驗(yàn)證鈉離子的主動(dòng)運(yùn)輸需要能量

遲向向 劉斯璐

（北京師范大學(xué)第二附屬中學(xué)未來(lái)科技城學(xué)校 北京 102209）

《普通高中生物學(xué)課程標(biāo)準(zhǔn)（2017 版）》在說(shuō)明模塊1《分子與細(xì)胞》的教學(xué)時(shí)，提出讓學(xué)生了解細(xì)胞生命活動(dòng)中物質(zhì)、能量和信息變化的統(tǒng)一，并且特別提出了“物質(zhì)通過(guò)被動(dòng)運(yùn)輸、主動(dòng)運(yùn)輸?shù)确绞竭M(jìn)出細(xì)胞，以維持細(xì)胞的正常代謝活動(dòng)”的重要概念，在本模塊的教學(xué)提示中強(qiáng)調(diào)了“教師要組織好各種觀察、實(shí)驗(yàn)等探究性學(xué)習(xí)活動(dòng)，從而幫助學(xué)生增加感性認(rèn)識(shí)，克服對(duì)微觀結(jié)構(gòu)認(rèn)識(shí)的困難，使學(xué)生領(lǐng)悟科學(xué)研究的方法并習(xí)得相關(guān)的操作技能”。在教學(xué)中應(yīng)讓學(xué)生積極參與動(dòng)手和動(dòng)腦的活動(dòng)，通過(guò)探究性學(xué)習(xí)活動(dòng)或完成工程學(xué)任務(wù)，從而加深對(duì)生物學(xué)概念的理解，提升應(yīng)用知識(shí)的能力，培養(yǎng)創(chuàng)新精神，進(jìn)而能用科學(xué)的觀點(diǎn)、知識(shí)、思路和方法，探討或解決現(xiàn)實(shí)生活中的某些問(wèn)題［1］。

人教版高中生物學(xué)必修1《分子與細(xì)胞》中第4章第3 節(jié)“物質(zhì)跨膜運(yùn)輸?shù)姆绞健敝兄攸c(diǎn)介紹了2種運(yùn)輸方式：被動(dòng)運(yùn)輸和主動(dòng)運(yùn)輸。其中對(duì)于被動(dòng)運(yùn)輸，教材中以植物細(xì)胞的吸水和失水（即質(zhì)壁分離實(shí)驗(yàn)）簡(jiǎn)單幫助學(xué)生增加直觀認(rèn)知。而對(duì)于主動(dòng)運(yùn)輸，作為一種重要的運(yùn)輸方式，它保證了細(xì)胞可按照生命所需主動(dòng)吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，排出代謝廢物，充分體現(xiàn)了生命活動(dòng)的主動(dòng)性。但教材卻缺乏相關(guān)實(shí)例，僅以動(dòng)畫(huà)模型的方式作簡(jiǎn)單介紹。教師在教學(xué)中常使用動(dòng)畫(huà)模擬的形式，這種方式的教學(xué)效果方面遠(yuǎn)不及動(dòng)手實(shí)驗(yàn)。學(xué)生在對(duì)主動(dòng)運(yùn)輸?shù)? 個(gè)重要特點(diǎn)（即需要載體和能量）的理解上存在很大障礙。本實(shí)驗(yàn)以此為基礎(chǔ)，選用細(xì)胞呼吸抑制劑抑制細(xì)胞內(nèi)能量的供應(yīng)，驗(yàn)證主動(dòng)運(yùn)輸需要能量，同時(shí)還對(duì)不同的細(xì)胞呼吸抑制劑進(jìn)行了比較和篩選，綜合考慮多種因素，最終確定丙二酸鈉是最適合在高中生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中推廣的細(xì)胞呼吸抑制劑。

1 實(shí)驗(yàn)原理

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑選擇

1.1.1 目標(biāo)離子的選擇 鈉離子是植物所需的礦物質(zhì)元素之一。高等植物在吸收鈉離子時(shí)，需要具有以H+為工作離子的質(zhì)膜ATP 酶。它水解ATP 的部分在質(zhì)膜的細(xì)胞質(zhì)一側(cè)，ATP 水解產(chǎn)生的能量將細(xì)胞質(zhì)中的H+泵至膜外，使膜內(nèi)H+濃度降低而膜外H+濃度升高，同時(shí)產(chǎn)生膜電位的過(guò)極化。使質(zhì)膜兩側(cè)產(chǎn)生了質(zhì)子濃度梯度和膜電位梯度，這二者之和稱(chēng)為電化學(xué)勢(shì)梯度，又稱(chēng)為質(zhì)子動(dòng)力，驅(qū)動(dòng)鈉離子進(jìn)入到細(xì)胞中，這種運(yùn)輸方式稱(chēng)為次級(jí)主動(dòng)運(yùn)輸，此過(guò)程需要消耗能量［2］。能量由細(xì)胞中的直接能源物質(zhì)ATP 水解提供，而細(xì)胞呼吸又是ATP 的重要來(lái)源之一，如果抑制細(xì)胞呼吸，以主動(dòng)運(yùn)輸方式進(jìn)入細(xì)胞的鈉離子的運(yùn)輸速率就會(huì)受到阻礙。而鈉鹽的種類(lèi)豐富多樣，為了最大程度地保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果不受其他因素干擾，實(shí)驗(yàn)選用了植物MS 培養(yǎng)基重要組成成分之一的鉬酸鹽。鉬酸鹽是一種強(qiáng)堿弱酸鹽，而對(duì)于溶液pH 值的作用，鈉離子的影響更大，其次鉬酸鈉溶于水無(wú)色透明，不影響實(shí)驗(yàn)觀察，并且毒性及環(huán)境污染性極低、易獲取，更適合于中學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 細(xì)胞呼吸抑制劑的選擇

1）疊氮鈉。細(xì)胞呼吸過(guò)程是依靠于分子氧在內(nèi)的電子傳遞系統(tǒng)或電子傳遞鏈完成。電子傳遞鏈位于線粒體內(nèi)膜，是由遞電子體和遞氫體組成的，傳遞體由4 個(gè)復(fù)合體組成，電子通過(guò)這些復(fù)合體傳遞到分子氧，此過(guò)程可被某些特異性的抑制劑所抑制［3］。疊氮鈉就是一種能抑制電子從復(fù)合體Ⅳ轉(zhuǎn)移到氧氣的轉(zhuǎn)移性抑制劑［4］。

2）丙二酸和丙二酸鈉。在呼吸作用的三羧酸循環(huán)中，琥珀酸在琥珀酸脫氫酶的催化下被氧化生成延胡索酸，琥珀酸脫氫酶含有鐵硫中心和共價(jià)結(jié)合的黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD），來(lái)自琥珀酸的電子通過(guò)FAD 和鐵硫中心，然后進(jìn)入電子傳遞鏈［5］。丙二酸的結(jié)構(gòu)和琥珀酸類(lèi)似，可與琥珀酸競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合酶的活性中心，是琥珀酸脫氫酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，所以可阻斷三羧酸循環(huán)［6］。丙二酸鈉是線粒體呼吸鏈氧化磷酸化酶系復(fù)合體Ⅱ中琥珀酸脫氫酶的可逆性抑制劑。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料選擇 如何檢測(cè)鈉離子的運(yùn)輸過(guò)程？學(xué)生在初中階段就已知鈉離子是一種強(qiáng)堿鹽，能改變細(xì)胞內(nèi)的pH 值，而在植物細(xì)胞內(nèi)恰好存在一種天然的酸堿指示劑——花青素，能隨著細(xì)胞內(nèi)pH 值的變化發(fā)生明顯的顏色變化［7］，在堿性環(huán)境中會(huì)變成藍(lán)色甚至深藍(lán)色，而在酸性環(huán)境中則變成紅色。在“植物細(xì)胞的質(zhì)壁分離實(shí)驗(yàn)”實(shí)驗(yàn)中，學(xué)生恰巧接觸過(guò)這樣一種富含花青素的材料——紫色洋蔥，其外表皮細(xì)胞有紫色大液泡，操作簡(jiǎn)單、效果較好。

2 實(shí)驗(yàn)方法

1）制片：撕取紫色洋蔥外表皮分別置于蒸餾水、0.1 mol／L NaN3、0.1 mol／L 丙二酸、0.1 mol/L丙二酸鈉中浸泡2 min 后制作臨時(shí)裝片。

2）觀察：顯微鏡觀察細(xì)胞顏色及形態(tài)。

3）實(shí)驗(yàn)：從蓋玻片的一端滴加2 mol／L 鉬酸鈉溶液，另一端用吸水紙吸引，觀察并記錄實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 鈉離子的跨膜運(yùn)輸會(huì)使細(xì)胞內(nèi)pH 值發(fā)生改變，引起花青素顏色變化 從圖1（本文附圖見(jiàn)封四）可觀察到，隨著鈉離子的跨膜運(yùn)輸，細(xì)胞內(nèi)花青素的顏色由淺紫色逐漸變?yōu)樗{(lán)色，最后變?yōu)樯钏{(lán)色。此過(guò)程顏色變化非常迅速，少數(shù)細(xì)胞在2 min后即變?yōu)樯钏{(lán)色，其他部分細(xì)胞基本在5.5 min左右全部變色。

3.2 呼吸酶抑制劑疊氮鈉能抑制鈉離子的跨膜運(yùn)輸 通過(guò)實(shí)驗(yàn)1 的結(jié)果，可發(fā)現(xiàn)鈉離子的跨膜運(yùn)輸?shù)拇_會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)的顏色變化，且此過(guò)程的速度較快。鈉離子是以主動(dòng)運(yùn)輸?shù)男问娇缒み\(yùn)輸，此過(guò)程最主要的特點(diǎn)是需要ATP 水解提供能量，而細(xì)胞內(nèi)ATP 的主要來(lái)源之一是細(xì)胞呼吸。加入細(xì)胞呼吸抑制劑后，鈉離子的轉(zhuǎn)運(yùn)速度是否會(huì)受影響？

圖2 中，與對(duì)照組相比，經(jīng)疊氮鈉處理后細(xì)胞內(nèi)花青素的顏色變化非常緩慢，在處理5.5 min后視野中僅有少數(shù)細(xì)胞剛開(kāi)始發(fā)生顏色變化；在處理長(zhǎng)達(dá)25 min 后，細(xì)胞才開(kāi)始出現(xiàn)較為明顯的藍(lán)色。這說(shuō)明抑制細(xì)胞呼吸阻斷細(xì)胞內(nèi)能量供應(yīng)的確能抑制鈉離子的主動(dòng)運(yùn)輸，進(jìn)一步驗(yàn)證了主動(dòng)運(yùn)輸過(guò)程是需要能量的。

3.3 不同呼吸抑制劑對(duì)鈉離子的跨膜運(yùn)輸?shù)淖饔?呼吸抑制劑多種多樣，它們具體效果如何，哪一種又比較適合在高中生物學(xué)實(shí)驗(yàn)推廣？基于上述考慮，選用了疊氮鈉、丙二酸、丙二酸鈉3 種細(xì)胞呼吸抑制劑進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果如圖3。

根據(jù)圖3 可知，加入不同類(lèi)型的呼吸抑制劑后，細(xì)胞內(nèi)顏色變化的速率明顯下降，視野中發(fā)生變化的細(xì)胞數(shù)目也少了許多，這再次驗(yàn)證了之前的結(jié)論：不同的抑制劑均可通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)能量供應(yīng)來(lái)抑制鈉離子的主動(dòng)運(yùn)輸。通過(guò)對(duì)比還發(fā)現(xiàn)，在這3 種呼吸抑制劑中，在丙二酸鈉組處理25 min 后，不僅視野中發(fā)生顏色變化的細(xì)胞數(shù)目最少，而且顏色變化的速率最慢，顏色也最淺，說(shuō)明其抑制效果最為顯著。

綜上所述，丙二酸鈉的抑制效果最為明顯，而且相比于其他呼吸抑制劑毒性較低、更易獲取，所以最適合在高中生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行推廣。

4 討論與展望

本實(shí)驗(yàn)從學(xué)生實(shí)際出發(fā)，以生物學(xué)科核心素養(yǎng)為基本理念進(jìn)行設(shè)計(jì)，操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)較短，可在40 min 內(nèi)完成且成本較低，很好地幫助學(xué)生攻克主動(dòng)運(yùn)輸需要能量這一難點(diǎn)，提高了高中生物學(xué)的教學(xué)效果。

本實(shí)驗(yàn)也存在一定的局限性，例如選用的呼吸抑制劑種類(lèi)較少，后續(xù)可選用其他類(lèi)型的呼吸抑制劑例如呼吸鏈解偶聯(lián)劑2，4-二硝基苯酚（DNP）及質(zhì)膜H+-ATPase 抑制劑釩酸鈉（Na3VO4）等繼續(xù)展開(kāi)實(shí)驗(yàn)。主動(dòng)運(yùn)輸?shù)牧硗庖粋€(gè)重要特點(diǎn)是需要載體蛋白的協(xié)助，故可使用特異性的載體抑制劑證明主動(dòng)運(yùn)輸過(guò)程需要載體的協(xié)助，進(jìn)而和協(xié)助擴(kuò)散進(jìn)行對(duì)比，驗(yàn)證協(xié)助擴(kuò)散是只需要載體蛋白不需要能量，幫助學(xué)生徹底攻克物質(zhì)跨膜運(yùn)輸這一難點(diǎn)。