甲酸生物利用的研究進(jìn)展

徐蓉，鄧王姝穎，姜衛(wèi)紅，顧陽(yáng)

1 中國(guó)科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心 植物生理生態(tài)研究所 合成生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032

2 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100039

傳統(tǒng)工業(yè)微生物發(fā)酵主要以糖基類原料作為碳源，未來的發(fā)展趨勢(shì)是采用更為廉價(jià)的碳資源以提高生物制造路線的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。一碳原料來源豐富、價(jià)格低廉，是良好的代糖原料。甲酸是主要的有機(jī)一碳化合物，也是重要的化工原料，來源廣泛，如二氧化碳 (CO2) 的電化學(xué)還原[1-2]、CO2的氫化[3-4]、生物質(zhì)的選擇性氧化[5-6]、天然氣的部分氧化、天然氣和合成氣的水合作用等[7]?，F(xiàn)階段，工業(yè)上通常采用電解水[8]或水煤氣變換技術(shù)[9]將CO2和氫氣轉(zhuǎn)化為甲酸 (圖1)。近年來，受下游制造行業(yè)需求波動(dòng)的影響，甲酸生產(chǎn)經(jīng)常面臨產(chǎn)能過剩的問題，因此，亟待發(fā)展新的甲酸利用技術(shù)來實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)鏈的拓展和延伸。

如上所述，在化工生產(chǎn)過程中，甲酸可由CO2直接還原獲得。同時(shí)，甲酸又是一種可被甲基營(yíng)養(yǎng)菌利用的有機(jī)一碳化合物[10]。因此，構(gòu)建以甲酸為發(fā)酵原料的微生物細(xì)胞工廠并用于合成各類化學(xué)品可有效聯(lián)結(jié)化工生產(chǎn)和生物制造兩大技術(shù)領(lǐng)域，從而有望解決甲酸產(chǎn)能過剩問題以及實(shí)現(xiàn)工業(yè)微生物發(fā)酵原料替代、降低制造成本的目標(biāo)。

圖1 甲酸生產(chǎn)及生物利用 (甲酸可以通過 CO2電化學(xué)還原、CO2氫化、生物質(zhì)的選擇性氧化、天然氣部分氧化等方式生產(chǎn)，進(jìn)而由天然或人工生物轉(zhuǎn)化途徑實(shí)現(xiàn)利用)Fig. 1 Production and bioutilization of formic acid.Formic acid is produced by electrochemical reduction or hydrogenation of CO2, selective oxidation of biomass,and partial oxidation of natural gas; then, formic acid can be further utilized via natural or artificial biological processes.

1 天然甲酸同化途徑

甲酸的生物利用方式可主要?dú)w結(jié)為兩類反應(yīng)：1) 甲酸氧化為CO2，從而為微生物的生長(zhǎng)提供還原力[11]。由于還原電勢(shì)較低[12]，甲酸是一種理想的電子供體。不足之處是，甲酸被氧化為CO2釋放后，其碳原子本質(zhì)上并沒有被微生物同化吸收，造成代謝過程中的碳損失。2) 甲酸同化，即生物體內(nèi)的甲酸與另一種代謝中間體縮合形成新的產(chǎn)物。該過程主要包含兩種反應(yīng)方式：甲酸和四氫葉酸經(jīng)甲酸-四氫葉酸連接酶(Formatetetrahydrofolate ligase，F(xiàn)TL)催化合成甲酰-四氫葉酸(10-formyl-THF)；或者甲酸和乙酰輔酶 A經(jīng)丙酮酸-甲酸裂合酶 (Pyruvate formate-lyase，PFL)催化合成丙酮酸 (圖2)。

圖2 主要的甲酸同化反應(yīng) (FTL: 甲酸-四氫葉酸連接酶；PFL: 丙酮酸-甲酸裂合酶)Fig. 2 The major formate-assimilating reactions. FTL:formate tetrahydrofolate ligase; PFL: pyruvate formate-lyase.

PFL(EC 2.3.1.54) 是一類對(duì)氧敏感的丙酮酸-甲酸裂合酶蛋白家族的成員。通常情況下，在生物體內(nèi)該酶能夠催化丙酮酸和輔酶A生成甲酸和乙酰輔酶A，并且該過程能夠產(chǎn)生ATP分子[13]。而這一反應(yīng)的逆過程可實(shí)現(xiàn)甲酸同化。但需要指出的是，盡管研究者已經(jīng)通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明了 PFL可以催化上述逆反應(yīng)過程[14-15]，但在生物體內(nèi)該酶催化甲酸同化的效率較低[15]，有待進(jìn)一步優(yōu)化。因此，目前已知的生物體內(nèi)的甲酸同化主要是基于 FTL催化的絲氨酸循環(huán)、還原性乙酰輔酶 A途徑以及還原性甘氨酸途徑實(shí)現(xiàn)。例如，甲基桿菌和產(chǎn)乙酸菌能夠分別通過絲氨酸循環(huán)和還原性乙酰輔酶 A途徑利用甲酸作為碳源生長(zhǎng)。此外，基于 FTL的甲酸同化途徑以及催化后續(xù)反應(yīng)的還原性甘氨酸途徑也被引入大腸桿菌中用于實(shí)現(xiàn)甲酸利用，但所構(gòu)建的工程菌需補(bǔ)充除甲酸以外的其他有機(jī)碳源才能正常生長(zhǎng)[16]。

1.1 絲氨酸循環(huán)

絲氨酸循環(huán)是一種 ATP消耗較多的甲酸代謝途徑。如圖3所示，甲酸通過多步催化反應(yīng)首先生成活性中間體——甲基四氫葉酸(Methylene-THF)；甲基四氫葉酸將其一碳單元轉(zhuǎn)移至甘氨酸從而生成絲氨酸，并經(jīng)后續(xù)多步催化被依次轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇丙酮酸 (Phosphoenolpyruvate)、草酰乙酸 (Oxaloacetate)、蘋果酸 (Malate) 等重要中間體；蘋果酸則與輔酶A反應(yīng)生成蘋果酰輔酶A，再進(jìn)一步生成乙酰輔酶A。乙酰輔酶A作為中心代謝物可進(jìn)入后續(xù)各類代謝途徑中，支持微生物生長(zhǎng)及相關(guān)產(chǎn)物的合成。

許多甲基營(yíng)養(yǎng)菌 (例如扭脫甲基桿菌Methylobacterium extorquensAM1) 可通過絲氨酸循環(huán)來代謝利用甲酸，具有潛在工業(yè)應(yīng)用價(jià)值[17]。Kim等在大腸桿菌中構(gòu)建了甲酸同化、絲氨酸合成以及轉(zhuǎn)化為磷酸甘油酸 (Phosphoglyceric acid)的人工途徑，并結(jié)合適應(yīng)性進(jìn)化的策略實(shí)現(xiàn)了工程菌利用甲酸合成乙醇的目標(biāo)[18]。然而，絲氨酸循環(huán)與中心代謝有較多重疊 (草酰乙酸、蘋果酸都是重要的中心代謝物)，因而在對(duì)該代謝途徑進(jìn)行人工設(shè)計(jì)和改造時(shí)需要更多地考慮如何減少對(duì)中心代謝途徑的擾動(dòng)。此外，絲氨酸循環(huán)生成一分子乙酰輔酶A理論上需要消耗3分子NAD(P)H和 2分子 ATP[10]，還原力和 ATP消耗較多，因此不被認(rèn)為是實(shí)現(xiàn)甲酸高效生物利用的首選路徑。因此，Liao研究組改造了天然的絲氨酸循環(huán)用于大腸桿菌的甲酸同化；他們通過引入絲氨酸脫水酶實(shí)現(xiàn)絲氨酸一步生成丙酮酸。相比于天然的絲氨酸循環(huán)，新途徑反應(yīng)步驟較少，且消除了影響甲酸同化效率的潛在主要副反應(yīng)[19]。

圖3 絲氨酸循環(huán)Fig. 3 Serine cycle.

1.2 還原性乙酰輔酶A途徑

還原性乙酰輔酶 A途徑 (通常又被稱為Wood-Ljungdahl途徑) 是一種反應(yīng)步驟少、能量消耗低的甲酸同化代謝途徑 (圖 4)。該途徑代謝一分子甲酸理論上僅需要消耗1分子ATP、2分子NAD(P)H[10]。但由于途徑中的一些關(guān)鍵酶對(duì)氧敏感，因而主要存在于厭氧微生物中。如圖4所示，甲酸經(jīng)由該途徑代謝時(shí)，首先與四氫葉酸(THF) 經(jīng)FTL催化后生成10-甲酰-四氫葉酸，繼而經(jīng)多步催化反應(yīng)后生成 5-甲基-四氫葉酸(5-methyl-THF)。5-甲基-四氫葉酸的一碳單位與輔酶A以及CO基團(tuán)在乙酰輔酶A合酶的催化下生成乙酰輔酶 A。在整個(gè)反應(yīng)過程中，每生成1分子乙酰輔酶 A消耗4個(gè)甲酸分子 (1個(gè)被同化，3個(gè)提供NAD(P)H)[10]，原子經(jīng)濟(jì)性要優(yōu)于上述絲氨酸循環(huán)。

圖4 Wood-Ljungdahl途徑Fig. 4 Wood–Ljungdahl pathway.

目前，一些典型的產(chǎn)乙酸菌，如永達(dá)爾梭菌Clostridium ljungdahlii、伍氏醋酸桿菌Acetobacterium woodii等，已被報(bào)道可以通過還原乙酰輔酶A途徑以甲酸作為碳源進(jìn)行生長(zhǎng)和代謝[20]。但這些微生物的產(chǎn)物種類較為有限 (乙酸和乙醇為主)，并且與大腸桿菌和釀酒酵母等模式微生物相比，遺傳改造相對(duì)困難，因此限制了工程菌的開發(fā)進(jìn)度，其甲酸利用效率距離實(shí)際工業(yè)應(yīng)用尚有較大差距[21]。近年來，針對(duì)這些難改造微生物的分子遺傳操作技術(shù)取得了一定的進(jìn)展[22]，使得人工設(shè)計(jì)和重構(gòu)胞內(nèi)還原性乙酰輔酶A途徑以及相關(guān)代謝網(wǎng)絡(luò)成為可能。作者所在的課題組近期也陸續(xù)建立了重要自養(yǎng)型產(chǎn)乙酸菌C. ljungdahlii的一系列新型分子遺傳操作技術(shù)[23-24]，實(shí)現(xiàn)了高效的基因組編輯，為后續(xù)優(yōu)化該菌的甲酸代謝途徑以及合成目標(biāo)產(chǎn)物提供了技術(shù)保證。

1.3 還原性甘氨酸途徑

還原性甘氨酸途徑在生物體內(nèi)多種氨基酸和嘌呤代謝中發(fā)揮作用[25-26]。甲酸經(jīng)由該途徑代謝時(shí)涉及的一個(gè)關(guān)鍵功能模塊是甘氨酸裂解系統(tǒng)(Glycine cleavage system，GCS)。甘氨酸裂解系統(tǒng)是生物體響應(yīng)體內(nèi)甘氨酸濃度變化并調(diào)節(jié)甘氨酸代謝平衡的主要模塊[27]，其催化的甘氨酸代謝是一個(gè)可逆的過程，即存在“裂解”和“合成”兩個(gè)方向。如圖 5所示，“裂解”反應(yīng)是甘氨酸和絲氨酸分解代謝的主要途徑，形成的5,10-亞甲基四氫葉酸 (5,10-methylene-THF) 是生物體重要的一碳單位，也是核苷酸合成的重要原料；“合成”反應(yīng)則與之相反，催化5,10-亞甲基四氫葉酸結(jié)合1分子CO2和NH3形成甘氨酸，繼而形成絲氨酸進(jìn)入中心代謝途徑。顯然，沿“合成”反應(yīng)方向運(yùn)行，甲酸可被代謝并最終生成丙酮酸。與還原性乙酰輔酶A途徑不同，還原性甘氨酸途徑中沒有對(duì)氧敏感的酶，且大多數(shù)酶在生物體內(nèi)普遍存在。此外，該代謝途徑與中心代謝途徑的重疊部分較少。因此，在生物體內(nèi)引入或改造該途徑可有效減少對(duì)原有代謝網(wǎng)絡(luò)的干擾。

圖5 還原甘氨酸途徑Fig. 5 Reductive glycine pathway.

上述甘氨酸裂解系統(tǒng)已被證明在體外和體內(nèi)均有催化甘氨酸生成的功能，也被認(rèn)為是許多原核生物中甘氨酸的唯一來源[27]。但當(dāng)研究者在大腸桿菌中重構(gòu)還原性甘氨酸途徑以實(shí)現(xiàn)菌株代謝利用甲酸時(shí)發(fā)現(xiàn)，該途徑的引入不足以支持宿主菌以甲酸為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)，在發(fā)酵前期仍需添加少量的葡萄糖[28]。因此，目前看來，甲酸通過還原性甘氨酸途徑代謝的整個(gè)通路仍不暢通，加之能量供應(yīng)不足，無法有效合成丙酮酸來支持宿主菌的生長(zhǎng)，后續(xù)需要對(duì)還原性甘氨酸途徑以及胞內(nèi)能量代謝體系進(jìn)一步優(yōu)化，消除或減少甲酸代謝時(shí)對(duì)其他有機(jī)碳源的依賴。在此方面，適應(yīng)性進(jìn)化是值得重點(diǎn)考慮的策略之一，并已經(jīng)在優(yōu)化大腸桿菌還原性甘氨酸途徑的反應(yīng)效率中發(fā)揮效果[29]。

2 非天然甲酸同化途徑

如上所述，天然甲基營(yíng)養(yǎng)菌的甲酸同化能力存在不足，加之遺傳改造較為困難，快速改變現(xiàn)狀的難度較大。作為替代方案，在一些易于遺傳改造的模式微生物中引入甲酸代謝途徑并實(shí)現(xiàn)甲酸高效利用是值得重點(diǎn)考慮的方向。

2.1 在微生物中構(gòu)建異源天然甲酸同化途徑

還原性甘氨酸途徑廣泛存在于微生物體內(nèi)，并且ATP消耗低，對(duì)氧不敏感，因此適合導(dǎo)入模式微生物中用于甲酸同化。Yishai等首次提出了在大腸桿菌中構(gòu)建還原性甘氨酸途徑以實(shí)現(xiàn)工程菌利用甲酸作為碳源生長(zhǎng)的策略[10]。之后，該研究組又通過整合來自扭脫甲基桿菌的甲基四氫葉酸連接酶、5,10-亞甲基-四氫葉酸-環(huán)化水解酶和5,10-亞甲基-THF脫氫酶以及過表達(dá)甘氨酸裂解系統(tǒng)的4種蛋白質(zhì) (H蛋白、T蛋白、P蛋白和L蛋白) 實(shí)現(xiàn)了甲酸代謝合成甘氨酸和絲氨酸；同時(shí)，研究者還引入甲酸脫氫酶 (FDH) 來優(yōu)化胞內(nèi)的還原力供給，以及敲除若干旁路的代謝酶，最終實(shí)現(xiàn)大腸桿菌工程菌共利用甲酸和CO2進(jìn)行生長(zhǎng)[30]。該研究組也在甘氨酸缺陷型的釀酒酵母中構(gòu)建了還原性甘氨酸途徑，通過13C同位素示蹤實(shí)驗(yàn)證明了該菌株生成的甘氨酸全部來自于甲酸，但并未實(shí)現(xiàn)甲酸的高效利用[31]。Lee研究組也嘗試在大腸桿菌中構(gòu)建還原性甘氨酸途徑以實(shí)現(xiàn)大腸桿菌對(duì)甲酸的利用；他們通過引入M. extorquens的甲基四氫葉酸連接酶、5,10-亞甲基四氫葉酸-THF環(huán)化水解酶、5,10-亞甲基-THF脫氫酶和過量表達(dá)催化甘氨酸裂解反應(yīng)的基因gcvTHP以及敲除該裂解反應(yīng)的抑制基因gcvR，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)甘氨酸的高效合成；最后，再通過引入了甲酸脫氫酶(FDH)優(yōu)化胞內(nèi)的還原力供給，實(shí)現(xiàn)大腸桿菌工程菌能夠利用甲酸和CO2維持基本生長(zhǎng)[28]。

與還原性甘氨酸途徑類似，還原性乙酰輔酶A途徑 (Wood-Ljungdahl途徑) 是已知的反應(yīng)步驟少、ATP消耗少的一種天然甲酸同化途徑。有研究者嘗試在丙酮丁醇梭菌中異源表達(dá)該途徑所有酶及輔因子，但發(fā)現(xiàn)其中的一氧化碳脫氫酶/乙酰輔酶A合酶復(fù)合物在丙酮丁醇梭菌中的活性很低，使得該途徑無法發(fā)揮作用[32]。因此，該途徑的異源表達(dá)目前仍然存在一些難點(diǎn)有待克服。

雖然甲酸同化途徑——還原性甘氨酸途徑已在大腸桿菌和釀酒酵母中構(gòu)建成功并被證明可以發(fā)揮作用，但依然存在反應(yīng)步驟多、能量需求大、甲酸利用率低等不足，造成需要額外補(bǔ)充其他碳源供菌體代謝利用。因此，設(shè)計(jì)全新的甲酸代謝途徑來克服上述缺陷是值得考慮的策略，同時(shí)也是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的工作。

2.2 設(shè)計(jì)新的甲酸同化途徑

2.2.1 甲酸-甲醛途徑

與甲酸相比，甲醛是一種高活性化合物，更容易作為前體物質(zhì)被代謝途徑所吸收。甲酸轉(zhuǎn)化為甲醛有多種策略，一種是將甲酸一步還原成甲醛 (圖6)。Singh等[33]在多噬伯克霍爾德氏菌BurkholderiaMultivorans中發(fā)現(xiàn)了能夠高效催化甲酸還原成甲醛的甲醛脫氫酶 (BmFaldDH)，甲酸通過該酶可以催化生成甲醛。另一種策略是通過兩步反應(yīng)催化甲酸還原為甲醛 (圖 6)。大腸桿菌或Pyrobaculum aerophilum來源的乙酰輔酶A合酶能夠催化甲酸與輔酶A結(jié)合生成甲酰輔酶A[34-35]。甲酰輔酶A則可以被乙?；囊胰┟摎涿复呋杉兹?。但是，天然的甲酰輔酶A合酶的反應(yīng)速率較慢，可能成為催化過程的一個(gè)限速步驟[36-37]。當(dāng)甲酸轉(zhuǎn)化為甲醛后，后續(xù)的甲醛代謝可考慮通過單磷酸核酮糖途徑(Ribulose monophosphate pathway，RuMP)來催化完成 (圖6)，從而徹底打通甲酸代謝途徑。

此外，甲醛對(duì)微生物的毒性也是構(gòu)建這一新途徑時(shí)需要考慮的問題[38]。在發(fā)酵過程中采用低速流加甲酸的策略可以控制細(xì)胞內(nèi)甲醛的合成量，從而部分地解決上述問題，但這可能會(huì)限制發(fā)酵強(qiáng)度。從菌株遺傳改造的角度考慮，如引入某些解毒機(jī)制[39]，來提高對(duì)甲醛的耐受能力是值得考慮的另一個(gè)方面。但解毒機(jī)制的引入也可能會(huì)造成甲醛的損耗，降低碳利用率，這就需要在設(shè)計(jì)改造策略時(shí)綜合平衡。

圖6 甲酸代謝途徑的人工設(shè)計(jì) (左側(cè)：甲酸被還原為甲醛，進(jìn)而催化生成乙酰輔酶A；右側(cè)：甲酸被催化形成甲酰輔酶A以進(jìn)入代謝)Fig. 6 Artificial formate-assimilating pathways. Left: formic acid is reduced to formaldehyde and further converted to acetyl-CoA; Right: formic acid is converted to formyl-CoA.

研究人員已在大腸桿菌中利用RuMP實(shí)現(xiàn)了甲醛同化，即在阻斷木糖代謝中間產(chǎn)物5-磷酸核酮糖的下游代謝途徑的基礎(chǔ)上，同時(shí)引入單磷酸核酮糖途徑來催化胞內(nèi)累積的5-磷酸核酮糖與外源添加的甲醛反應(yīng)生成6-磷酸己酮糖(3-hexulose-6-phosphate)，并繼而進(jìn)入中心代謝[40-41]。此外，江會(huì)鋒研究組基于化學(xué)合成原理，創(chuàng)建了一條從甲醛經(jīng)3步反應(yīng)合成乙酰輔酶A的新途徑(圖6)，即甲醛經(jīng)乙醇醛合酶縮合成乙醇醛(Glycolaldehyde)，乙醇醛經(jīng)乙酰磷酸合酶轉(zhuǎn)化為乙酰磷酸，最后乙酰磷酸通過磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶生成乙酰輔酶A[42]。這也是今后構(gòu)建人工甲酸同化途徑時(shí)值得考慮的策略。

2.2.2 甲酸-甲酰輔酶A-絲氨酸途徑

構(gòu)建新的甲酸同化途徑的另一個(gè)策略是將甲酸轉(zhuǎn)化為甲酰輔酶A，再構(gòu)建基于甲酰輔酶A 的下游代謝途徑 (圖 6)。前期研究表明，甲酸可直接與輔酶A反應(yīng)生成甲酰輔酶A[34-35]。由甲酸激活生成的甲酰輔酶A再與甘氨酸縮合生成氨丙酸半醛 (Aminomalonate semialdeyhde)[43-44]，之后氨丙酸半醛可以被多種酶(例如大腸桿菌的蘇氨酸脫氫)還原為絲氨酸。絲氨酸則可通過絲氨酸循環(huán)或絲氨酸-蘇氨酸循環(huán)生成重要中間體——乙酰輔酶A。

3 總結(jié)與展望

通過生物煉制將廉價(jià)碳資源轉(zhuǎn)化為高值化學(xué)品和燃料是未來綠色制造發(fā)展的重要方向。甲酸作為主要的有機(jī)一碳資源，來源廣泛，且可被微生物利用。大力發(fā)展甲酸生物利用技術(shù)，對(duì)于拓展現(xiàn)有甲酸下游產(chǎn)業(yè)鏈，提升市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力具有重要意義。

自然界中存在一些天然甲酸利用微生物(表1)，但甲酸利用能力不足。目前，研究者對(duì)天然甲酸利用微生物的遺傳改造仍不同程度地存在技術(shù)瓶頸，效率較低。因此，在易于改造的模式微生物中引入和構(gòu)建甲酸代謝途徑是值得考慮的重要方向。近年來，甲酸代謝途徑已被引入一些模式微生物中，并發(fā)揮了功能 (表1)。受限于宿主微生物原有的物質(zhì)和能量代謝體系及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，這些改造的工程菌尚無法實(shí)現(xiàn)對(duì)甲酸的高效利用和轉(zhuǎn)化。進(jìn)一步優(yōu)化底盤細(xì)胞，并設(shè)計(jì)新的、反應(yīng)步驟少、受宿主天然代謝及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)影響小的甲酸代謝途徑是解決上述問題的關(guān)鍵。

綜上，目前關(guān)于微生物代謝利用甲酸這一有機(jī)一碳資源的研究較少，且缺乏對(duì)代謝途徑以及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的全面、深入了解，從而無法有效實(shí)施對(duì)菌株的代謝工程設(shè)計(jì)和改造。許多重要問題，如微生物的甲酸毒性耐受機(jī)制、甲酸代謝過程的物質(zhì)和能量調(diào)控以及重塑策略等，都有待認(rèn)識(shí)和解答。此外，分子技術(shù)平臺(tái)的進(jìn)一步完善和優(yōu)化對(duì)于甲酸生物利用的基礎(chǔ)性以及應(yīng)用性研究均至關(guān)重要，這方面仍有極大的提升空間，值得我們?nèi)ヌ骄俊?/p>

表1 可利用甲酸的天然和人工微生物Table 1 Natural and artificial microorganisms capable of using formic acid