州基迪奧生物技術(shù)有限公司進行測序，測序平臺為Illumina MiSeq。測序數(shù)據(jù)已上傳NCBI SRA數(shù)據(jù)庫，BioProject號：PRJNA408312。

1.3 測序數(shù)據(jù)質(zhì)控、參考基因組比對及miRNA的差異表達(dá)分析

對于下機的原始讀段（raw reads），按照前期已建立的方法[19,23]步驟進行質(zhì)量控制：（1）過濾掉質(zhì)量值＜20的堿基數(shù)超過1個的reads；（2）過濾除掉含有未知堿基（N）的reads；（3）過濾3′或5′接頭的reads，并去除長度＜18 bp的reads；（4）過濾包含poly A的reads。過濾得到的clean reads用于后續(xù)分析。

利用Bowit軟件將非注釋序列標(biāo)簽（tags）與西方蜜蜂基因組（assembly Amel 4.5）比對，得到相關(guān)tags對應(yīng)的位置信息，即mapped tags。使用miRDeep2軟件將mapped tags與miRBase數(shù)據(jù)庫中已知的miRNA前體序列進行比對，鑒定已知miRNA的表達(dá)。利用每百萬標(biāo)簽序列（tags per million，TPM）算法公式（TPM=T×106/N，T表示miRNA的tags，N表示總miRNA的tags）對表達(dá)量進行歸一化處理。使用R軟件計算意蜂工蜂中腸樣品不同生物學(xué)重復(fù)之間的Pearson相關(guān)性系數(shù)。顯著性DEmiRNA的篩選標(biāo)準(zhǔn)為|log2fold change|≥1且P≤0.05。

1.4 DEmiRNA的靶mRNA預(yù)測及分析

通過TargetFinder軟件對DEmiRNA進行靶向預(yù)測。利用Blast軟件將上述靶mRNA序列分別映射GO（Gene Ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數(shù)據(jù)庫。結(jié)合本課題組前期研究結(jié)果[20-22]，得到DEmiRNA與DEmRNA、DElncRNA和DEcircRNA的靶向結(jié)合關(guān)系，并根據(jù)DEmiRNA與DEmRNA的靶向結(jié)合關(guān)系篩選自由能≤-20 kcal·mol-1的靶mRNA，進行KEGG數(shù)據(jù)庫注釋，再通過比對前期在差異基因方面的研究結(jié)果[22]找到相同的代謝通路，利用Cytoscape軟件對DEmiRNA靶向的DElncRNA、DEcircRNA以及通路中的DEmRNA進行調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及可視化。

1.5 DEmiRNA的莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄實時熒光定量PCR（Stemloop RT-qPCR）驗證

參考前期已建立的方法[19,23-24]，通過Stem-loop RT-qPCR檢測4個隨機挑選的DEmiRNA（miR-210-z、miR-342-y、miR-7975-y和miR-155-x）在Am7和Am10中的表達(dá)情況，以驗證數(shù)據(jù)的可靠性。通過DNAMAN軟件設(shè)計特異性引物和通用反向引物，委托上海生工生物工程有限公司合成引物，引物信息詳見表1。以snRNA U6作為內(nèi)參，使用M5 microRNA抽提試劑盒（Mei5bio公司，中國）分別提取Am7和Am10的miRNA作為模板，利用Stem-loop引物進行反轉(zhuǎn)錄得到相應(yīng)的cDNA后，以cDNA作為模板進行qPCR。qPCR反應(yīng)按照SYBR Green Dye試劑盒（Vazyme公司，中國）操作說明書進行。反應(yīng)體系20 μL包含SYBR Green Dye 10 μL，cDNA模板1.3 μL，正、反向引物各1 μL，DEPC水6.7 μL。qRT-PCR反應(yīng)在ABI QuantStudio 3熒光定量PCR儀（ABI，美國）上進行，程序設(shè)置為95℃預(yù)變性5 min；95℃變性10 s，60℃退火延伸30 s，共40個循環(huán)。每個反應(yīng)進行3次生物學(xué)重復(fù)和技術(shù)重復(fù)。利用2-ΔΔCt法計算miRNA相對表達(dá)量。利用Graph Prism 7軟件處理數(shù)據(jù)和繪圖，通過t檢驗計算組間顯著性。

2 結(jié)果

2.1 意蜂工蜂中腸測序數(shù)據(jù)的質(zhì)控與評估

Am7和Am10的sRNA-seq分別得到13 511 614條和13 448 175條raw reads，嚴(yán)格過濾后分別得到13 119 002條和13 010 751條clean reads，占raw reads的比例均≥96.13%（表2）。此外，Am7和Am10的組內(nèi)各生物學(xué)重復(fù)之間的Pearson相關(guān)性系數(shù)均達(dá)到0.9870和0.9988以上（圖1）。上述結(jié)果說明本研究中樣本重復(fù)性和數(shù)據(jù)質(zhì)量較好，可用于進一步分析。

表1 RT-qPCR引物信息Table 1 Information of primers for RT-qPCR

表2 sRNA-seq數(shù)據(jù)總覽Table 2 Overview of sRNA-seq datasets

2.2 意蜂工蜂中腸發(fā)育過程的miRNA差異表達(dá)譜

差異表達(dá)分析結(jié)果顯示，Am7 vs Am10比較組共含有112個顯著性DEmiRNA，包括38個顯著上調(diào)miRNA和74個顯著下調(diào)miRNA。其中，上調(diào)倍數(shù)最高的是miR-7132-y，其次是miR-2188-x和miR-1388-x（表3）；而下調(diào)倍數(shù)最高的是miR-8503-x，其次是miR-298-x和miR-291-y（表4）。

2.3 意蜂工蜂中腸發(fā)育過程中DEmiRNA的靶mRNA預(yù)測及分析

利用TargetFinder軟件對上述顯著上調(diào)和顯著下調(diào)miRNA進行靶向預(yù)測，分別預(yù)測出7 434和9 559個靶mRNA，并分別涉及47和51個功能條目。其中注釋靶mRNA數(shù)前15位的條目均為結(jié)合（2 082和2 632）、細(xì)胞進程（2 074和2 526）、代謝進程（1 767和2 270）、單組織進程（1 588和1 957）、催化活性（1 288和1 720）、細(xì)胞（916和1 130）、細(xì)胞組件（916和1130）、細(xì)胞膜（913和1 098）、細(xì)胞膜組件（893和1 076）、細(xì)胞器（681和863）、生物學(xué)調(diào)控（655和775）、生物進程調(diào)控（601和729）、定位（565和713）、應(yīng)激反應(yīng)（556和679）、信號（494和615）（圖2）。括號內(nèi)數(shù)字代表注釋在該條目的顯著上調(diào)（下調(diào)）miRNA的靶mRNA數(shù)。

表3 意蜂工蜂中腸發(fā)育過程中顯著上調(diào)前10個miRNATable 3 Top 10 significantly up-regulated miRNAs during the developmental process of A.m.ligustica worker’s midgut

圖1 各意蜂工蜂中腸樣品不同生物學(xué)重復(fù)間的Pearson相關(guān)性系數(shù)Fig.1 Pearson correlation coefficients among different biological replicas within each A.m.ligustica worker’s midgut sample group

圖2 意蜂工蜂中腸發(fā)育過程DEmiRNA的GO數(shù)據(jù)庫注釋Fig.2 GO database annotation of DEmiRNA target mRNAs involved in the developmental process of A.m.ligustica worker’s midgut

表4 意蜂工蜂中腸發(fā)育過程中顯著下調(diào)前10個miRNATable 4 Top 10 significantly down-regulated miRNAs during the developmental process of A.m.ligustica worker’s midgut

進一步對上述DEmiRNA的靶mRNA進行KEGG數(shù)據(jù)庫注釋，結(jié)果顯示顯著上調(diào)miRNA的靶mRNA可注釋到315條通路，顯著下調(diào)miRNA的靶mRNA可注釋到324條通路。對于顯著上調(diào)miRNA和顯著下調(diào)miRNA，分別有118和134個靶mRNA注釋到Hippo信號通路，155和190個靶mRNA注釋到Wnt信號通路，58和63個靶mRNA注釋到FoxO信號通路，30和41個靶mRNA注釋到Notch通路；分別有98和109個靶mRNA注釋到內(nèi)吞作用，74和70個靶mRNA注釋到泛素介導(dǎo)的蛋白水解，37和32個靶mRNA注釋到溶酶體，111和117個靶mRNA注釋到黑色素生成等細(xì)胞免疫通路；分別有17和22個靶mRNA注釋到Jak-STAT信號通路，8和10個靶mRNA注釋到NF-κB信號通路，8和18個靶mRNA注釋到Toll/Imd信號通路，25和53個靶mRNA注釋到MAPK信號通路等體液免疫通路。表5和表6分別展示了顯著上調(diào)miRNA和顯著下調(diào)miRNA顯著富集的前15位通路。

2.4 意蜂工蜂中腸發(fā)育過程中DEmiRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及分析

前期研究中，為深入分析意蜂工蜂中腸的發(fā)育機理，筆者所在課題組選取13條信號通路（AMPK、PI3K-Akt、Wnt、cAMP、FoxO、Hippo、mTOR、Jak-STAT、Toll-like受體、TGF-beta、Notch、MAPK和NF-κB）及各通路富集DEmRNA構(gòu)建富集關(guān)系網(wǎng)絡(luò)[22]。在此基礎(chǔ)上，根據(jù)序列匹配原則，利用軟件預(yù)測DEmiRNA與前期研究中DElncRNA[20]、DEcircRNA[21]、DEmRNA[22]的靶向結(jié)合關(guān)系，構(gòu)建9條通路相關(guān)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，分析結(jié)果顯示DEmiRNA與DEmRNA、DEcircRNA和DElncRNA之間存在復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系，DEmiRNA居于網(wǎng)絡(luò)的中心位置，而DElncRNA、DEcircRNA和DEmRNA處于網(wǎng)絡(luò)外周；此外miR-5106-y能夠靶向結(jié)合3個DElncRNA和2個DEcircRNA（圖3）。

表5 意蜂工蜂中腸上調(diào)miRNA的靶mRNA顯著富集的前15位通路Table 5 Top 15 pathways significantly enriched by target mRNAs of significantly up-regulated miRNAs in the midgut of A.m.ligustica worker

表6 意大利蜜蜂工蜂中腸下調(diào)miRNA的靶mRNA顯著富集的前15位通路Table 6 Top 15 pathways significantly enriched by target mRNAs of significantly down-regulated miRNAs in the midgut of A.m.ligustica worker

進一步分析發(fā)現(xiàn)，一個DEmiRNA靶向的DEmRNA可注釋到多條信號通路，例如miR-291-y靶向的糖原合成酶激酶-3β亞型編碼基因（XM_006567354.2）可注釋到Wnt、PI3K-Akt和mTOR信號通路，miR-376-y靶向的環(huán)盒子亞型編碼基因（XM_016910739.1）可注釋到Wnt和TGF-beta信號通路，miR-148-y靶向的非特性蛋白LOC411962編碼基因（XM_006567604.2）可注釋到MAPK和Toll/Imd信號通路，miR-5106-y靶向的絲氨酸/蘇氨酸-蛋白磷酸酶-β亞基-ε編碼基因（XM_016912389.1）可注釋到PI3K-Akt和AMPK信號通路。此外，同一個DEmiRNA靶向的多個DEmRNA富集在同一條信號通路，例如ame-miR-6001-3p靶向的3個DEmRNA（XM_006562526.2、XM_016914568.1和XM_016914811.1）可注釋到Hippo信號通路；miR-126-x靶向的2個DEmRNA（XM_006557903.2和XM_006557904.2）均注釋到cAMP信號通路（圖3）。

miR-342-y在意蜂工蜂中腸發(fā)育過程中呈顯著性上調(diào)表達(dá)，與其在意蜂幼蟲腸道發(fā)育過程的表達(dá)趨勢[19]相反。進一步對miR-342-y及與其存在靶向結(jié)合關(guān)系的DElncRNA、DEcircRNA和DEmRNA進行預(yù)測和分析，結(jié)果顯示miR-342-y可靶向結(jié)合3個DEcircRNA、4個DElncRNA和327個靶mRNA，上述靶mRNA可注釋到松弛素信號通路（15）、趨化因子信號通路（13）、HIF-1信號通路（12）、神經(jīng)活性配體-受體相互作用（10）、內(nèi)吞作用（10）、碳水化合物的消化吸收（8）、雌激素信號通路（8）、腹背軸形成（8）和TRP通道的炎性介質(zhì)調(diào)節(jié)（8）等162條通路（圖4）。

2.5 意蜂工蜂中腸發(fā)育過程中DEmiRNA的Stem-loop RT-qPCR驗證

利 用Stem-loop RT-qPCR對miR-210-z、miR-342-y、miR-7975-y和miR-155-x進行表達(dá)量檢測，結(jié)果顯示它們的差異變化趨勢與轉(zhuǎn)錄組測序中相應(yīng)的表達(dá)量變化趨勢一致（圖5），證明了本研究中miRNA差異表達(dá)及測序數(shù)據(jù)的真實可靠性。

3 討論

圖3 意蜂工蜂中腸發(fā)育過程中9條信號通路相關(guān)的DElncRNA/DEcircRNA-DEmiRNA-DEmRNA關(guān)系網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Relationship network of DElncRNA/DEcircRNA-DEmiRNA-DEmRNA associated with 9 signaling pathways in the midgut of A.m.ligustica worker

圖4 意蜂工蜂中腸的miR-342-y靶向結(jié)合的10條信號通路相關(guān)DElncRNA、DEcircRNA、DEmRNA關(guān)系網(wǎng)絡(luò)Fig.4 Relationship network of miR-342-y and its target DElncRNAs, target DEcircRNAs, target DEmRNAs associated with 10 signaling pathways in the midgut of A.m.ligustica worker

圖5 DEmiRNA的RT-qPCR驗證Fig.5 RT-qPCR validation of DEmiRNAs

昆蟲腸道不僅是消化食物和吸收營養(yǎng)的主要場所，也是阻擋病原入侵血淋巴及其他器官的重要防線[25]。目前，有關(guān)成年蜜蜂腸道的研究主要集中在腸道微生物的結(jié)構(gòu)特征和功能預(yù)測方面[26-27]，腸道發(fā)育機理的相關(guān)研究極其有限。以Illumina為代表的二代測序技術(shù)近年來發(fā)展迅速，在miRNA等ncRNA的高通量挖掘方面表現(xiàn)出突出的優(yōu)越性[28-30]。前期研究中，筆者所在課題組對意蜂工蜂響應(yīng)微孢子蟲脅迫的應(yīng)答機制進行了lncRNA、miRNA和mRNA層面的全面解析[28,30-31]；并在lncRNA、circRNA和mRNA組學(xué)層面探究了意蜂工蜂中腸的發(fā)育機理，系統(tǒng)解析了DElncRNA、DEcircRNA和DEmRNA表達(dá)譜及三者涉及的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[20-22]。miRNA作為基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵因子，能夠作為橋梁將編碼RNA與非編碼RNA聯(lián)系起來。為進一步深入探究意蜂工蜂中腸發(fā)育的分子機理，本研究結(jié)合測序得到的意蜂工蜂中腸sRNA組學(xué)數(shù)據(jù)和前期獲得的中腸circRNA、lncRNA和mRNA組學(xué)數(shù)據(jù)，對miRNA的差異表達(dá)譜及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進行了深入分析和探討。蜜蜂是一種完全變態(tài)昆蟲，歷經(jīng)卵期、幼蟲期、蛹期和成蟲期4個階段，其中，1—2日齡幼蟲太小，直接剖取腸道技術(shù)上無法滿足。前期研究中，筆者所在課題組從自然蜂群中移取2日齡意蜂幼蟲至48孔培養(yǎng)板，經(jīng)24 h的環(huán)境適應(yīng)后，于3日齡時處理組幼蟲飼喂接種球囊菌孢子，對照組幼蟲飼喂不含球囊菌孢子的飼料，然后于4、5和6日齡分別剖取處理組和對照組幼蟲腸道用于sRNA-seq；基于高質(zhì)量的sRNA組學(xué)數(shù)據(jù)全基因組鑒定和分析了意蜂幼蟲腸道m(xù)iRNA及其結(jié)構(gòu)特征[9]，并解析了意蜂幼蟲腸道發(fā)育過程的miRNA差異表達(dá)譜、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及潛在功能[19]。蜜蜂預(yù)蛹期，內(nèi)部的組織經(jīng)歷分解和重構(gòu)，逐漸形成新的組織，此階段無法獲取完整腸道。本研究僅選取意蜂7日齡和10日齡工蜂中腸進行sRNA-seq，因為這兩個時間點均處于意蜂成蟲期，且本研究的分析和討論未涉及變態(tài)發(fā)育。

從Am7 vs Am10比較組中篩選出38個顯著上調(diào)miRNA和74個顯著下調(diào)miRNA，可分別靶向7 434和9 559個mRNA，通過與circRNA、lncRNA和mRNA的相互作用參與調(diào)節(jié)意蜂中腸發(fā)育過程中的各類生命活動。

3.1 DEmiRNA參與調(diào)控意蜂中腸發(fā)育過程的新陳代謝、信號傳導(dǎo)和免疫應(yīng)答

蜜蜂腸道在消化和吸收等正常生命活動中伴隨著活躍的物質(zhì)和能量代謝。本研究發(fā)現(xiàn)，顯著上調(diào)和下調(diào)miRNA靶向結(jié)合的mRNA均可注釋到嘌呤代謝（81和104個靶mRNA）、甘油磷脂代謝（49和52個靶mRNA）、醚脂質(zhì)代謝（13和22個靶mRNA）等脂代謝相關(guān)通路；果糖和甘露糖代謝（23和23個靶mRNA）、磷酸肌醇代謝（43和64個靶mRNA）等碳水化合物代謝相關(guān)通路；賴氨酸降解（13和21個靶mRNA）、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝（11和17個靶mRNA）等氨基酸代謝相關(guān)通路。此外，顯著上調(diào)和下調(diào)miRNA靶向結(jié)合的mRNA還能注釋到氮代謝（2和6個靶mRNA）和氧化磷酸化（22和25個靶mRNA）等多條能量代謝相關(guān)通路。上述結(jié)果表明意蜂工蜂中腸發(fā)育過程中可通過DEmiRNA調(diào)節(jié)部分物質(zhì)代謝和能量代謝通路及相關(guān)基因的表達(dá)，以滿足中腸生長和發(fā)育的物質(zhì)和能量需求。

昆蟲腸道在生長發(fā)育過程中受到Hippo、Wnt、FoxO和Notch等信號通路的共同調(diào)節(jié)[32]。中腸干細(xì)胞能夠分化為具有吸收功能的腸上皮細(xì)胞以及分泌功能的腸內(nèi)分泌細(xì)胞，保證腸組織的自我更新和損傷修復(fù)，從而維持正常的形狀和功能，而Notch、Hippo和Wnt信號通路在中腸干細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)平衡、更新分化過程中發(fā)揮重要作用[33-34]。Notch信號通路在果蠅胚胎期中腸發(fā)育過程中調(diào)節(jié)成體中腸祖細(xì)胞[35]，在成年期調(diào)控中腸干細(xì)胞以維持中腸內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[36-37]。Wnt信號通路通過控制果蠅成年個體腸道的腔室內(nèi)干細(xì)胞增殖以及調(diào)控腔室邊界細(xì)胞正常發(fā)展，從而在內(nèi)環(huán)境平衡和發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[38]。上皮細(xì)胞Hippo信號的缺失會增加Upd家族細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并且刺激EGFR配體，進而激活Jak-STAT和EGFR信號通路并促進果蠅中腸干細(xì)胞的增殖[39]。昆蟲蛻皮是生長發(fā)育的重要生理過程，而FoxO信號通路中的FoxO通過調(diào)控CPA的表達(dá)參與調(diào)控昆蟲的蛻皮行為[40]。本研究中，對于顯著上調(diào)和顯著下調(diào)miRNA，分別有118和134個靶mRNA注釋到Hippo信號通路，155和190個靶mRNA注釋到Wnt信號通路，58和63個靶mRNA注釋到FoxO信號通路，30和41個靶mRNA注釋到Notch通路。相應(yīng)的DEmiRNA通過上調(diào)或下調(diào)部分基因的表達(dá)水平對上述發(fā)育相關(guān)信號通路進行調(diào)控，從而影響意蜂工蜂中腸的生長和發(fā)育以及細(xì)胞分化。

昆蟲中腸作為與外源病原體互作的重要場所，可通過分泌活性氧、抗菌肽以及各類蛋白酶協(xié)助宿主抵御病原侵染[25]。蜜蜂在與病原長期協(xié)同進化過程中，形成了以內(nèi)吞作用、吞噬作用、黑化作用和蛋白酶促水解為代表的細(xì)胞免疫，以及Jak-STAT、NF-κB、Imd/Toll、MAPK和JNK等信號通路和抗菌肽釋放為代表的體液免疫[41]。前人研究發(fā)現(xiàn)Jak-STAT信號通路作為昆蟲先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在病原侵染的過程中可被顯著激活并廣泛參與細(xì)胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)等過程[42]。Toll/Imd信號通路和NF-κB信號通路共同介導(dǎo)了抗菌肽的合成與釋放過程，并協(xié)同吞噬和包埋作用參與昆蟲的應(yīng)激免疫反應(yīng)[43-44]。JNK途徑在內(nèi)的MAPK級聯(lián)反應(yīng)的激活，能夠促進昆蟲免疫的調(diào)節(jié)過程[45-46]。本研究發(fā)現(xiàn)，對于顯著上調(diào)和下調(diào)的miRNA，分別有98和109個靶mRNA注釋到內(nèi)吞作用，74和70個靶mRNA注釋到泛素蛋白水解，37和32個靶mRNA注釋到溶酶體，111和117個靶mRNA注釋到黑色素生成等細(xì)胞免疫通路；此外，分別有17和22個靶mRNA注釋到Jak-STAT信號通路，8和10個靶mRNA注釋到NF-κB信號通路，8和18個靶mRNA注釋到Toll/Imd信號通路，25和53個靶mRNA注釋到MAPK信號通路等體液免疫通路。上述結(jié)果共同表明，意蜂中腸發(fā)育過程中的DEmiRNA具有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)激反應(yīng)的潛在作用。

3.2 DEmiRNA參與意蜂工蜂中腸發(fā)育過程的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

LncRNA和circRNA可作為ceRNA，通過MRE競爭性結(jié)合miRNA，以減輕miRNA對靶mRNA的抑制或降解作用，間接調(diào)控各類生物學(xué)過程[17-18]。筆者所在課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，意蜂工蜂中腸的發(fā)育過程中，DEcircRNA和DElncRNA可分別結(jié)合多個miRNA，如lncRNA XR_001702484.1可靶向ame-miR-6001-3p、miR-376-y和miR-182-x等10個DEmiRNA[20]；circRNA novel_circ_010719可靶向ame-miR-6001-3p、miR-148-y和miR-291-y等43個DEmiRNA[21]。經(jīng)比較分析發(fā)現(xiàn)，本研究有112個DEmiRNA能夠被201個DEcircRNA、112個DElncRNA和283個DEmRNA競爭性結(jié)合，其中靶向16個DEmRNA的miR-126-x（log2fold change=1.96,P=4.54E-04）可被11個DEcircRNA和9個DElncRNA競爭性結(jié)合。上述結(jié)果表明，miRNA作為ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的核心因子，通過介導(dǎo)circRNA和lncRNA對基因表達(dá)的調(diào)控，在意蜂工蜂中腸發(fā)育過程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。

一個mRNA可被多個miRNA靶向結(jié)合，并參與對多條信號通路的調(diào)控作用。前期研究發(fā)現(xiàn)，意蜂工蜂中腸發(fā)育過程中的57個DEmRNA涉及cAMP、AMPK、Hippo、Toll-like受體、MAPK、mTOR、Wnt、PI3K-Akt、FoxO、Jak-STAT、TGF-beta、Notch和NF-κB 13條發(fā)育和免疫相關(guān)信號通路[22]。結(jié)合前期研究結(jié)果進行比較分析，本研究發(fā)現(xiàn)miR-291-y、miR-376-y、miR-148-y、miR-5106-y、ame-miR-6001-3p、miR-182-x、miR-126-x、miR-3223-x 8個DEmiRNA靶向結(jié)合的12個DEmRNA主要富集在cAMP、AMPK、Hippo、Toll/Imd、TGF-beta、MAPK、mTOR、Wnt和PI3K-Akt 9條信號通路（圖3）。XM_016912389.1編碼的絲氨酸/蘇氨酸-蛋白磷酸酶-β亞基-ε在細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化、凋亡及代謝等多種細(xì)胞事件中發(fā)揮重要調(diào)控作用[47]。本研究中，miR-5106-y的靶mRNA XM_016912389.1富集在PI3K-Akt和AMPK信號通路，說明miR-5106-y在意蜂工蜂中腸發(fā)育過程涉及這兩條信號通路的調(diào)控。此外，分析結(jié)果顯示同一DEmiRNA的靶向結(jié)合的多個mRNA富集在同一條信號通路，例如ame-miR-6001-3p靶向結(jié)合的4個DEmRNA中有3個富集在Hippo信號通路。前期研究發(fā)現(xiàn)多達(dá)29個DElncRNA[20]和14個DEcircRNA[21]能夠靶向結(jié)合ame-miR-6001-3p，推測ame-miR-6001-3p在意蜂工蜂中腸發(fā)育過程除了能夠直接調(diào)控細(xì)胞的增殖與凋亡、組織生長、器官大小，以及組織穩(wěn)態(tài)維持，還能作為DElncRNA和DEcircRNA參與調(diào)控發(fā)育的媒介分子，值得進一步深入研究。cAMP信號通路在細(xì)胞中發(fā)揮信使的作用，細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度的改變影響多種細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而調(diào)控基因表達(dá)、蛋白活性以及細(xì)胞功能，對細(xì)胞的代謝、生長、分化和凋亡發(fā)生影響[48]。本研究中，miR-126-x靶向結(jié)合的2個DEmRNA都富集在cAMP信號通路，推測可能通過細(xì)胞內(nèi)外信息傳遞調(diào)控細(xì)胞活動。ZHOU等[49]探究了lncRNAmiRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)在舌鱗狀細(xì)胞癌（SCCT）中的作用，與本研究中miR-148-y同家族的hsa-miR-148b-3p和hsa-miR-148a-3p可以靶向結(jié)合lncRNA KCNQ1OT1參與誘導(dǎo)SCCT細(xì)胞生長，推測本研究中的miR-148-y能夠通過ceRNA網(wǎng)絡(luò)在意蜂發(fā)育過程中參與調(diào)節(jié)中腸細(xì)胞的生長和發(fā)育。酪蛋白激酶在圍食膜形成的過程中發(fā)揮作用[50]，本研究中，ame-miR-6001-3p等28個DEmiRNA能夠靶向XM_006569003.2在內(nèi)的25個編碼酪蛋白激酶相關(guān)蛋白的基因，暗示以上DEmiRNA參與調(diào)控圍食膜的形成。幾丁質(zhì)是昆蟲表皮和圍食膜的重要組成成分之一，幾丁質(zhì)代謝隨著昆蟲不同生長發(fā)育階段而變化[51]，本研究發(fā)現(xiàn)ame-miR-6001-3p、miR-142-x、miR-3964-y等10個miRNA能夠靶向結(jié)合XM_396925.6等4個能夠編碼幾丁質(zhì)酶的相關(guān)基因，推測此10個DEmiRNA參與腸道幾丁質(zhì)的形成過程。

昆蟲腸道的發(fā)育過程伴隨著復(fù)雜而廣泛的mRNA與ncRNA的相互作用。前期研究發(fā)現(xiàn)miR-8503-x、miR-342-y、miR-4792-x和miR-5106-y等miRNA在意蜂幼蟲腸道發(fā)育過程中發(fā)生顯著性差異表達(dá)[19]；本研究中，上述4個miRNA在意蜂工蜂中腸發(fā)育過程也呈現(xiàn)出顯著性差異表達(dá)，差異變化倍數(shù)分別達(dá)到-14.08（P=3.09E-04）、-3.18（P=4.11E-06）、-3.31（P=8.04E-03）和-1.82（P=0.038），以上4個miRNA在意蜂的兩種蟲態(tài)均發(fā)生不同幅度的差異表達(dá)，暗示它們與意蜂不同蟲態(tài)的腸道發(fā)育存在潛在關(guān)聯(lián)。此外，還發(fā)現(xiàn)miR-342-y在意蜂幼蟲腸道發(fā)育過程顯著性下調(diào)表達(dá)[19]；本研究中，miR-342-y在意蜂工蜂中腸發(fā)育中顯著性上調(diào)表達(dá)，與其在幼蟲腸道發(fā)育過程表達(dá)趨勢相反，說明該miRNA在意蜂不同蟲態(tài)的腸道發(fā)育過程扮演著不同角色。進一步分析發(fā)現(xiàn)，miR-342-y在ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中可靶向結(jié)合3個circRNA、4個lncRNA和327個mRNA，進一步對上述靶mRNA進行代謝通路注釋，結(jié)果顯示參與對神經(jīng)活性配體-受體相互作用、吞噬作用以及背腹軸形成等162條通路的調(diào)控。推測以miR-342-y為核心的ceRNA網(wǎng)絡(luò)在意蜂不同蟲態(tài)的腸道發(fā)育過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，但在意蜂幼蟲腸道和工蜂中腸相反的表達(dá)趨勢暗示miR-342-y具有多面功能，值得進一步深入研究。

針對本研究篩選出的關(guān)鍵DEmiRNA，下一步將通過人工合成miRNA的類似物和抑制物，對意蜂工蜂和幼蟲進行miRNA的過表達(dá)或敲減，同時檢測對其靶向結(jié)合lncRNA、circRNA和mRNA表達(dá)水平的影響，進而揭示ceRNA介導(dǎo)意蜂工蜂中腸發(fā)育的分子機理。

4 結(jié)論

DEmiRNA可能通過參與調(diào)控的物質(zhì)和能量代謝通路、Hippo和Wnt等信號通路以及細(xì)胞和體液免疫通路相關(guān)基因的表達(dá)影響意蜂中腸的生長和發(fā)育；miR-182-x、miR-291-y、miR-342-y、ame-miR-6001-3p等關(guān)鍵DEmiRNA介導(dǎo)的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能在意蜂中腸發(fā)育過程發(fā)揮重要的調(diào)控作用。