lncRNA RPL34-AS1通過(guò)靶向調(diào)控miR-575表達(dá)對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖和凋亡的影響

張敬 董杰 王秋桔 崔允巍 張輝

卵巢癌是女性常見惡性腫瘤，目前常用手術(shù)及輔助放化療的方法進(jìn)行治療，但因手術(shù)治療不徹底、癌細(xì)胞對(duì)化療藥物易產(chǎn)生耐藥性，使得患者治療效果及預(yù)后較差，隨著分子生物學(xué)、遺傳學(xué)及精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，針對(duì)卵巢癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制與分子靶向治療成為目前研究的熱點(diǎn)[1-2]。研究表明長(zhǎng)鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA，lncRNA）參與調(diào)控了卵巢癌的惡性生物學(xué)行為，可能與卵巢癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]。核糖體蛋白L34 反義RNA1（ribosomal protein L34 antisense RNA1，RPL34-AS1）是新型lncRNA，定位在人類4q25染色體上，已有研究表明RPL34-AS1在結(jié)腸癌中表達(dá)降低，其低表達(dá)與結(jié)腸癌預(yù)后不良相關(guān)[4]。RPL34-AS1在食管癌中也低表達(dá)，過(guò)表達(dá)RPL34-AS1 可通過(guò)下調(diào)RPL34表達(dá)抑制食道癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[5]。然而RPL34-AS1在卵巢癌細(xì)胞中的作用及其機(jī)制尚不清楚。研究表明微小RNA（microRNA，miRNA）也參與調(diào)控卵巢癌發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移、耐藥及復(fù)發(fā)等過(guò)程，與患者生存率密切相關(guān)[6]。研究發(fā)現(xiàn)miR-575在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中上調(diào)表達(dá)，促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖及侵襲[7]。miR-575在胃癌組織和細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)，其表達(dá)水平與腫瘤大小，美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（American Joint Committee on Cancer，AJCC）分期和預(yù)后相關(guān)，抑制miR-575表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[8]。而miR-575在卵巢癌中的作用及其對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響還尚未清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在研究RPL34-AS1 對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其機(jī)制是否與miR-575有關(guān)。

材料與方法

一、材料

1.卵巢癌細(xì)胞和來(lái)源：卵巢癌細(xì)胞株SKOV3購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。選取河北省衡水市婦幼保健院婦產(chǎn)科2017年1月至2019年1月收治的卵巢癌腫瘤患者為研究對(duì)象?；颊呒{入標(biāo)準(zhǔn)：病理學(xué)診斷為卵巢癌，所有患者腫瘤均為原發(fā)性腫瘤，術(shù)前未進(jìn)行過(guò)放化療及其他靶向治療，臨床病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并有其他器官、高血壓、糖尿病等慢性疾病，合并有其他惡性腫瘤等，患者為卵巢癌復(fù)發(fā)，存在家族腫瘤病史的，不同意提取組織標(biāo)本及病理資料不完整的。最終選取符合條件的20例患者，年齡為23～74歲，漿液性腺癌8例，黏液性腺癌4例，子宮內(nèi)膜樣腺癌10例,卵巢上皮細(xì)胞癌8例，病理分期Ⅰ期6例，Ⅱ期8例，Ⅲ期9例，Ⅳ期7例。通過(guò)手術(shù)切除癌組織及癌旁正常組織，其分別命名為卵巢癌組織和癌旁組織。本研究得到本院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)：20160412），且所有患者均知情且同意。

2.試劑和儀器：胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Sigma公司）；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒（日本Takara公司）；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Promega公司）；四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT）試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）和碘化丙錠（PI）試劑盒、二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒、RIPA蛋白裂解液（碧云天生物技術(shù)研究所）；抗體（上海煊翎生物科技有限公司）；載體質(zhì)粒（上海基屹生物科技有限公司）；Thermo FC酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀（美國(guó)Thermo公司）。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：卵巢癌細(xì)胞株SKOV3 用含10﹪胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37℃，5﹪ CO2的恒溫箱培養(yǎng)，每2天換液1次，細(xì)胞融合至80﹪左右時(shí)進(jìn)行消化傳代，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SKOV3細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基同步化12 h，將pcDNA、

pcDNA-RPL34-AS1、si-NC、si-RPL34-AS1、anti-miR-NC、anti-miR-575分別轉(zhuǎn)染至SKOV3胞中，記為pcDNA組、pcDNA-RPL34-AS1組、si-NC組、si-RPL34-AS1組、anti-miR-NC組、anti-miR-575組；將pcDNA-RPL34-AS1 與miR-NC、miR-575分別共轉(zhuǎn)染至SKOV3胞中，記為pcDNA-RPL34-AS1+miR-NC組、pcDNA-RPL34-AS1+miR-575組；轉(zhuǎn)染按照LipofectamineTM2000試劑盒進(jìn)行操作。正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照組。

3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time quantitative PCR，RT-qPCR）檢測(cè)RPL34-AS1和miR-575表達(dá)水平：癌旁組織、卵巢癌組織和培養(yǎng)48 h后的細(xì)胞提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，RPL34-AS1和miR-575分別以GAPDH和U6為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。循環(huán)條件為95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；60℃延長(zhǎng)5 min。相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算（表1）。

表1 引物序列信息

4.雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)RPL34-AS1對(duì)miR-575的靶向調(diào)控：構(gòu)建RPL34-AS1野生型和突變型熒光素酶表達(dá)載體WT-RPL34-AS1和MUT-RPL34-AS1，用LipofectamineTM2000試劑盒將WT-RPL34-AS1、MUT-RPL34-AS1質(zhì)粒分別和miR-NC和miR-575共轉(zhuǎn)染到SKOV3細(xì)胞。按照說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以熒光素酶活性和Renilla活性的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

5.MTT試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活性：各組細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個(gè)/mL，取100 μL 接種于96孔板，培養(yǎng)至24、48、72 h時(shí)，每孔分別加入20 μL的MTT溶液，在37℃培養(yǎng)4 h；吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，每孔加入后振蕩反應(yīng)15 min，用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔吸光度（OD）值。細(xì)胞活性（﹪）=實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對(duì)照組OD值×對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次3個(gè)復(fù)孔。

6.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后用不含EDTA的胰酶消化，離心收集細(xì)胞，PBS漂洗2次，加500 μL，結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。按照試劑盒說(shuō)明書，先后加入Annexin V-FITC和PI 避光孵育。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)488 nm和發(fā)射波長(zhǎng)530 nm處的熒光強(qiáng)度，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次3個(gè)復(fù)孔。

各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，并制備單細(xì)胞懸液，加入3 mL 預(yù)冷的70﹪乙醇固定，用PBS緩沖液洗滌后加入核糖核酸酶A（RNase A）于37℃水浴30 min，加入碘化啶（PI），避光30 min，上機(jī)檢測(cè)，重復(fù)3次，每次3個(gè)復(fù)孔。用流式細(xì)胞儀和DNA細(xì)胞周期分析軟件對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行檢測(cè)分析。

7.蛋白質(zhì)印跡（Western blot）檢測(cè)Cyclin D1、p21、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平：各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后提取細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒進(jìn)行定量。將蛋白樣品經(jīng)10﹪聚丙烯酰胺凝膠電泳轉(zhuǎn)移至PVDF上，用5﹪脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別加入相應(yīng)的一抗，4℃孵育過(guò)夜，PBS洗滌3次，每次5 min；再加入二抗，室溫孵育2 h，PBS洗滌3次，每次10min，后在暗室中曝光顯影，定影，將膠片用Quantity One分析各組蛋白條帶的灰度值，蛋白相對(duì)表達(dá)水平=目的條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次3個(gè)復(fù)孔。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。RPL34-AS1和miR-575的表達(dá)水平，蛋白表達(dá)水平，細(xì)胞OD值，細(xì)胞凋亡率，熒光素酶活性，各細(xì)胞周期占比，細(xì)胞百分比等均以表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、lncRNA RPL34-AS1和miR-575在卵巢癌組織中的表達(dá)

采用RT-qPCR檢測(cè)卵巢癌組織中l(wèi)ncRNA RPL34-AS1和miR-575的表達(dá)，結(jié)果顯示，與癌旁組織比較，卵巢癌組織中RPL34-AS1表達(dá)水平（1.00±0.08比0.47±0.05）降低，miR-575表達(dá)水平（1.01±0.07比3.12±0.28）升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 25.124、32.694，P均＜0.05）（圖1）。

二、lncRNA RPL34-AS1靶向調(diào)控miR-575的表達(dá)

LncBase 在線預(yù)測(cè)顯示RPL34-AS1 與miR-575存在結(jié)合位點(diǎn)（圖2）。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與miR-NC比較，miR-575 轉(zhuǎn)染RPL34-AS1野生型表達(dá)載體的SKOV3細(xì)胞的熒光素酶活性降低（P＜0.05，表2）；而轉(zhuǎn)染RPL34-AS1突變型表達(dá)載體的SKOV3細(xì)胞的熒光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與pcDNA組比較，pcDNA-RPL34-AS1組miR-575表達(dá)水平降低（1.01±0.09比0.42±0.04，P＜0.05）；與si-NC組比較，si-RPL34-AS1組miR-575表達(dá)水平升高（1.00±0.08比2.87±0.27，P＜0.05）。

圖1 lncRNA RPL34-AS1和miR-575在卵巢癌組織中的表達(dá)

圖2 RPL34-AS1的序列中含有與miR-575 互補(bǔ)的核苷酸序

表2 miR-NC組和miR-575組熒光素酶相對(duì)活性（±s，n = 3）

表2 miR-NC組和miR-575組熒光素酶相對(duì)活性（±s，n = 3）

注：n實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)

分組 WT-RPL34-AS1 MUT-RPL34-AS1 miR-NC組 0.99±0.08 0.97±0.09 miR-575組 0.36±0.04 0.98±0.07 t 值 21.130 0.263 P值＜0.001 0.795

三、lncRNA RPL34-AS1過(guò)表達(dá)對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖和凋亡的影響

與對(duì)照組和pcDNA組比較，pcDNA-RPL34-AS1組卵巢癌SKOV3細(xì)胞中RPL34-AS1表達(dá)水平升高；細(xì)胞活性降低，G1期細(xì)胞所占比例升高，S期細(xì)胞所占比例降低，細(xì)胞凋亡率升高，CyclinD1、Bcl-2表達(dá)水平降低，p21、Bax表達(dá)水平升高（P＜0.05）（圖3，表3～4）。

四、抑制RPL34-AS1表達(dá)對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖和凋亡的影響

與對(duì)照組和si-NC組比較，si-RPL34-AS1組卵巢癌SKOV3細(xì)胞中RPL34-AS1表達(dá)水平降低，細(xì)胞活性升高，G1期細(xì)胞所占比例降低，S期細(xì)胞所占比例升高，細(xì)胞凋亡率降低，CyclinD1、Bcl-2表達(dá)水平升高，p21、Bax表達(dá)水平降低（P＜0.05），各細(xì)胞周期所占比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）（圖4，表5～6）。

五、抑制miR-575表達(dá)對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖和凋亡的影響

與對(duì)照組和anti-miR-NC組比較，anti-miR-575組miR-575表達(dá)水平降低，細(xì)胞活性降低，G1期細(xì)胞所占比例升高，S期細(xì)胞所占比例降低，細(xì)胞凋亡率升高，CyclinD1、Bcl-2表達(dá)水平降低，p21、Bax表達(dá)水平升高（P＜0.05）（圖5，表7～8）。

六、miR-575過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了lncRNA RPL34-AS1過(guò)表達(dá)對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖和凋亡的作用

圖3 lncRNA RPL34-AS1過(guò)表達(dá)對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖和凋亡的影響

表3 lncRNA RPL34-AS1過(guò)表達(dá)對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖和凋亡的影響（±s，n = 3）

表3 lncRNA RPL34-AS1過(guò)表達(dá)對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖和凋亡的影響（±s，n = 3）

注：與對(duì)照組比較，aP ＜0.05；與pcDNA組比較，bP ＜0.05；n實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)

分組 RPL34-AS1 OD值（490 nm）細(xì)胞周期（﹪）凋亡率（﹪）24 h 48 h 72 h G1 S M對(duì)照組 1.00±0.08 0.36±0.03 0.57±0.05 0.76±0.06 31.65±3.11 33.58±3.74 34.77±3.71 7.98±0.71 pcDNA 1.00±0.09 0.35±0.03 0.54±0.05 0.73±0.07 30.54±3.03 35.69±3.54 33.77±3.47 8.36±0.84 pcDNA-RPL34-AS1 2.93±0.28a 0.31±0.03ab 0.37±0.04ab 0.51±0.05ab 54.12±5.28ab 10.74±2.02ab 35.14±3.45 20.11±2.01ab F值 360.862 7.000 47.591 45.736 102.280 168.917 0.360 244.590 P值＜0.001 0.004＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 0.702＜0.001

表4 lncRNA RPL34-AS1過(guò)表達(dá)對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s，n = 3）

表4 lncRNA RPL34-AS1過(guò)表達(dá)對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s，n = 3）

注：與對(duì)照組比較，aP ＜0.05；與pcDNA組比較，bP ＜0.05；n實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)

分組 CyclinD1蛋白 p21蛋白 Bcl-2蛋白 Bax蛋白對(duì)照組 0.81±0.08 0.23±0.03 0.69±0.06 0.20±0.02 pcDNA 0.79±0.07 0.25±0.03 0.68±0.06 0.22±0.03 pcDNA-RPL34-AS1 0.33±0.03ab 0.66±0.06ab 0.29±0.03ab 0.61±0.05ab F值 163.180 294.500 173.444 379.658 P值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

圖4 抑制RPL34-AS1表達(dá)對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖和凋亡的影響

表5 抑制si-RPL34-AS1表達(dá)對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖、周期和凋亡的影響（±s，n = 3）

表5 抑制si-RPL34-AS1表達(dá)對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖、周期和凋亡的影響（±s，n = 3）

注：與對(duì)照組比較，aP ＜0.05；與si-NC組比較，bP ＜0.05；n實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)

分組 RPL34-AS1 OD值（490 nm）細(xì)胞周期（﹪）凋亡率（﹪）24h 48h 72h G1 S M對(duì)照組 1.00±0.09 0.37±0.03 0.56±0.05 0.74±0.07 30.65±3.11 34.28±3.51 35.07±3.66 8.98±0.98 si-NC 1.00±0.06 0.36±0.03 0.55±0.05 0.71±0.06 32.15±2.11 34.69±3.41 33.16±3.24 9.25±0.91 si-RPL34-AS1 0.51±0.05ab 0.39±0.03 0.68±0.06ab 0.99±0.08ab 13.42±1.38ab 53.75±5.22ab 32.83±3.57 4.31±0.42ab F值 152.176 2.333 16.430 42.826 182.468 65.266 1.078 106.003 P值＜0.001 0.119＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 0.356＜0.001

表6 抑制si-RPL34-AS1表達(dá)對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s，n = 3）

表6 抑制si-RPL34-AS1表達(dá)對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s，n = 3）

注：與對(duì)照組比較，aP ＜0.05；與si-NC組比較，bP ＜0.05；n實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)

分組 CyclinD1蛋白 p21蛋白 Bcl-2蛋白 Bax蛋白對(duì)照組 0.68±0.06 0.31±0.03 0.59±0.05 0.33±0.03 si-NC 0.71±0.07 0.29±0.03 0.61±0.06 0.31±0.03 si-RPL34-AS1 0.92±0.08ab 0.13±0.02ab 0.86±0.07ab 0.19±0.02ab F值 30.987 119.455 55.555 70.364 P值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

圖5 抑制miR-575表達(dá)對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖和凋亡的影響

與pcDNA組比較，pcDNA-RPL34-AS1組卵巢癌SKOV3細(xì)胞中miR-575表達(dá)水平降低，細(xì)胞活性降低，G1期細(xì)胞所占比例升高，S期細(xì)胞所占比例降低，細(xì)胞凋亡率升高，CyclinD1、Bcl-2表達(dá)水平降低，p21、Bax表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與pcDNA-RPL34-AS1+miR-NC組比較，pcDNA-RPL34-AS1+miR-575組卵巢癌SKOV3細(xì)胞中miR-575表達(dá)水平升高，細(xì)胞活性升高，G1期細(xì)胞所占比例降低，S期細(xì)胞所占比例升高，細(xì)胞凋亡率降低，CyclinD1、Bcl-2表達(dá)水平升高，p21、Bax表達(dá)水平降低（P＜0.05）（圖6，表9～10）。

表7 抑制miR-575表達(dá)對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖、周期和凋亡的影響（±s，n = 3）

表7 抑制miR-575表達(dá)對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖、周期和凋亡的影響（±s，n = 3）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與anti-miR-NC組比較，bP＜0.05；n實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)

分組 miR-575 OD值（490 nm）細(xì)胞周期（﹪）凋亡率（﹪）24h 48h 72h G1 S M對(duì)照組 1.00±0.06 0.36±0.04 0.57±0.05 0.77±0.06 31.21±3.12 35.69±3.44 33.10±3.54 6.98±0.71 anti-miR-NC 1.01±0.08 0.34±0.03 0.56±0.05 0.74±0.07 32.14±3.12 34.69±3.12 33.65±3.12 7.45±0.74 anti-miR-575 0.47±0.04ab 0.33±0.03 0.41±0.04ab 0.57±0.05ab 50.36±5.11ab 17.50±1.64ab 32.14±3.31 17.69±1.76ab F值 222.129 1.853 32.864 28.555 69.064 113.723 0.449 238.359 P值＜0.001 0.179＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 0.644＜0.001

表8 抑制miR-575表達(dá)對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s，n = 3）

表8 抑制miR-575表達(dá)對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s，n = 3）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與anti-miR-NC組比較，bP＜0.05；n實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)

分組 CyclinD1蛋白 p21蛋白 Bcl-2蛋白 Bax蛋白對(duì)照組 0.79±0.07 0.24±0.03 0.68±0.06 0.20±0.02 anti-miR-NC 0.77±0.07 0.26±0.03 0.69±0.06 0.21±0.03 anti-miR-575 0.38±0.03ab 0.61±0.06ab 0.33±0.03ab 0.57±0.05ab F值 134.832 216.500 140.111 315.711 P 值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

圖6 miR-575過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)lncRNA RPL34-AS1過(guò)表達(dá)對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞和凋亡的作用

表9 miR-575過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了lncRNA RPL34-AS1過(guò)表達(dá)對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖、周期和凋亡的作用（±s，n = 3）

表9 miR-575過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了lncRNA RPL34-AS1過(guò)表達(dá)對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖、周期和凋亡的作用（±s，n = 3）

注：與pcDNA組比較，aP ＜0.05；與pcDNA-RPL34-AS1+miR-NC組比較，bP ＜0.05；n實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)

分組 miR-575 OD值（490 nm）細(xì)胞周期（﹪）凋亡率（﹪）24h 48h 72h G1 S M pcDNA 1.00±0.09 0.36±0.03 0.58±0.05 0.76±0.07 31.65±3.11 33.58±3.41 34.77±3.42 7.98±0.77 pcDNA-RPL34-AS1 0.49±0.04a 0.32±0.03a 0.38±0.03a 0.52±0.05a 53.12±5.22a 11.23±1.28a 35.65±3.14 20.14±2.02a pcDNA-RPL34-AS1+miR-NC 0.47±0.05 0.30±0.03 0.36±0.04 0.49±0.04 55.69±5.13 10.21±1.20 34.10±3.46 21.65±2.11 pcDNA-RPL34-AS1+miR-575 0.88±0.07b 0.35±0.03b 0.52±0.05b 0.69±0.06b 40.35±4.11b 28.14±2.54b 31.54±3.26 12.06±1.22b F值 153.684 7.583 55.040 48.857 56.892 238.197 2.548 144.410 P值＜0.001 0.006＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 0.073＜0.001

表10 miR-575過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了lncRNA RPL34-AS1過(guò)表達(dá)對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的作用（±s，n = 3）

表10 miR-575過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了lncRNA RPL34-AS1過(guò)表達(dá)對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的作用（±s，n = 3）

注：與pcDNA組比較，aP ＜0.05；與pcDNA-RPL34-AS1+miR-NC組比較，bP ＜0.05；n實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)

分組 凋亡率（﹪）CyclinD1蛋白 p21蛋白 Bcl-2蛋白 Bax蛋白pcDNA 7.98±0.77 0.78±0.07 0.24±0.03 0.67±0.06 0.22±0.03 pcDNA-RPL34-AS1 20.14±2.02a 0.35±0.03a 0.67±0.06a 0.28±0.03a 0.63±0.05a pcDNA-RPL34-AS1+miR-NC 21.65±2.11 0.34±0.03 0.68±0.07 0.27±0.03 0.60±0.06 pcDNA-RPL34-AS1+miR-575 12.06±1.22b 0.67±0.06b 0.35±0.04b 0.56±0.05b 0.33±0.03b F值 144.410 175.339 164.181 184.860 185.468 P值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

討 論

靶向治療是一種新興治療惡性腫瘤的手段，通過(guò)特定因子抑制癌細(xì)胞的增殖甚至直接殺死癌細(xì)胞，因此研究卵巢癌的發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制對(duì)分子靶向治療卵巢癌至關(guān)重要[9]。研究發(fā)現(xiàn)lncRNA RPL34-AS1在胃癌中低表達(dá)，與胃癌腫瘤大小相關(guān)[10]。RPL34-AS1在乳頭狀甲狀腺癌組織中表達(dá)降低，過(guò)表達(dá)RPL34-AS1 可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-3663-3p抑制乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[11]。以上研究結(jié)果提示RPL34-AS1在癌癥中可能起抑癌基因作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RPL34-AS1在卵巢癌組織中低表達(dá)，抑制RPL34-AS1表達(dá)后，細(xì)胞活性升高，G1期細(xì)胞所占比例降低，S期細(xì)胞所占比例升高，細(xì)胞凋亡率降低，CyclinD1、Bcl-2表達(dá)水平升高，p21、Bax表達(dá)水平降低。說(shuō)明抑制RPL34-AS1表達(dá)確實(shí)可以促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。而過(guò)表達(dá)RPL34-AS1后卵巢癌SKOV3細(xì)胞中細(xì)胞活性降低，G1期細(xì)胞所占比例升高，S期細(xì)胞所占比例降低，細(xì)胞凋亡率升高，CyclinD1、Bcl-2表達(dá)水平降低，p21、Bax表達(dá)水平升高。說(shuō)明過(guò)表達(dá)RPL34-AS1可抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。提示RPL34-AS1在卵巢癌也具有抑癌作用。

研究表明miRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，深入研究miRNA在腫瘤中的作用機(jī)制對(duì)其診斷、治療和預(yù)后以及藥物研發(fā)均具有重要意義[12]。有研究報(bào)道m(xù)iR-575與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的生存率相關(guān)，過(guò)表達(dá)miR-575 增加了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系的細(xì)胞增殖和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性[13]。過(guò)表達(dá)miR-575抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖，且誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡[14]。miR-575在肝癌組織和細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)，下調(diào)其表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞的增殖、克隆形成、遷移和侵襲[15]。本研究結(jié)果顯示，miR-575在卵巢癌組織中高表達(dá)，抑制miR-575表達(dá)卵巢癌SKOV3細(xì)胞中細(xì)胞活性降低，G1期細(xì)胞所占比例升高，S期細(xì)胞所占比例降低，細(xì)胞凋亡率升高，CyclinD1、Bcl-2表達(dá)水平降低，p21、Bax表達(dá)水平升高。表明抑制miR-575表達(dá)可抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。且本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)RPL34-AS1靶向調(diào)控miR-575，且miR-575過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了RPL34-AS1過(guò)表達(dá)對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖抑制和凋亡促進(jìn)的作用。提示，RPL34-AS1 可能通過(guò)調(diào)控miR-575影響卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖和凋亡。

綜上所述，過(guò)表達(dá)RPL34-AS1可抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與下調(diào)miR-575 有關(guān)。將可為卵巢癌分子靶向治療提供理論參考。