抗犬真菌性皮膚病中藥的篩選

李秀宇，李春花，柴方紅

1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林吉林市 132109；2.吉林省牧業(yè)信息中心，吉林長春 130062

犬皮膚真菌病是寵物門診的常見性、多發(fā)性、人畜共患皮膚病，是由犬小孢子菌、石膏樣小孢子菌及馬拉色菌等致病性真菌黏附于犬皮膚上，侵入皮膚表皮、毛發(fā)或趾甲從而引起皮膚的一系列器質(zhì)性病變，是犬臨床最常見的傳染性皮膚疾病之一[1]。其臨床特征是掉屑、膿包、紅的斑點、掉毛及丘疹等，繼發(fā)感染可能出現(xiàn)瘍、糜爛。犬皮膚真菌病的頑固性強、難治愈、病期長、易反復(fù)，并可通過動物傳染給人，對動物和人類的健康造成嚴重影響。臨床治療更多選擇用抗真菌西藥，而西藥價格更貴，且具有更明顯耐藥性。由于近幾年耐藥菌株增多和皮膚病復(fù)發(fā)率增高，這讓獸醫(yī)研究者更加努力研究新型抗真菌藥物。

中藥是中華幾千年留下的精華資源，對于真菌病的防治，具有天然性、毒副作用小、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)勢，效果不比西藥差，蘊含著巨大的創(chuàng)新潛能。此試驗選取多種中草藥，如黃芩、黃連和苦參具有瀉實火，除濕熱等作用[2]，白鮮皮具有清熱燥濕、祛風(fēng)止癢、解毒功效，主治風(fēng)熱濕毒所致的風(fēng)疹、濕疹、疥癬、濕熱痹[3]。通過對臨床皮膚真菌病患犬分離菌株，并比較不同藥物的殺菌效果，進行了合理組方，并且進一步研究了組方的有效性，希望開發(fā)出一種價格低廉、更高藥效、抗菌譜廣的新型抗真菌藥物，為臨床抗真菌藥物的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物

吉林市昌邑區(qū)某犬舍真菌性皮膚病的患犬。

1.1.2 藥品試劑

射干、金銀花、冰片等中藥購于吉林市昌邑區(qū)百草堂中藥店。

鹽酸特比萘芬、青霉素沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基和葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基等由吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院微生物實驗室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 診斷方法

1.2.1.1 臨床診斷

患犬的患病部位出現(xiàn)圓形脫毛的禿癍、掉屑、瘙癢和結(jié)痂。

1.2.1.2 伍氏燈檢查

需先把燈預(yù)熱5～10 min，再用燈在暗室里照射病患部位的毛、皮屑或皮膚缺損區(qū)，觀察有藍綠色熒光，初步判斷有真菌感染。

1.2.1.3 實驗室診斷

在皮膚的健康與患病交界處采集毛、鱗屑或痂塊放在載玻片上，加1 滴10%氫氧化鉀溶液蓋上蓋玻片，放置30 min 后在顯微鏡下檢查，發(fā)現(xiàn)有大量真菌菌絲。

1.2.2 病料采集與接種培養(yǎng)

1.2.2.1 病料采集

在患犬患病部位消毒、剃毛后，持刀片垂直刮取病料，裝入滅菌青霉素瓶中。

1.2.2.2 接種培養(yǎng)

以沙氏葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基(SDA)為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，進行真菌分離培養(yǎng)[4]。在平皿上記錄編號、部位、日期；每隔1d 觀察1次，按照菌落生長情況（快、慢、菌落特點等）判定是顯微鏡觀察還是停止培養(yǎng)。在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，分離培養(yǎng)3～4 周。

1.2.3 致病真菌鑒定

在SDA 培養(yǎng)期間，每天對真菌生長形態(tài)進行觀察，進行初步鑒定。然后進一步培養(yǎng)可疑真菌，培養(yǎng)基為含有酚紅pH 顯示劑葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基（DTM），為獸醫(yī)學(xué)臨床上最適宜的真菌培養(yǎng)基。在DTM 中連續(xù)培養(yǎng)3～4 周，期間每天進行觀察，且從第3～28 天進行顯微鏡觀察，根據(jù)菌落形態(tài)和顯微結(jié)構(gòu)特點進行真菌鑒定[5]。

通過致病真菌的菌落生長特征和顯微結(jié)構(gòu)的觀察，發(fā)現(xiàn)有4 種致病真菌，并分別命名為菌1，菌2，菌3，菌4。這4 種致病真菌的菌落特征觀察結(jié)果見表1。

表1 SDA 培養(yǎng)基上四種致病真菌的菌落特征

根據(jù)菌落形態(tài)特點和顯微結(jié)構(gòu)的觀察結(jié)果，可以確定菌1 為犬小孢子菌，菌2 為石膏樣小孢子菌，菌3 為絮狀表皮癬菌，菌4 為馬拉色菌。

1.2.4 菌種保存

采用沙氏低糖蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，以大試管制備斜面培養(yǎng)基。在超凈工作臺，用接菌環(huán)將分離的病原真菌傳代至已制備好的斜面上，在適宜的生長環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)。保存在-4 ℃冰箱中，然后用棉塞和紙?zhí)赘灿诰N管口，以防止管內(nèi)潮濕或管內(nèi)水份蒸發(fā)過快。

1.2.5 中藥的篩選

1.2.5.1 中藥提取將射干、金銀花、冰片等每種單味中藥生藥50g 加水200mL，浸泡30 min，文火加熱煮沸1 h。藥汁用紗布過濾后得提取物，濾渣重復(fù)上述步驟2次后合并濾液，棄去濾渣[6]。再將合并的濾液文火加熱濃縮至50mL，得到濃縮液1g/mL。

1.2.5.2 中藥體外抑菌試驗

①菌液制備：按照SDA 培養(yǎng)基制作說明制備，在其中心接種病原真菌，28 ℃活化培養(yǎng)1 周，活化2次，使菌落覆蓋SDA 瓊脂平板[7]。用血細胞計數(shù)板，將菌液濃度調(diào)整為5～6×104個/mL，備用。

②藥基制備：制備SDA 培養(yǎng)基，每個試管加入1.5mL，并分別加1.5mL 各種單味中藥藥液于每個斜面培養(yǎng)基，濃度是1g/mL 的生藥水；設(shè)陽性對照組4 支試管，分別加入濃度為25 mg/mL 的特比萘芬1.5mL，終濃度為12.5 mg/mL；設(shè)陰性對照組4 支試管，分別加入生理鹽水1.5mL[8]。115℃高壓滅菌15 min，放置于斜面并待其冷卻后使用。③接種：吸取已經(jīng)制備好的菌液5 μL，將其接種于藥基的表面，將菌液均勻涂布，放置于恒溫箱中，28 ℃培養(yǎng)2 周，觀察真菌的生長狀況。根據(jù)其生長發(fā)育狀況，用“+”或“-”表示中藥對病原真菌生長抑制作用的“有”或“無”。

1.2.5.3 確定組方

根據(jù)單味中藥抑菌試驗的結(jié)果和中醫(yī)辯證理論，確定三組中藥組方進行試驗，如下。

復(fù)方中藥組一：冰片、白礬、白鮮皮、五倍子、苦參。

復(fù)方中藥組二：荊芥、金銀花、百部、五倍子、防風(fēng)。

復(fù)方中藥組三：皂角、石榴皮、地膚子、白鮮皮、黃連。

1.2.5.4 中藥組方抑菌試驗

①菌液制備：同中藥體外抗真菌試驗菌液的制備。

②藥基制備：參照單味中藥的平板抑菌試驗結(jié)果，按照辨證施治的原理，最終確定3個中藥組方，分別命名為組方1、2、3[9]。各組方中有5 味中藥，藥物配比后稱取50g，提取得到中藥水濃度為1g/mL；針對病原真菌，每個組方作4個濃度梯度，共準備12 支試管，再加上陽性對照1 支，陰性對照1 支，分別編號。每支試管中加2.25mLSDA 培養(yǎng)基，再加藥液0.25mL 于培養(yǎng)基試管內(nèi)，將藥物濃度依次稀釋成100 mg/mL、50 mg/mL、25 mg/mL、12.5 mg/mL。115℃高壓滅菌15 min，放置于斜面并待冷卻后使用。為了避免試驗誤差，需要進行4組重復(fù)試驗。

③接種：吸取5mL 菌液，接種在藥基表面，均勻涂布，置28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)每日觀察試驗結(jié)果[10]。

④結(jié)果觀察：根據(jù)真菌的生長發(fā)育狀況，中藥的抑菌作用表現(xiàn)為“-”、“+”、“++”、“+++”4個水平。4 株真菌分別培養(yǎng)2 周后，觀察判定其終點。

2 體外抑菌試驗結(jié)果

2.1 單味中藥體外抑菌結(jié)果

除17 味中藥外，另設(shè)陽性對照和陰性對照，對馬拉色菌、犬小孢子菌、絮狀表皮癬菌和石膏狀小孢子菌4 種病原真菌分別進行藥敏試驗，結(jié)果如表2 所示。

表2 17味中藥提取物對致病性真菌的抑制作用

2.2 中藥組方體外抑菌結(jié)果

所選3 種中藥組方采用體外抑菌試驗，判斷其對致病性真菌的抑菌活性，同時根據(jù)結(jié)果選出最佳組方，結(jié)果如表3 所示。

試驗結(jié)果表明，3個中藥組方對各致病菌都有抑制作用，由表3 可知組方一對4 種致病性真菌的抑菌效果均高于其他組方。因此根據(jù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，綜合各種因素確定組方一為最佳的中藥組方，即冰片、白礬、白鮮皮、五倍子、苦參所組成的方劑。

表3 中藥組方對致病性真菌的抑制作用

3 分析與討論

本試驗所選17 味中草藥，皆是文獻記載有抑菌作用的藥物，其中一些已多次在皮膚真菌病成方中出現(xiàn)。據(jù)張悅天等人報道，射干、五倍子粗粉在超聲提取的最佳工藝下，其提取物浸膏對4 株真菌的抑菌效果明顯。據(jù)禹澤中、朱云安報道，荊芥、防風(fēng)、白鮮皮等中藥組成的中藥組方對犬真菌性皮膚病的治愈率高于伊維菌素等西藥組。

根據(jù)一定的體外抗真菌方法，篩選出具有明顯抗真菌作用的中藥，盡管不同中藥對真菌抑制作用有特異性，且相同中藥對各種真菌的抑制作用也有不一致。但以篩選抗真菌中藥為前提，還是完成了預(yù)期的目標。

鹽酸特比萘芬屬于外用藥，涂抹在患部后，動物舔食后也許會出現(xiàn)中毒癥狀，如惡心、厭食、輕度腹痛和腹瀉等，或輕度皮膚反應(yīng)(皮疹、蕁麻疹）等。因此，中藥在治療過程中不僅能保證療效，還能確保安全性。

最佳復(fù)方中藥包含冰片、白礬、白鮮皮、五倍子、苦參共5 味中藥，幾味藥組合，有清熱燥濕、祛風(fēng)止癢、解毒消腫、燥濕斂瘡之功效，主治風(fēng)熱濕毒所致的風(fēng)疹、皮膚瘙癢、疥癬濕瘡、癰疽腫毒。既符合中醫(yī)理論，又適合制成外用制劑，而該組方的臨床應(yīng)用效果如何，其作用機理是什么，還有待進一步研究。