馬脂肪間充質干細胞的分離培養(yǎng)與生物學特性試驗

羅惠娜 ， 雷 彬 ， 王丙云 ， 王彩瑩 ， 黃國健 ， 陳勝鋒 ，陳志勝 ， 羅冬章 ， 詹小舒 ， 劉璨穎 ， 白銀山

(1. 佛山科學技術學院生命科學與工程學院 ， 廣東 佛山 528231 ； 2.廣東省黃村體育訓練中心 ， 廣東 廣州 510663)

干細胞(Stem cells, SCs)是一類具有自我更新能力和多向分化潛能的原始未分化細胞。間充質干細胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)作為干細胞家族中重要成員，也具有多向分化潛能，可分化為脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、神經(jīng)細胞等其他細胞，是再生療法的成體干細胞中非常有前途的種子細胞[1-2]。在治療運動系統(tǒng)及退行性疾病方面發(fā)揮著巨大的潛能[3]。在馬獸醫(yī)學中，MSCs適用于治療馬肌腱韌帶拉傷和關節(jié)炎等損傷[4-8]。

肌腱和韌帶拉傷、骨關節(jié)炎是人類和賽馬臨床常見的運動性疾病。迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)理想的治療方法。在過去的十幾年中，潛在的再生療法，特別是干細胞療法引起了人們極大的興趣。脂肪間充質干細胞(Adipose derived mesenchymal stem cells, AD-MSCs)是指來源于脂肪組織的MSCs。相比于骨髓來源的MSCs，具有來源豐富、操作簡便、容易獲得、體外增殖能力強等特征[9]，是治療運動系統(tǒng)及退行性疾病的理想種子細胞。但目前缺乏標準化的分離、培養(yǎng)和鑒定馬AD-MSCs的方法?，F(xiàn)階段，建立馬AD-MSCs培養(yǎng)體系，將會對運動賽馬等動物及人類干細胞的臨床轉化應用奠定基礎。本試驗主要研究了馬AD-MSCs的分離方法、培養(yǎng)體系和生物學特性，為下一步疾病的治療提供理想的種子細胞。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 由廣州奧體馬術場提供的中年純血騸馬。

1.1.2 主要試劑與設備 DMEM基礎培養(yǎng)基(Hyclone公司)；胎牛血清FBS (BI公司)；0.25%胰蛋白酶(Hyclone公司)；0.1% Ⅰ型膠原酶(Sigma公司)；干細胞成脂誘導分化完全培養(yǎng)基(Cyagen公司)；干細胞成骨誘導分化完全培養(yǎng)基(Cyagen公司)；RNA提取試劑盒(TaKaRa公司)；反轉錄試劑盒(TaKaRa公司)；CD90-PE、CD45-FITC購自Abcam；CD105-FITC購自Invitrogen；CD44-FITC購自R&D。

超凈工作臺(蘇州蘇凈公司)；熒光顯微鏡(Olympus公司)；超速低溫離心機(Beckman公司)；PCR儀(Thermofisher公司)；流式細胞儀(BD公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 脂肪采集 對試驗馬匹進行鎮(zhèn)靜處理，頸部采集脂肪組織后進行常規(guī)外科縫合。將采集的脂肪組織放入含10%雙抗的PBS緩沖液中，低溫送回實驗室進行下一步試驗。

1.2.2 原代馬AD-MSCs的分離、培養(yǎng) PBS緩沖溶液清洗脂肪組織表面的血細胞2～3次，轉移至培養(yǎng)皿中；用無菌器械將組織塊剪碎至1 mm3，0.1%Ⅰ型膠原酶消化2 h至無明顯大顆粒，100目細胞篩過濾，將濾液轉移至15 mL離心管，1 000 r/min離心5 min，棄去上清；然后用含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基重懸沉淀，調整細胞密度至1×106個細胞/mL，轉移至60 mm培養(yǎng)皿置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后首次半量更換培養(yǎng)基除去大部分血細胞，以后每隔3 d更換1次培養(yǎng)基。倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)和生長情況，此時細胞即為P0代馬AD-MSCs。

1.2.3 細胞傳代培養(yǎng)及生長特性觀察 待細胞長至80%～90%匯合時，棄去上清液，用PBS清洗細胞1～2次。0.25%胰蛋白酶消化，用含10%FBS的培養(yǎng)基終止消化。離心、棄上清、進行傳代擴增培養(yǎng)。顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)及活性，并拍照記錄。

1.2.4 細胞生長曲線制作及群體倍增時間的測定 繪制細胞生長曲線：依次取P2、P5、P8代馬AD-MSCs，調整細胞密度至5×104個細胞/mL，接種于24孔板中， 置于37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。隨后每天隨機抽取5個孔消化，按細胞、臺盼藍體積分數(shù)比1∶1混勻， 采用Counstar細胞計數(shù)儀計數(shù)。每孔計數(shù)3次取平均值，持續(xù)8 d。繪制P3、P6、P9代細胞的生長曲線。橫坐標代表培養(yǎng)天數(shù)(d)，縱坐標代表細胞數(shù)。

細胞群體倍增時間的計算：根據(jù)生長曲線的對數(shù)增殖期計算群體倍增時間。Patterson公式為DT=t×[lg2/(lgNt-lgNo)])，t為培養(yǎng)時間，No為首次記下的細胞數(shù)，Nt為t時間后的細胞數(shù)。

1.2.5 馬AD-MSCs的生物學特性研究

(1)細胞形態(tài)學觀察 倒置顯微鏡下觀察原代及傳代培養(yǎng)細胞的形態(tài)。

(2)馬AD-MSCs表面標志物測定 消化P3代馬AD-MSCs，調整細胞密度為1×106個細胞/mL。轉移至1.5 mL離心管中，PBS清洗后離心，棄上清。分別加入一抗稀釋液，標記的抗體有：CD105-FITC、CD45-FITC、CD90-PE、CD44-FITC。避光孵育30 min后離心棄去上清，加100 μL PBS重懸，流式細胞儀分析馬AD-MSCs表面標志物。

(3)總RNA提取, cDNA合成和PCR基因檢測 引物設計如表1，檢測CD90、CD44、CD73和CD105等間充質干細胞表面標志物的相關基因。取P5代傳代細胞，TaKaRa試劑盒提取總RNA, RNA濃度由分光光度計A260 nm測定。反轉錄成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩２DNA全組基因作為模板進行PCR體系擴增，電泳檢測擴增產(chǎn)物。

表1 MSCs相關基因的引物序列

(4)馬AD-MSCs的成骨誘導分化試驗 取生長狀態(tài)良好的P3代細胞，調整細胞密度為1×105個細胞/mL，接種至24孔板。試驗分為對照組和試驗組，每組3個重復。培養(yǎng)24 h后棄去原培液，PBS清洗2遍，試驗組加入成骨誘導分化完全培養(yǎng)基，對照組則加入含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基。3 d換1次液，直至試驗組出現(xiàn)鈣結節(jié)。然后用10%多聚甲醛固定30 min，經(jīng)堿性磷酸酶染色10 min，PBS清洗后顯微鏡下觀察并拍照記錄。

(5)馬AD-MSCs的成脂誘導分化試驗 取生長狀態(tài)良好的 P3代脂肪細胞，調整細胞密度為 1×105個細胞/mL，接種 24孔培養(yǎng)板上。試驗分為對照組和試驗組，每組3個重復。試驗組按照說明書交替加入成脂誘導分化A液和B液，對照組則加入含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)3～5個循環(huán)后，10%多聚甲醛固定30 min，油紅O染色10 min，PBS清洗后顯微鏡拍照記錄。

2 結果

2.1 馬AD-MSCs形態(tài)學觀察 采用Ⅰ型膠原酶消化法得到原代培養(yǎng)的細胞呈圓形，胞體透亮。此時細胞雜亂，大量紅細胞覆蓋在表面，通過半數(shù)更換培養(yǎng)基除去大多數(shù)雜細胞。培養(yǎng)至72 h細胞開始貼壁，此時細胞形態(tài)多樣，見圖1A；培養(yǎng)至5 d時，細胞大量貼壁，細胞呈長梭形，胞質較大，折光性強，見圖1C；培養(yǎng)至7 d，細胞達70%～80%匯合即可傳代，傳代細胞出現(xiàn)均勻分布的紡錘形，呈典型的漩渦狀，見圖1E；細胞傳代至P9代仍能保持穩(wěn)定增長，保持細胞形態(tài)不變，見圖1F。

2.2 馬AD-MSCs生長曲線及群體倍增時間的測定 如圖2所示，P3、P6、P9代馬AD-MSCs的生長曲線均呈典型的S型，第3天進入對數(shù)生長期，P3、P6代細胞第6天進入平臺期，P9代細胞第8天進入平臺期。P9代增值能力開始下降。繪制的生長曲線符合Logistic生長曲線規(guī)律。圖3所示為細胞群體倍增時間圖。隨著細胞代數(shù)的增加，群體倍增時間也遞增。

圖2 馬AD-MSCs生長曲線

圖3 群體倍增時間

2.3 馬AD-MSCs表面標志物檢測 P3代馬AD-MSCs高表達間充質干細胞表面標志物CD105、CD44和CD90，不表達造血系細胞表面標志物CD45，見中插彩版圖4。

2.4 馬AD-MSCs表面標志物基因檢測 MSCs相關基因PCR鑒定結果如圖5所示，細胞高表達CD105、CD90、CD73和CD44基因。該結果符合間充質干細胞特性。

圖5 PCR結果

2.5 AD-MSCs成骨誘導分化試驗 取生長狀態(tài)良好的P3代細胞進行成骨誘導分化鑒定，對照組細胞形態(tài)未發(fā)生明顯變化，10 d后鋪滿整個培養(yǎng)皿，未出現(xiàn)鈣結節(jié)。試驗組加入成骨誘導培養(yǎng)液7 d后，細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，呈現(xiàn)鱗片狀、細胞堆積連接成片；誘導培養(yǎng)10 d出現(xiàn)鈣結節(jié)，運用茜素紅進行礦化結節(jié)染色。顯微鏡下觀察試驗組可見細胞融合重疊生長，整個視野形成大面積明顯的紅色致密結節(jié)。表明細胞形成礦化結節(jié)，對照組茜素紅染色呈陰性，見中插彩版圖6。

2.6 AD-MSCs成脂誘導分化試驗 取生長狀態(tài)良好的P3代細胞進行成脂誘導分化，對照組細胞形態(tài)未發(fā)生明顯變化，試驗組細胞加入誘導分化培養(yǎng)液后14 d，大部分細胞呈卵圓形，胞質內出現(xiàn)許多大小不一的脂質顆粒出現(xiàn)；21 d后脂滴逐漸增多。油紅O 染色結果顯示，試驗組脂質顆粒被染成紅色。表明馬AD-MSCs有脂向分化的能力，對照組油紅O染色呈陰性，見中插彩版圖7。

3 討論

MSCs是一種起源于中胚層，具有自我更新能力及誘導分化為脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞及其他胚層細胞潛能的成體干細胞。相比于其他組織來源的MSCs，ADMSCs具有來源豐富、易獲得、增殖能力強的特點，并具有趨化歸巢到損傷組織、旁分泌和免疫調節(jié)等功能，應而廣泛應用于再生醫(yī)學和組織工程領域中[10]。目前，國內未見到有關馬的AD-MSCs的分離、培養(yǎng)、鑒定及其在治療馬運動系統(tǒng)、退行性疾病方面的應用的報道。因此，建立馬的AD-MSCs的分離方法、培養(yǎng)體系具有重要意義，能為馬屬動物相關疾病的治療提供同源性的治療用干細胞，并對干細胞運用的安全性、有效性提供理論依據(jù)。

目前主要采用組織塊培養(yǎng)法、胰酶膠原酶法進行AD-MSCs分離培養(yǎng)。本試驗采用Ⅰ型膠原酶消化法從脂肪組織分離得到馬的AD-MSCs。在顯微鏡下可見紡錘形，呈典型的旋渦狀生長。經(jīng)多次傳代后，細胞形態(tài)均能保持一致。相比其他培養(yǎng)方法，Ⅰ型膠原酶消化法更加溫和，操作更簡便，分離得到的細胞活性更好，能夠傳代次數(shù)更多[11]。通過細胞計數(shù)法觀察P3、P6、P9傳代細胞生長曲線及群體倍增時間，繪制的生長曲線符合Logistic生長曲線規(guī)律。P3～P6代細胞增值能力基本相同，P9代增值能力略低于P3～P6代細胞。

本試驗結合使用 RT-PCR 和流式細胞術檢測MSCs標志物，P3代馬AD-MSCs高表達細胞表面標記分子CD44、CD105、CD90，不表達造血干細胞表面標記CD45；PCR擴增得到相應MSCs特定基因片段，與Sherman等[12]的研究結果相一致。在特定誘導環(huán)境和條件下，馬AD-MSCs可向脂肪、肌肉、向骨、軟骨、神經(jīng)、血管等多種方向分化[13-14]。本試驗分別對馬AD-MSCs進行了成骨和成脂誘導分化，檢測了馬AD-MSCs的多向分化能力。成骨誘導培養(yǎng)基主要成分為β-甘油磷酸、地塞米松和抗壞血酸，其中地塞米松和抗壞血酸可促進骨成熟和細胞外基質中膠原的合成；β-甘油磷酸鈉可促進細胞內鈣鹽沉積和鈣化形成。茜素紅染液可將鈣鹽沉積染成深紅色得以在顯微鏡下觀察。成脂誘導分化液中主要誘導因子有胰島素、IBMX、羅格列酮、地塞米松，能夠很好的促進間充質干細胞向脂肪方向誘導分化。這些結果均符合國際MSCs標準定義：即貼壁性，表達CD44、CD90、CD105等表面分子，不表達造血細胞表面標志物；在特定條件下可誘導分化為骨細胞和脂肪細胞[15]。

綜上所述，本試驗建立的該原代分離培養(yǎng)及鑒定方法簡便快捷，可得到大量的馬AD-MSCs。結果可靠、重復性和可操作性強，為間充質干細胞的臨床應用提供穩(wěn)定的來源。