豬流行性腹瀉病毒ORF3蛋白40–91 aa是其細(xì)胞質(zhì)定位的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域

陳冰清，沈媚，司伏生，董世娟，于瑞嵩，謝春芳，李震

1 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201106

2 上海種豬工程技術(shù)研究中心, 上海 201106

3 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 201106

豬流行性腹瀉 (Porcine epidemic diarrhea,PED) 是由豬流行性腹瀉病毒 (Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV) 引起的一種高度傳染性腸道疾病[1-2]。雖然不同年齡的豬均對(duì)PEDV易感，但PEDV對(duì)哺乳仔豬的危害最為嚴(yán)重，致死率可達(dá)90%以上。自20世紀(jì)70年代首次在英國和比利發(fā)現(xiàn)以來，亞洲和歐洲國家都報(bào)道了PED的流行。1980年后，PED一直是許多亞洲國家如中國、日本、韓國和泰國養(yǎng)豬業(yè)面臨的嚴(yán)重問題[3]。自2010年以來，新變異株P(guān)EDV在豬群中再次暴發(fā)流行，給東南亞、北美等地區(qū)的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4-10]。由于缺乏有效的疫苗，PED仍在世界范圍內(nèi)流行。

PEDV屬于尼多病毒目 (Nidovirales)、冠狀病毒科 (Coronaviridae)、α冠狀病毒屬[11]。PEDV基因組全長約 28 kb，包含 5′端非翻譯區(qū)(5′UTR)、3′端非翻譯區(qū) (3′ UTR) 和分別編碼纖突蛋白 (S)、囊膜蛋白 (E)、膜蛋白 (M)、核衣殼蛋白 (N)、多聚蛋白 (1a/1ab) 以及附屬蛋白(ORF3) 的7個(gè)開放閱讀框 (ORFs)。

ORF3蛋白是 PEDV唯一的輔助蛋白。雖然ORF3蛋白是 PEDV的體外復(fù)制非必需的，但是ORF3蛋白影響病毒的復(fù)制，與病毒毒力相關(guān)。Wang等[12]的研究表明ORF3具有離子通道活性，調(diào)節(jié)病毒的釋放。Ye等[13]發(fā)現(xiàn)ORF3蛋白可以延長細(xì)胞S期、促進(jìn)弱毒株P(guān)EDV的增殖。最近，Kaewborisuth等[14]發(fā)現(xiàn)ORF3蛋白可與S蛋白發(fā)生相互作用而影響病毒的復(fù)制。Zou等[15]發(fā)現(xiàn)ORF3通過上調(diào) GRP78蛋白表達(dá)和激活PERK-Eif2α信號(hào)通路觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)并誘導(dǎo)自噬，但不影響細(xì)胞凋亡。與此ORF3細(xì)胞表達(dá)結(jié)果不同，我們最近重組PEDV感染研究發(fā)現(xiàn)完整或自然截短的ORF3可以通過抑制PEDV誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程而促進(jìn)病毒的復(fù)制[16]。上述研究也發(fā)現(xiàn)表達(dá)的 ORF3蛋白位于細(xì)胞質(zhì)中[13-17]，融合表達(dá)的標(biāo)簽 (如EGFP、Flag或Myc) 和表達(dá)的細(xì)胞系 (如Vero細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、293 T細(xì)胞或PK15細(xì)胞) 對(duì) ORF3蛋白在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)定位沒有影響[15]。然而，ORF3蛋白的細(xì)胞質(zhì)定位信號(hào)未見報(bào)道。

為揭示PEDV ORF3細(xì)胞質(zhì)定位信號(hào)，本研究構(gòu)建了PEDV DR13野毒株 (DR13wt) ORF3蛋白全長或系列ORF3蛋白截短肽的EGFP融合表達(dá)載體，利用激光共聚焦顯微鏡分析重組 ORF3蛋白及其系列截短肽在細(xì)胞內(nèi)的分布，研究結(jié)果將為進(jìn)一步研究ORF3蛋白的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)及功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒

大腸桿菌Escherichia coliTop10購自天根生化科技 (北京) 有限公司；非洲綠猴腎細(xì)胞 (Vero CCL-81) 購自ATCC，插入PEDV DR13wtORF3基因的重組 pJET1.2-ORF3由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[16]；質(zhì)粒 pEGFP-C1購自華越洋生物 (北京) 科技有限公司。

1.1.2 主要試劑和儀器

Prime STARTMHS DNA polymerase、DNA Marker購自大連寶生物有限公司；同源重組試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；T4克隆試劑盒購自NEB公司；限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ、BglⅡ購自Thermo Scientific公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒購自Axygen公司；瓊脂糖購自Sigma公司；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)液、Opti-MEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；Hoechst 33342購自北京索萊寶公司。

PCR儀購自BIO-RAD公司；紫外凝膠成像儀購自上海天能科技有限公司；激光共聚焦顯微鏡購自Leica公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自Thermo公司。

1.1.3 ORF3蛋白及截短蛋白編碼DNA擴(kuò)增引物

以PEDV DR13wtORF3基因序列 (GenBank登錄號(hào)：AFE85963.1) 為參考序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增全長、截短ORF3基因的引物，送生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 ORF3基因的比對(duì)及跨膜區(qū)預(yù)測(cè)

PEDV CV777野毒株ORF3 (CV777wtORF3,GenBank登錄號(hào)：AAK38657.1) 和 PEDV DR13野毒株 ORF3(DR13wtORF3, GenBank登錄號(hào)：AFE85963.1)氨基酸序列比對(duì)采用Clustal X2。利用 TMHMM 2.0在線預(yù)測(cè) ORF3蛋白的跨膜域(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)。

1.2.2 DR13wt ORF3及截短肽真核表達(dá)載體的構(gòu)建

利用設(shè)計(jì)的引物，以 pJET1.2-ORF3為模板PCR擴(kuò)增PEDV DR13wtorf3基因全長和系列截短肽編碼DNA；PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳切膠純化后通過同源重組連接至經(jīng)BamH Ⅰ和BglⅡ雙酶切的pEGFP-C1載體，構(gòu)建ORF3及其截短肽的EGFP融合表達(dá)質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)酶切和測(cè)序驗(yàn)證。得到的重組質(zhì)粒見表1。

表1 本研究構(gòu)建的重組質(zhì)粒Table 1 Recombinant plasmids constructed in this study

1.2.3 ORF3蛋白及其截短肽的真核表達(dá)

將Vero細(xì)胞接種至預(yù)先放置細(xì)胞爬片的24孔板中，CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)；待細(xì)胞生長至75%的匯合度時(shí)，按照Lipofectamine 2000使用說明書配置Lipofectamine 2000與重組質(zhì)?；旌弦海覝叵蚂o置5 min；每孔加入50 μL混合液，輕搖混勻，繼續(xù)培養(yǎng)16–18 h表達(dá)ORF3蛋白及其截短肽。

1.2.4 細(xì)胞固定和細(xì)胞核染色

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后16–18 h棄培養(yǎng)液，以PBS漂洗3次，每次3 min；4%的多聚甲醛于37 ℃固定15 min；以PBS漂洗 3次，每次3 min；Hoechst 33342室溫染核15 min；以PBS漂洗3次，每次3 min；利用激光共聚焦顯微鏡觀察融合蛋白表達(dá)及其細(xì)胞定位。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

利用McMaster Biophotonics Facility ImageJ軟件的 Plot Profile插件進(jìn)行細(xì)胞切面熒光強(qiáng)度分析；利用Colocalization Finder插件進(jìn)行共定位定量分析，共定位比率采用皮爾遜相關(guān)系數(shù)分析[18-19]。利用SPSS Statistics 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 ORF3蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中

圖1 EGFP-ORF3融合蛋白的細(xì)胞定位分析Fig. 1 Localization of EGFP-ORF3. (A) Single-channel fluorescence image. (B) Fluorescence intensity analysis of the cell section in the figure A. (C) Multi-channel superimposed fluorescence images (200×). (D) Quantitative analysis of co-localization ratio of expressed proteins with nuclei in Figure C. The Pearson correlation coefficient is used for the co-localization ratio. * P<0.05.

將PEDV DR13wtorf3基因克隆至pEGFP-C1，通過EGFP熒光觀察ORF3蛋白在Vero細(xì)胞中定位。結(jié)果顯示，與EGFP蛋白分布于整個(gè)細(xì)胞 (細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核) 中不同，EGFP-ORF3位于靠近細(xì)胞核的細(xì)胞質(zhì)中 (圖 1A)。細(xì)胞切面熒光強(qiáng)度分析[18]也顯示EGFP蛋白的熒光峰與核的熒光強(qiáng)度峰完全重疊，而融合蛋白 EGFP-ORF3熒光信號(hào)幾乎不與細(xì)胞核熒光信號(hào)重疊 (圖1B)。為了進(jìn)一步分析 ORF3蛋白的細(xì)胞內(nèi)定位情況，我們分析了同一視野范圍內(nèi)所有陽性細(xì)胞中 EGFP蛋白和EGFP-DR13wtORF3融合蛋白與細(xì)胞核共定位比率[18-19](圖1C)，結(jié)果表明EGFP蛋白和融合蛋白EGFP-DR13wtORF3的綠色熒光與細(xì)胞核(DAPI)的藍(lán)色熒光共定位比率分別為 0.75和 0.1，兩者差異顯著 (圖1D)。上述結(jié)果表明PEDV ORF3蛋白位于細(xì)胞質(zhì)中。

2.2 PEDV DR13wt ORF3蛋白序列分析及跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

Wang等[12]預(yù)測(cè)PEDV CV777wtORF3蛋白包含 4 個(gè)預(yù)測(cè)跨膜域 (TM1 40–63 aa、TM2 75–91 aa、TM3 116–139 aa、TM4 150–173 aa)。PEDV DR13wtORF3蛋白和CV777wtORF3蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)顯示，兩者氨基酸序列相似度為97.32%，有6個(gè)氨基酸不同 (圖2)。TM1和TM3的氨基酸序列完全相同，在TM2、TM4分別有3個(gè)和1個(gè)氨基酸差異。

為了進(jìn)一步了解DR13wtORF3蛋白的結(jié)構(gòu)，使用 TMHMM 2.0分析預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè) DR13wtORF3蛋白、CV777wtORF3蛋白的跨膜域。如圖3所示，DR13wtORF3蛋白與CV777wtORF3蛋白預(yù)測(cè)的跨膜域完全一致，都僅有2個(gè)預(yù)測(cè)跨膜域TM1 41–63 aa和 TM2 76–98 aa。

2.3 ORF3蛋白的40–91aa是其定位于細(xì)胞質(zhì)中的關(guān)鍵基序

圖2 PEDV DR13wt和CV777wt ORF3蛋白氨基酸序列比較Fig. 2 Amino acid sequence alignment of ORF3 proteins of PEDV DR13wt and CV777wt. The predicted transmembrane domains were shaded gray; differential amino acids were in the bold red.

首先參照Wang等預(yù)測(cè)的4個(gè)跨膜域信息將DR13wtORF3蛋白分成兩段：包含4個(gè)跨膜域的ORF31–173和 ORF3174–225。分別構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒 pEGFP-ORF31–173和 pEGFP-ORF3174–225，轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞。激光共聚焦結(jié)果顯示 EGFPORF3174–225融合蛋白在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均存在，而 EGFP-ORF31–173僅存在于細(xì)胞質(zhì)中 (圖 4)，表明ORF31–173中存在影響ORF3定位于細(xì)胞質(zhì)中的關(guān)鍵序列。

圖3 利用TMHMM2.0軟件預(yù)測(cè)PEDV ORF3蛋白跨膜域Fig. 3 Schematic representation of the predicted transmembrane topology with TMHMM Server version 2.0 of PEDV ORF3 protein.

圖4 EGFP-ORF31–173和 EGFP-ORF3174–225在 Vero 細(xì)胞中定位。Fig. 4 Localization of EGFP-ORF31–173 and EGFP-ORF3174–225 in Vero cells. The arrows indicate the nuclei.

為了確定 ORF3的細(xì)胞質(zhì)定位信號(hào)，將ORF31–173分為兩段：包含Wang等預(yù)測(cè)前兩個(gè)跨膜域的 ORF31–91和 ORF392–173。結(jié)果顯示，EGFP-ORF392–173融合蛋白存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，而 EGFP-ORF31–91融合蛋白僅存在于細(xì)胞質(zhì)中(圖 5)，表明 ORF31–91中存在 ORF3細(xì)胞質(zhì)定位信號(hào)。

隨后，將 ORF31–91分為預(yù)測(cè)胞外區(qū) ORF31–39和包含了兩個(gè)預(yù)測(cè)跨膜域的ORF340–91。構(gòu)建相應(yīng)的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染 Vero細(xì)胞。結(jié)果顯示EGFP-ORF31–39融合蛋白分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，而 EGFP-ORF340–91僅分布在細(xì)胞質(zhì)中(圖 6)，說明ORF340-91中存在影響ORF3定位于細(xì)胞質(zhì)的關(guān)鍵序列。

圖5 EGFP-ORF31–91和 EGFP-ORF392–173在 Vero 細(xì)胞中的定位Fig. 5 Localization of EGFP-ORF31–91 and EGFP-ORF392–173 in Vero cells. The arrows indicate the nuclei.

圖6 EGFP-ORF31–39和 EGFP-ORF340–91在 Vero 細(xì)胞中的定位Fig. 6 Localization of EGFP- ORF31–39 and EGFP-ORF340–91 in Vero cells. The arrows indicate the nuclei.

2.4 ORF340–91的3 個(gè)結(jié)構(gòu)域40–63 aa、64–74 aa 和75–91 aa單獨(dú)或兩兩組合均不能定位于細(xì)胞質(zhì)中

為了進(jìn)一步確定影響 ORF3蛋白定位的最小基序，分別將ORF3蛋白第一跨膜域ORF340–63、胞內(nèi)區(qū) ORF364–74和第二跨膜域 ORF375–91的編碼DNA克隆至pEGFP-C1， 并分別轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞。激光共聚焦顯微鏡分析顯示表達(dá)的融合蛋白EGFP-ORF340–63、 EGFP-ORF364–74、 EGFPORF375–91均位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中 (圖7)，表明這3個(gè)多肽片段不能單獨(dú)定位于細(xì)胞質(zhì)中。

圖7 EGFP- ORF340–63、EGFP-ORF364–74和 EGFP-ORF375–91在 Vero 細(xì)胞中定位Fig. 7 Localization of EGFP-ORF340–63, EGFP-ORF364–74 and EGFP-ORF375–91 in Vero cells. The arrows indicate the nuclei.

將 ORF340–91包含的 3個(gè)結(jié)構(gòu)域分別兩兩組合，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒 pEGFP-ORF340–74、pEGFP-ORF364–91和 pEGFP-ORF340–63+5SG+75–91，轉(zhuǎn)染 Vero細(xì)胞并觀察他們的細(xì)胞內(nèi)定位。在ORF3的2個(gè)跨膜域40–63 aa和75–91 aa中間插入5對(duì)Ser-Gly的linker片段 (SGSGSGSGSG) 替代其胞內(nèi)區(qū)以有利于跨膜域的形成。激光共聚焦顯微鏡分析結(jié)果顯示表達(dá)的 EGFP-ORF340–74、EGFP-ORF364–91和 EGFP-ORF340–63+5SG+75–91在細(xì)胞定位沒有明顯差異，均分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中 (圖 8)，表明 ORF340–91包含的 3個(gè)結(jié)構(gòu)域的兩兩組合也不能定位到細(xì)胞質(zhì)中。

2.5 ORF340–91中 66RR67的基序不是其細(xì)胞質(zhì)定位信號(hào)

我們對(duì) ORF340–91序列分析比對(duì)發(fā)現(xiàn)其胞內(nèi)區(qū)的存在66RR67雙精氨酸結(jié)構(gòu)。有研究證實(shí)雙精氨酸結(jié)構(gòu)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)[20-21]，為了驗(yàn)證66RR67是否為 ORF340–91的細(xì)胞質(zhì)定位信號(hào)，將pEGFP-ORF340–91的雙精氨酸密碼子分別突變?yōu)榉菢O性的丙氨酸 (GCG) (中性)、極性的甘氨酸(GGC) (中性)、帶正電荷的組氨酸 (CAT) (堿性)和帶負(fù)電荷的谷氨酸 (GAG) (酸性)。結(jié)果顯示突變前后的融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布沒有明顯的差異 (圖 9)，表明66RR67不是 ORF340–91的細(xì)胞質(zhì)定位信號(hào)。

2.6 ORF3? 40–91分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中

圖8 EGFP-ORF340–74、EGFP-ORF364–91和 EGFP-ORF340–63+5SG+75–91在 Vero 細(xì)胞中的定位Fig. 8 Localization of EGFP-ORF340–74, EGFP-ORF364–91 and EGFP-ORF340–63+5SG+75–91 in Vero cells. The arrows indicate the nuclei.

圖9 EGFP-ORF340–91(AA)、EGFP-ORF340–91(GG)、EGFP-ORF340–91(HH)和 EGFP-ORF340–91(EE)在 Vero 細(xì)胞中的定位Fig. 9 Localization of EGFP-ORF340–91(AA), EGFP-ORF340–91(GG), EGFP-ORF340–91(HH)and EGFP-ORF340–91(EE) in Vero cells. The arrows indicate the nuclei.

為進(jìn)一步驗(yàn)證ORF340–91是PEDV ORF3細(xì)胞質(zhì)定位的關(guān)鍵序列，我們構(gòu)建敲除 40–91 aa片段的EGFP-ORF3?40–91表達(dá)載體 pEGFP-ORF3?40–91，并轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞。激光共聚焦分析顯示，與EGFPORF340–91僅定位于細(xì)胞質(zhì)中不同，EGFPORF3?40–91融合蛋白分布在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中(圖 10A)，與 EGFP蛋白的細(xì)胞內(nèi)分布相似 (圖1A)。細(xì)胞切面熒光強(qiáng)度分析顯示EGFP-ORF340–91融合蛋白的熒光強(qiáng)度峰集中在細(xì)胞質(zhì)中 (圖10B)，與EGFP-ORF3的細(xì)胞定位相似 (圖1B)；而 EGFP-ORF3?40–91融合蛋白的熒光強(qiáng)度峰與細(xì)胞核的熒光強(qiáng)度峰幾乎完全重疊 (圖10B)，表明其與細(xì)胞核共定位。對(duì)同一視野范圍內(nèi)所有陽性細(xì)胞中表達(dá)的融合蛋白與細(xì)胞核共定位比率統(tǒng)計(jì)分析顯示 EGFP-ORF340–91和 EGFP-ORF3?40–91的綠色熒光與細(xì)胞核 (DAPI) 的藍(lán)色熒光共定位比率平均值分別為0.1和0.65，具有顯著性差異 (圖10C、10D)。綜合上述結(jié)果，證實(shí)40–91aa序列是PEDV ORF3蛋白的細(xì)胞質(zhì)定位結(jié)構(gòu)域。

3 討論

由于缺乏有效的疫苗，PED依然是影響全球(特別是亞洲國家) 生豬產(chǎn)業(yè)的重要疫病之一。與其他冠狀病毒常編碼多個(gè)輔助蛋白不同，PEDV僅編碼一個(gè)輔助蛋白ORF3。研究表明ORF3蛋白與PEDV的毒力有關(guān)[22]，ORF3蛋白可以通過多種方式影響PEDV的增殖[12,16,23]。雖然在不同細(xì)胞中表達(dá)的攜帶不同標(biāo)簽的ORF3蛋白均分布在細(xì)胞質(zhì)中[13-15]，然而對(duì)于ORF3的細(xì)胞質(zhì)定位信號(hào)或關(guān)鍵氨基酸基序目前仍不清楚。為此，本研究采用可以自由進(jìn)入細(xì)胞核的EGFP作為標(biāo)記鑒定 ORF3蛋白的細(xì)胞質(zhì)定位標(biāo)簽，發(fā)現(xiàn)包含兩個(gè)跨膜域的40–91 aa片段是ORF3蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。

Zou等[15]通過預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)PEDV CV777 ORF3蛋白是包含4個(gè)預(yù)測(cè)跨膜域的II類跨膜蛋白，這與Wang等[12]之前的預(yù)測(cè)結(jié)果一致。我們使用TMHMM 2.0重新在線預(yù)測(cè)PEDV DR13wt和CV777wtORF3蛋白跨膜域，結(jié)果顯示二者具有相似的結(jié)構(gòu)特性，均包含5段疏水區(qū)。與前期的預(yù)測(cè)結(jié)果不同的是，軟件僅認(rèn)為前2個(gè)輸水區(qū)可形成2個(gè)跨膜域。造成預(yù)測(cè)結(jié)果與報(bào)道有差異的原因可能與我們采用的升級(jí)版TMHMM 2.0軟件的算法中界定跨膜域的界限值提高有關(guān)。當(dāng)然，DR13wtORF3跨膜域的確定還有待于實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本研究中鑒定到的PEDV ORF3 的細(xì)胞質(zhì)定位關(guān)鍵基序40–91 aa正好包含了預(yù)測(cè)的2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域及其中間的預(yù)測(cè)的胞內(nèi)域，而且2個(gè)跨膜域中任何一個(gè)跨膜域的缺失都將使其細(xì)胞質(zhì)定位能力，顯示ORF3的細(xì)胞質(zhì)定位需要2個(gè)跨膜域的同時(shí)存在。姜普等[21]報(bào)道跨膜結(jié)構(gòu)域是一類很重要內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)。如 Ryanonine受體的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位需要其第1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和第4個(gè)跨膜區(qū)同時(shí)起協(xié)同作用[20]。因此我們推測(cè)PEDV ORF3也通過 2個(gè)跨膜域定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上而位于細(xì)胞質(zhì)中。雖然我們選擇以親水性、低電荷效應(yīng)的Gly-Ser組合5SG替換ORF340–91的胞內(nèi)區(qū)，但替換后的EGFP-ORF375–91不再具有的細(xì)胞質(zhì)定位能力，顯示胞內(nèi)區(qū)64–74 aa與2個(gè)跨膜域在ORF3的細(xì)胞質(zhì)定位過程中協(xié)同發(fā)揮作用。當(dāng)然我們也不能排除5SG替換通過影響1個(gè)或2個(gè)跨膜域的正確折疊而影響了 EGFP-ORF375–91的細(xì)胞質(zhì)定位。

圖10 EGFP-ORF340–91和 EGFP-ORF3?40–91在 Vero 細(xì)胞中的定位Fig. 10 Localization of EGFP-ORF340–91 and EGFP-ORF3?40–91 in Vero cells. (A) Single-channel fluorescence image.(B) Fluorescence intensity analysis of the cell section in the figure A. (C) Multi-channel superimposed fluorescence images (200×). (D) Quantitative analysis of co-localization ratio of the expressed proteins with nuclei in Figure C. The Pearson correlation coefficient is used for the co-localization ratio.

PEDV ORF3蛋白的胞內(nèi)區(qū)64–75 aa存在1個(gè)66RR67雙精氨酸基序。Scott等[24]在對(duì)蛋白質(zhì)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)研究中發(fā)現(xiàn)雙精氨酸基序?yàn)椴糠值鞍椎膬?nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)。因此，本研究對(duì)EGFP-ORF340–91上的雙精氨酸位點(diǎn)進(jìn)行突變，發(fā)現(xiàn)非極性 (丙氨酸) 和極性 (甘氨酸、組氨酸、谷氨酸) 氨基酸的替換均對(duì)突變后的融合蛋白的細(xì)胞定位沒有影響，說明66RR67雙精氨酸不是影響ORF3蛋白細(xì)胞質(zhì)定位的關(guān)鍵基序。

目前，關(guān)于PEDV ORF3蛋白的亞細(xì)胞定位還沒有定論。有研究報(bào)道，ORF3蛋白在表達(dá)的初期分布在細(xì)胞質(zhì)中，隨著時(shí)間的延長逐漸在細(xì)胞質(zhì)中聚集為點(diǎn)狀[13,15]。但也有報(bào)道 ORF3蛋白在細(xì)胞質(zhì)中彌散、均勻分布[14,17]。本研究也發(fā)現(xiàn)EGFP-ORF3表達(dá)融合蛋白早期均勻分布在細(xì)胞質(zhì)中，后期有聚集趨勢(shì)?？傊?，本研究證實(shí)40–91 aa是 ORF3蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。該研究結(jié)果將為 ORF3細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的揭示及其功能研究奠定重要的前期基礎(chǔ)。