瀘型酒酒醅與窖泥中梭菌群落結(jié)構(gòu)、演替和功能差異

錢瑋，陸震鳴，柴麗娟，張曉娟，徐鵬翔，李崎，王松濤，沈才洪，史勁松，許正宏,

1 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122

2 江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122

3 江南大學(xué) 江蘇省生物活性制品加工工程技術(shù)研究中心，江蘇 無錫 214122

4 國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川 瀘州 646000

5 蘇州科技大學(xué) 化學(xué)生物與材料工程學(xué)院，江蘇 蘇州 215009

瀘型酒是濃香型白酒的典型代表，具有獨特的風(fēng)格和口味，深受廣大消費者喜愛。泥窖是瀘型酒釀造過程中使用的一種獨特生物反應(yīng)器，其特有的營養(yǎng)環(huán)境條件為種類繁多的微生物提供了棲息繁衍場所[1]。梭菌綱細菌 (Clostridia) 是窖池微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成，也是釀酒過程產(chǎn)生己酸、丁酸等風(fēng)味物質(zhì)的主要功能微生物[2]，窖泥中存在的多種梭菌還能夠與甲烷菌共棲，產(chǎn)生獨特的風(fēng)味代謝產(chǎn)物[3-4]。已有研究表明，酒醅和窖泥里面均存在種類多樣的梭菌，但目前對酒醅和窖泥中梭菌的種類、發(fā)酵演替規(guī)律以及釀造代謝功能的差異尚缺少系統(tǒng)比較。

本研究以連續(xù)使用的瀘州老窖優(yōu)質(zhì)百年窖池內(nèi)酒醅和窖泥中梭菌群落為研究對象，通過分子生態(tài)學(xué)技術(shù)分析對比了釀造過程酒醅和窖泥中梭菌綱細菌群落的物種多樣性和發(fā)酵演替規(guī)律，并對純培養(yǎng)分離的梭菌菌株發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸特性進行了對比分析，為理解梭菌在瀘型白酒釀造過程中的作用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

樣品采自四川瀘州老窖羅漢釀酒基地100年窖齡窖池 (長×寬×高=4.3 m×2.3 m×2.3 m)。自入窖開始第 0、1、3、5、7、9、11、16、21、26、36、46天 (發(fā)酵結(jié)束)，使用自制取樣工具于窖池中層采集酒醅樣品，于窖池底部采集窖泥樣品，每份約50 g，每個時間點取3個平行樣[5]。取樣樣品迅速裝入無菌塑封袋，-80 ℃保存。

1.2 主要儀器和材料

Whitley DG250厭氧培養(yǎng)箱，英國 Don Whitley Scientific公司；ND 2000核酸檢測儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；熒光定量PCR儀Bio-Rad CFX Real-Time System，美國Bio-Rad公司；Illumina HiSeq 2000測序平臺，深圳華大基因；PowerSoil?DNA提取試劑盒，美國MOBIO公司；乙酸、丁酸、戊酸、己酸標準品，上海阿拉丁試劑。

梭菌強化培養(yǎng)基 (RCM，g/L)：葡萄糖5，胰蛋白胨10，酵母粉3，牛肉膏10，氯化鈉3，無水乙酸鈉3，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5，可溶性淀粉1，pH 6.5，121 ℃下高壓滅菌20 min。ES培養(yǎng)基(g/L)：乙酸鈉5，酵母粉1，硫酸鎂0.2，磷酸氫二鉀 0.4，硫酸銨 0.5，pH 6.0，121 ℃高壓滅菌20 min后加入無水乙醇 (終濃度20 mL/L)。

1.3 宏基因組DNA提取

稱取5.0 g樣品至無菌陶瓷研缽中，加入液氮研磨。每份樣品稱取0.2 g粉末，采用試劑盒提取DNA，檢測 DNA濃度和純度 (A260/A280值在1.8–2.0 之間)。

1.4 總細菌和梭菌綱細菌定量分析

采用熒光定量PCR (qPCR)，對酒醅和窖泥中總細菌和梭菌綱細菌進行定量分析[5-6]。使用細菌通用引物 338F/518R[7]和梭菌綱細菌特異性引物SJ-F/SJ-R[8]，以Cq值為橫坐標，Lg (copies/g) 活菌數(shù)為縱坐標，繪制大腸桿菌Escherichia coli生物量標準曲線Y=-0.341X+12.106 (R2=0.995 6)(圖1A)和克氏梭菌Clostridium kluyveri生物量標準曲線Y=-0.285X+11.664 (R2=0.996 3) (圖1B)。

1.5 16S rRNA擴增子測序分析

采用細菌通用引物338F/806R擴增16S rRNA基因的V3/V4區(qū)[9]，構(gòu)建測序文庫后進行高通量測序。采用QIIME (V1.9.1) 對測序原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)控與分析，以97%相似度為標準對測序序列進行操作分類單元 (OTU) 劃分[10-11]，并使用SILVA和 RDP數(shù)據(jù)庫對 OTU進行分類學(xué)注釋。分析Shannon、Chao1、Ace等微生物群落α-多樣性指數(shù)[12]。采用R (version 3.4.4) 對各樣本進行主坐標分析 (PCoA) 及聚類分析。采用 LEfSe (LDA Effect Size) 分析對比不同樣本組間差異菌群[13]。測序數(shù)據(jù)提交至美國國立生物技術(shù)信息中心SRA數(shù)據(jù)庫 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/traces/sra)，登錄號為PRJNA558446。

1.6 梭菌的分離鑒定及代謝產(chǎn)物檢測

取5.0 g酒醅或窖泥分別加入100 mL無菌生理鹽水，2 000 r/min振蕩 5 min，80 ℃熱處理10 min后，以 5%接種量接種至厭氧預(yù)處理的RCM和ES液體培養(yǎng)基中，厭氧 (N2∶H2∶CO2=8∶1∶1) 培養(yǎng)14 d。培養(yǎng)液稀釋涂布于RCM和ES固體培養(yǎng)基，挑取單菌落進行液體培養(yǎng)7 d，離心收集菌體后采用試劑盒提取DNA，利用細菌通用引物27F/1492R[14]擴增 16S rRNA基因序列后進行測序[15]。梭菌菌株接種至 RCM 液體培養(yǎng)基，厭氧靜置培養(yǎng)7 d后，檢測發(fā)酵液中短鏈脂肪酸 (乙酸、丁酸、戊酸和己酸等) 含量[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 總細菌及梭菌綱細菌的定量分析

整個發(fā)酵過程中，酒醅中梭菌和總細菌的基因拷貝數(shù)比值變化較大 (0.9%–36.5%)，而窖泥中梭菌和總細菌的基因拷貝數(shù)比值則相對比較穩(wěn)定(71.5%–91.2%)。酒醅中梭菌的基因拷貝數(shù)在第11天升至最高 (1.5×109copies/g)，然后迅速降低，發(fā)酵結(jié)束時 (46 d) 為1.3×107copies/g；窖泥中總細菌、梭菌綱細菌均呈現(xiàn)先增加后減少趨勢，第9天達最高 (1.0×1010copies/g和7.8×109copies/g)，隨后逐漸下降并保持相對穩(wěn)定 (圖1C)。

2.2 梭菌群落的α-多樣性

窖泥和酒醅樣本高通量測序共獲得963個梭菌綱OTU，平均覆蓋度分別為99.1%和89.2%。酒醅梭菌群落Chao1豐富度指數(shù)在發(fā)酵前3天緩慢上升至 346.7，隨后不斷下降至發(fā)酵結(jié)束的43.5；窖泥梭菌群落 Chao1指數(shù) (493.0–630.9) 明顯高于酒醅。隨著發(fā)酵進行，酒醅中梭菌群落的Shannon多樣性指數(shù)從6.3下降為4.0，而窖泥梭菌群落多樣性指數(shù)在3.6–5.8之間動態(tài)變化。

2.3 窖池中梭菌群落的發(fā)酵演替規(guī)律

酒醅中梭菌綱細菌主要由梭菌科(Clostridiaceae 1，占梭菌綱平均相對豐度23.7%)、毛螺菌科 (Lachnospiraceae，17.4%)、Clostridiales Family Ⅺ (16.5%)、瘤胃菌科 (Ruminococcaceae，15.7%) 和太陽桿菌科 (Heliobacteriaceae，7.9%)組成，而窖泥中優(yōu)勢種群是太陽桿菌科 (57.2%)、瘤胃菌科 (10.4%) 和 Clostridiales Family Ⅺ(6.6%) (圖 2)。

發(fā)酵開始時，氫孢菌屬 (OTU890、OTU1) 是窖泥梭菌群落的優(yōu)勢物種 (>80%)，但在酒醅中相對豐度低于10%；發(fā)酵7–11 d，窖泥中產(chǎn)己酸菌屬(OTU8、OTU21) 和沉積物菌屬(OTU7、OTU24)等物種的相對豐度較發(fā)酵初期 (0–5 d) 有所增加，均值分別為9.84%和12.97%，而酒醅中梭菌屬的相對豐度變化相對較??；發(fā)酵16–46 d，窖泥梭菌群落結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)至發(fā)酵初始結(jié)構(gòu)，酒醅中毛螺菌科逐漸增長為優(yōu)勢類群，36 d時相對豐度達 43.75% (圖 2)。

2.4 窖泥與酒醅中梭菌群落結(jié)構(gòu)的差異

對種水平的梭菌綱細菌群落組成進行 PCoA分析，結(jié)果表明酒醅和窖泥在第一軸 (占總方差的 40.7%) 上可以明顯被分為兩組，且兩者群落結(jié)構(gòu)差異顯著 (R=0.65，P=0.001) (圖3A)。

圖1 發(fā)酵過程酒醅和窖泥中總細菌及梭菌綱細菌的實時熒光定量結(jié)果Fig. 1 The Real-time quantitative PCR results of bacteria and Clostridia in jiupei and pit mud during fermentation.

圖2 酒醅和窖泥中梭菌群落的演替規(guī)律Fig. 2 Succession of Clostridial community in jiupei and pit mud throughout fermentation.

圖3 窖泥與酒醅梭菌綱細菌群落結(jié)構(gòu)比較Fig. 3 Structure of Clostridial communities in jiupei and pit mud. (A) The PCoA scores plot. (B) The Circos plot of relative abundance of Clostridia (genus level).

窖池中氫孢菌屬 (Hydrogenispora) 和互營單胞菌屬 (Syntrophomonas) 主要分布在窖泥中，其相對豐度分別是酒醅中的7.6倍和1.7倍；而窖池中厭氧孢桿菌屬 (Anaerosporobacter)、狹義梭菌屬 1 (Clostridium sensu stricto1)和組織菌屬(Tissierella) 主要分布在酒醅樣品中，其豐度分別是窖泥中的74.8、18.6和10.2倍 (圖3B)。

2.5 梭菌綱細菌的篩選及代謝產(chǎn)物分析

采用平板分離和16S rRNA基因測序的方法，從酒醅和窖泥樣品中共分離和鑒定了54株梭菌，分為4個科7個屬20個種。每種梭菌選取1株代表菌株，在RCM液體培養(yǎng)基中厭氧靜置培養(yǎng)7 d后，檢測發(fā)酵液中的主要短鏈脂肪酸 (乙酸、丁酸、戊酸、己酸)的組成，結(jié)果見表1。

所有 20株所篩菌株均產(chǎn)乙酸，其中C. senegalenseCls01培養(yǎng)液中乙酸含量可達(3.0±0.0) g/L。20株菌中有 17株菌株培養(yǎng)液中檢出丁酸，其中拜氏梭菌C. beijerinckiiClb01發(fā)酵液丁酸含量最高，為 (2.0±0.1) g/L。有18株菌株的培養(yǎng)液中檢出戊酸，其中厭氧食氣梭菌C. carboxidivoransCar01培養(yǎng)液中戊酸含量最高，達 (4.1±0.5) g/L。18株菌株的發(fā)酵液中檢出己酸，其中肉毒梭菌C. botulinumClbo01培養(yǎng)液中己酸含量最高，為 (2.6±0.2) g/L，而半乳糖已酸菌Caproiciproducens galactitolivoransCag01培養(yǎng)液中己酸含量為 (0.5±0.1) g/L。

表1 梭菌菌株發(fā)酵液中主要脂肪酸組成Table 1 Production of main fatty acids in the fermentation broth of Clostridial species

3 討論與結(jié)論

本研究從種水平對比了同一窖池的酒醅和窖泥中梭菌綱細菌群落的結(jié)構(gòu)差異，結(jié)果表明酒醅和窖泥中梭菌群落的結(jié)構(gòu)存在顯著差異。酒醅中主要梭菌為梭菌屬，且種類較多，而窖泥中主要為氫孢菌屬(OTU890、OTU1) 和產(chǎn)己酸菌屬(OTU8、OTU21)。已有研究表明，Hydrogenispora ethanolicaLX-BT可利用葡萄糖產(chǎn)乙酸、乙醇和氫氣[17]；Caproiciproducens galactitolivoransBS-1T在乙酸存在的情況下可加快利用碳源轉(zhuǎn)化為乙醇、乙酸、丁酸和己酸，同時產(chǎn)生H2和CO2[18]，與其他產(chǎn)揮發(fā)性脂肪酸的菌株共培養(yǎng)時，己酸含量會增加[19]；Ruminiclostridium papyrosolvensDSM 2782T能夠降解纖維素產(chǎn)生乙醇、乳酸、乙酸、H2和 CO2[20-21]；Sedimentibacter acidaminivoransMO-SEDIT可利用賴氨酸和甘氨酸為氮源進行 Stickland反應(yīng)，產(chǎn)生乙酸和丁酸[22]。C. carboxidivoransDSM 15243T在H2、CO和CO2存在的情況下，不需利用其他碳源即可發(fā)酵產(chǎn)生乙醇、丁醇和己醇[23]。酒醅和窖泥中梭菌種類的差異可能與所處的營養(yǎng)環(huán)境有關(guān)，這些微生物在發(fā)酵過程中演替的機理尚需要進一步解析。

從窖池中分離了20種梭菌菌株，并通過純培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)同菌株發(fā)酵液中短鏈脂肪酸組成具有差異性，一方面反映了酒窖中存在的梭菌物種多樣性，另一方面也驗證了不同梭菌物種的代謝功能差異性。需要說明的是，梭菌菌株在不同培養(yǎng)條件下的代謝特性可能具有明顯差異，在窖池發(fā)酵過程中梭菌還與其他微生物和環(huán)境間存在著多種相互作用關(guān)系，其發(fā)酵機理還需進一步闡明[24]。與測序結(jié)果相比，窖池中另外兩個主要類群的梭菌(氫孢菌屬和沉積物菌屬) 尚未分離出純培養(yǎng)菌株，后續(xù)可以利用測序信息指導(dǎo)培養(yǎng)基的選擇和設(shè)計[25]，提高窖池梭菌的可培養(yǎng)性。

本研究利用分子生態(tài)學(xué)技術(shù)分析了瀘型酒泥窖發(fā)酵過程中酒醅和窖泥的梭菌綱群落結(jié)構(gòu)組成差異和演替規(guī)律，采用純培養(yǎng)方法分離并評價了梭菌綱菌株主要揮發(fā)性脂肪酸的組成特征，為解析梭菌群落的釀造功能提供了有益信息。