CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶向敲除多溴蛋白1基因?qū)Ω伟┘毎δ艿挠绊?/h1>

2020-07-30 08:00:48宋金鴿焦宇辰

臨床內(nèi)科雜志訂閱 2020年4期 收藏

關(guān)鍵詞：孔板細胞株細胞系

宋金鴿 焦宇辰

肝癌是全世界發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，其死亡率在腫瘤中位居第二位[1]。肝癌的腫瘤基因組研究已取得很大進展，TERT啟動子、TP53、CTNNB1均為肝癌中的高頻突變基因[2]，而抑癌基因AT豐富結(jié)合域1A(ARID1A)作為染色質(zhì)重塑的相關(guān)基因，在肝癌中也經(jīng)常發(fā)生突變，且肝癌中ARID1A的表達量遠低于癌旁組織[3]。但目前尚未發(fā)現(xiàn)其他染色質(zhì)重塑相關(guān)基因?qū)Ω伟┌l(fā)生發(fā)展的作用。多溴蛋白1(PBRM1)基因編碼ATP依賴的SWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合物的亞單位，該亞單位控制DNA轉(zhuǎn)錄的可接近性[4]。既往研究表明，肝內(nèi)膽管細胞癌中也存在17%的PBRM1基因突變[5]。在黃曲霉相關(guān)肝細胞肝癌中也發(fā)現(xiàn)8.2%的樣本存在PBRM1基因突變[6]。因此，本研究通過應(yīng)用規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)(CRISPR)/CRISPR相關(guān)蛋白9(Cas9)系統(tǒng)基因編輯技術(shù)敲除人肝癌細胞系Huh7的PBRM1基因,構(gòu)建PBRM1基因敲除的肝癌細胞模型,以進一步探討PBRM1基因敲除后肝癌細胞的功能變化。

材料與方法

1.材料:人肝癌細胞株Huh7購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細胞中心；Huh7細胞、Huh7-KO細胞和HEK293T細胞均在添加10%胎牛血清、50 U/ml鏈霉素和青霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

2.方法

(1)構(gòu)建基因PBRM1雙拷貝敲除的Huh7細胞株：從在線數(shù)據(jù)庫(https://www.addgene.org/crispr/libraries/#geckov2)獲得CRISPR-sgRNA序列,PBRM1-sgRNA上游引物：5’-CACCGAGGTTGTCGAATAACCA-3’，下游引物：5’-AAACTGGTTTTCCGACTCCTC-3’。EcoRI(美國，New England Biolabs公司)將LentiCRISPRv2(美國，Addgene公司)載體截切形成粘性末端，用T4DNA連接酶(美國，New England Biolabs公司)將剪切后的載體與退火后的sgRNAs通過粘性末端連接，得到一個穩(wěn)定的表達載體。待HEK293細胞復(fù)蘇后進行傳代培養(yǎng)以確保細胞達到穩(wěn)定狀態(tài)，然后按每孔1×105個細胞傳至六孔板中，培養(yǎng)1 d后，將表達載體、包裝質(zhì)粒pMD2.G(美國，Addgene公司)和psPAX2(美國，Addgene公司)共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，培養(yǎng)48 h后收集包含病毒的細胞上清，以1 000 r/min離心10 min后保存于-80 ℃冰箱。病毒感染Huh7細胞48 h后用4 μg/ml嘌呤霉素篩選陽性克隆。為獲得基因PBRM1雙拷貝敲除克隆，將所選細胞置于96孔板上，每孔1個細胞，15 d后提取DNA，而后進行Sanger測序鑒定。PBRM1上游引物：5’-GTCTTCAGCCAGCCATA-3’，下游引物：5’-CCAAAGTGGAACCCAGTC-3’；擴增條件如下：95 ℃ 10 min共1個循環(huán)；94 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)；72 ℃ 5 min共1個循環(huán)。

(2)蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測PBRM1基因表達：用1%十二烷基硫酸鈉處理細胞沉淀，然后在100 ℃下煮沸10 min，以1 2000 r/min離心10min至溶液澄清。布拉德福德蛋白檢測試劑盒(中國，普利萊基因技術(shù)有限公司)用于蛋白質(zhì)濃度定量。隨后，在MES緩沖液(美國，Life Technologies公司)中將50～150 μg蛋白質(zhì)裝載于4%～12%的Bolt Bis Tris Plus凝膠(美國，Life Technologies公司)上。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至0.45 μm硝化纖維素膜(美國，BioRad公司)中。在含5%脫脂奶粉的Tris緩沖鹽水和0.1%吐溫20(TBST)中，室溫下將膜封閉1 h，然后在4 ℃下用一級抗體過夜培養(yǎng)。用TBST清洗膜，并在室溫下用辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合的二級抗體孵育1 h。采用超敏化學(xué)發(fā)光法進行蛋白檢測。應(yīng)用Adobe Photoshop軟件分析印跡。

(3)CCK-8法檢測細胞增殖：以每孔5 000個細胞(100 μl細胞懸液)接種至96孔板，將96孔板置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)。避光環(huán)境下，分別于24 h、48 h、72 h、96 h時間點向每孔加入10 μl的CCK-8溶液(日本，Dojindo公司)，將96孔板在培養(yǎng)箱內(nèi)放置4 h，使用酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光度(OD值)。

(4)克隆形成實驗：在96孔細胞板中按照每孔200個細胞進行鋪板，每組設(shè)置3個復(fù)孔。將96孔板置于37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期查看，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)。，吸出并棄掉各孔的培養(yǎng)基，終止培養(yǎng)。用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗2次，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫(甲醇配制，PBS稀釋)染色10 min，自來水沖洗后晾干，計算集落數(shù)(50個細胞以上)。采用酶聯(lián)斑點圖像自動分析儀進行拍照分析。

(5)細胞周期檢測：10 μmol/L BrdU孵育細胞30 min，胰酶消化收集細胞后，用預(yù)冷的70%乙醇固定細胞，過夜。2 mol/L鹽酸(含0.1 mg/ml胃蛋白酶)室溫孵育20 min后PBS清洗，用50 μg/ml碘化丙啶(PI，美國，Sigma公司)和2 mg/μl 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，美國，Sigma公司)染色。隨后進行流式細胞儀檢測。

(6)轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)(RNA-seq)：分別取Huh7敲除(KO)細胞株和Huh7野生型(WT)細胞系的3組細胞，每組細胞分別提取RNA，進行后續(xù)操作。首先將提取后的RNA通過NanoDropTMOne/OneC檢測純度(OD260/280、OD260/230比值)，經(jīng)過Life Invitrogen Qubit?3.0熒光定量儀精確定量及Agilent 4200 TapeStation系統(tǒng)精確檢測RNA完整性(RIN值)。隨后進行文庫構(gòu)建，采用帶Oligo(DT)的磁珠，對具有polyA結(jié)構(gòu)的mRNA進行捕獲。合成cDNA第1條鏈需要片段化mRNA(模板)、隨機寡核苷酸(引物)及M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶體系。合成cDNA第2條鏈需要先通過RNaseH降解RNA鏈，隨后需要dNTPs(原料)和DNA Polymerase Ⅰ體系。將純化后的cDNA進行末端修復(fù)、連接A尾和測序接頭。使用AMPure XP beads篩選200 bp左右的cDNA，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增后需要再次使用AMPure XP beads純化PCR產(chǎn)物，以獲得最終的測序文庫。質(zhì)控合格后，按相應(yīng)濃度和需求混合文庫，隨后進行Illumina X10測序儀PE150測序。待數(shù)據(jù)下機質(zhì)控合格后，對兩組樣本的差異表達基因分別進行GO和KEGG功能富集，GO富集主要描述差異基因富集的生物過程(BP)、分子功能(MF)和細胞組成(CC)。KEGG富集分析主要查看差異基因所集中的信號通路。在GO和KEGG富集結(jié)果中選取校正P值(多重假設(shè)檢驗經(jīng)過 BH[7]方法校正后的P值)小于0.05且富集基因數(shù)排名靠前的結(jié)果進行進一步討論。

(7)γ-干擾素(IFN-γ)刺激實驗：將Huh7-WT、Huh7-KO細胞分組，以每孔5 000個細胞(100 μl細胞懸液)接種至96孔板，將96孔板置于37 ℃、5%CO2的條件下預(yù)培養(yǎng)。6 h細胞貼壁后，吸出并棄掉培養(yǎng)基，按組加入含0 U/ml、10 U/ml、100 U/ml、1 000 U/ml IFN-γ的DMEM培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。避光環(huán)境下，分別向每組的每孔加入10 μl的CCK-8溶液，將培養(yǎng)板置于37 ℃，5% CO2的條件中培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀檢測在450 nm處的OD值。計算抑制率，抑制率=[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100%[As：實驗孔(含有培養(yǎng)基、CCK-8、IFN-γ)；Ac：對照孔(含有培養(yǎng)基、CCK-8，不含IFN-γ)；Ab：空白孔(不含細胞和IFN-γ的培養(yǎng)基、CCK-8)]。

結(jié) 果

1．PBRM1雙拷貝敲除Huh7細胞株的構(gòu)建：Sanger測序顯示目的區(qū)域被成功敲除(圖1A)，表明設(shè)計的sgRNA可高效編輯PBRM1基因。Western blot檢測轉(zhuǎn)染后的單克隆細胞株Huh7-KO，結(jié)果顯示Huh7-KO細胞株中PBRM1蛋白表達缺失，而Huh7-WT細胞系PBRM1蛋白表達正常，內(nèi)參GAPDH表達量正常且基本一致(圖1B)，說明本研究在Huh7細胞系中成功敲除了PBRM1基因。

圖1 PBRM1基因敲除細胞株的成功構(gòu)建[A：Huh7-KO細胞株與Huh7-WT細胞系的DNA在PBRM1基因目的區(qū)域的Sanger測序峰圖比對；B：Western blot檢測Huh7-KO細胞株和Huh7-WT細胞系的PBRM1蛋白表達)

2.PBRM1基因的敲除抑制肝癌細胞增殖：培養(yǎng)48 h后，與Huh7-WT細胞系比較，Huh7-KO細胞株增殖活性明顯受到抑制(1.254±0.035比0.843±0.029,P<0.000 1)；72 h后抑制效果更加顯著(1.858±0.050比0.945±0.028,P<0.000 1，圖2A)?？寺⌒纬蓪嶒灲Y(jié)果顯示，與Huh7-WT細胞系比較，Huh7-KO細胞株的克隆形成數(shù)偏低，克隆形成明顯受到抑制(圖2B)。

圖2 Huh7-KO細胞株的細胞增殖情況[A:CCK-8測定的OD值96 h內(nèi)在Huh7-KO細胞株和Huh7-WT細胞系中的變化(P<0.000 1)；B：平板克隆形成實驗結(jié)果]

3.表達差異基因的功能富集：Huh7-KO細胞株與Huh7-WT細胞系相比共篩選出5 603個差異表達基因，其中3 303個基因表達上調(diào)，2 300個基因下調(diào)。GO富集結(jié)果顯示，表達下調(diào)的相關(guān)BP主要關(guān)于細胞周期，如DNA復(fù)制(P<0.000 1，富集基因數(shù)=90)、染色體分離(P<0.000 1，富集基因數(shù)=100)、核分裂(P<0.000 1，富集基因數(shù)=96)、細胞時相過渡的下調(diào)(P<0.000 1，富集基因數(shù)=98)、核糖體的合成(P<0.000 1，富集基因數(shù)=74)；表達下調(diào)的CC主要與細胞分裂有關(guān)，包括中心體(P<0.000 1，富集基因數(shù)=83)、染色體(P<0.000 1，基因富集數(shù)=100)、紡錘絲(P<0.000 1，基因富集數(shù)=77)等；MF出現(xiàn)下調(diào)的通路主要包括核糖體結(jié)構(gòu)組成(P<0.000 1，富集基因數(shù)=67)、微管蛋白的結(jié)合(P<0.000 1，富集基因數(shù)=56)等(圖3A)；而表達上調(diào)的BP包括適應(yīng)性免疫應(yīng)答(P<0.000 1，富集基因數(shù)=86)及細胞對IFN-γ的反應(yīng)(P<0.000 1，富集基因數(shù)=45)。KEGG富集結(jié)果顯示，細胞周期(P<0.000 1，基因富集數(shù)=46)、DNA復(fù)制(P<0.000 1，富集基因數(shù)=28)及核糖體相關(guān)通路(P<0.000 1，富集基因數(shù)=56)明顯下調(diào)；而JAK-STAT相關(guān)基因表達上調(diào)(P=0.028，基因富集數(shù)=38)。

4.PBRM1基因的敲除使Huh7肝癌細胞出現(xiàn)G1/S阻滯：Huh7-WT細胞系中處于G1期細胞的平均比例為(57.23±1.71)%，而Huh7-KO細胞株為(74.9±1.61)%，明顯高于Huh7-WT細胞系(P=0.016 6)。Huh7-WT細胞系中處于S期細胞的平均比例為(36.5±1.36)%，而Huh7-KO細胞株為(19.8±1.58)%，明顯低于Huh7-WT細胞系(P=0.000 2)。Huh7-WT細胞系和Huh7-KO細胞株處于G2/M期細胞的平均占比分別為(6.27±0.37)%和(5.26±0.59)%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 Huh7-WT細胞系和Huh7-KO細胞株在細胞周期中各時期細胞所占比例

5.PBRM1敲除可增強Huh7細胞對IFN-γ治療的敏感性：與此同時，在GO通路富集中，表達上調(diào)的BP還包括細胞對IFN-γ的反應(yīng)(P<0.000 1)。并且在KEGG分析中，我們發(fā)現(xiàn)上調(diào)基因富集于JAK-STAT通路，而該通路為IFN-γ介導(dǎo)的信號通路[8]，因此將Huh7-WT細胞系和Huh7-KO細胞株分別在不同濃度梯度的IFN-γ中進行培養(yǎng)，驗證GO和KEGG功能富集的結(jié)果。結(jié)果顯示，1 000 U/ml IFN-γ對Huh7-KO細胞株組的細胞抑制作用明顯高于Huh7-WT細胞系組[抑制率分別為(58.32±3.28)%和(48.67±1.32)%，P=0.009 1]；未加IFN-γ的Huh-WT細胞系組的增殖率明顯高于Huh7-KO組[增殖率分別為(23.53±4.75)%和(45.88±5.46)%，P=0.005 9]。見圖4。

圖4 不同濃度IFN-γ對Huh7-WT和Huh7-KO的抑制作用(y軸中負值表示細胞生長未受到抑制，依舊處于增殖階段，對應(yīng)數(shù)值為增殖率)

討 論

本研究首次在肝癌細胞株中敲除PBRM1基因，并發(fā)現(xiàn)該基因的敲除可以導(dǎo)致細胞G1/S期阻滯從而抑制細胞株增殖。而PBRM1基因通常作為抑癌基因參與染色質(zhì)重塑在腎透明細胞癌中具有較高的突變頻率[9-10]，有研究報道，約40%的腎透明細胞癌患者存在PBRM1基因突變[11]，且PBRM1和BAP1的缺失與患者較差的預(yù)后相關(guān)[12]。在腎透明細胞癌的治療方面，PBRM1基因的功能缺失性突變與程序性死亡受體1(PD-1)治療有效顯著相關(guān)[13]。在腎透明細胞癌中進行PBRM1基因的敲除可以導(dǎo)致80%腎癌細胞增殖顯著增加[11]，與本研究的結(jié)果相反。這可能由于PBRM1基因在不同腫瘤中的功能存在差異。且PBRM1基因的表達量和預(yù)后關(guān)系在不同類型腫瘤中也不盡相同，在腎透明細胞癌、結(jié)腸癌中PBRM1基因表達量較低的患者預(yù)后較差[14-15]，但在子宮內(nèi)膜癌中，PBRM1表達量的陽性率隨病理分級和臨床分期的增高而增加[16]。從網(wǎng)站The Human Protein Atlas中的PBRM1蛋白免疫組化染色結(jié)果也可以發(fā)現(xiàn)，肝癌中PBRM1基因的表達量高于正常肝臟組織。而PBRM1基因的表達量與肝癌的預(yù)后相關(guān)性研究尚有待開展。

眾所周知，肝臟切除和肝臟移植是早期肝癌的主要治療手段，對于不適合肝臟切除、肝臟移植或局部治療的患者，主要選擇索拉菲尼和樂伐替尼進行多靶點分子治療[17]。即使這些治療可以提高患者生存期，但較大程度的細胞抑制和治療耐藥也是患者長期生存的重大限制。因此，有研究對晚期肝癌患者采用免疫檢查點阻斷治療。曲美母單抗是首次用于晚期丙型肝炎病毒(HCV)相關(guān)的肝細胞肝癌患者的細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)蛋白4(CTLA-4)單抗，其治療應(yīng)答率適中(17%),應(yīng)答持續(xù)中位時間為6.5個月[18]。也有在亞洲地區(qū)進行的臨床試驗采用PD-1抗體納武利尤單抗治療索拉菲尼經(jīng)治的晚期肝癌患者，客觀應(yīng)答率為15%[19]。本研究結(jié)果顯示，敲除PBRM1基因的細胞株中表達上調(diào)的基因主要富集于免疫應(yīng)答，提示PBRM1基因敲除可能有助于免疫系統(tǒng)的活化，免疫治療的有效性可能會由于PBRM1的缺失得到進一步提升。在其他類型腫瘤中，也有證據(jù)表明PBRM1缺失與免疫治療獲益相關(guān)。PBRM1基因中的功能缺失性突變使黑色素瘤模型小鼠對免疫檢查點阻斷治療的聯(lián)合用藥反應(yīng)更加敏感，若無該突變，則會產(chǎn)生對免疫治療的耐藥[20]。在腎透明細胞癌中也發(fā)現(xiàn)，PBRM1缺失與免疫檢查點阻斷治療的臨床獲益相關(guān)[13]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，Huh7-KO細胞株對IFN-γ的抑制作用更敏感，且IFN-γ介導(dǎo)的JAK-STAT通路相關(guān)基因表達上調(diào)。曾有研究表明JAK2的缺失會使PD-L1及主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類分子(MHC-Ⅰ)表達下調(diào)從而產(chǎn)生免疫阻斷治療耐受[21]，本研究的RNA-seq結(jié)果顯示，Huh7-KO細胞株JAK2表達上調(diào)，提示PBRM1基因的敲除可能通過促進免疫應(yīng)答從而影響免疫檢查點阻斷對肝癌治療的療效。IFN-γ的體外治療可通過與受體結(jié)合并激活JAK-STAT信號通路，直接抑制腫瘤細胞生長并促進腫瘤細胞凋亡[22]。隨后有研究表明，在非小細胞肺癌中，不同濃度IFN-γ對腫瘤細胞的作用不盡相同，低濃度IFN-γ優(yōu)先激活I(lǐng)CAM1-磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)-Notch1通路誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移，高濃度IFN-γ優(yōu)先激活JAK-STAT通路，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡[23]。我們通過IFN-γ刺激實驗也發(fā)現(xiàn)低濃度IFN-γ促進腫瘤細胞增殖、高濃度抑制增殖的現(xiàn)象。同時，IFN-γ信號通路還可以在抗腫瘤免疫中發(fā)揮免疫調(diào)控作用，可能會使免疫治療產(chǎn)生原發(fā)性耐藥和獲得性耐藥[24-25]。IFN-γ信號通路的功能喪失會使腫瘤對CTLA4阻斷治療產(chǎn)生原發(fā)性耐藥導(dǎo)致治療無效。而長期的IFN-γ暴露會使腫瘤細胞產(chǎn)生免疫逃逸，對免疫檢查點治療產(chǎn)生獲得性耐受，通過JAK抑制劑關(guān)閉干擾素途徑，可以改善免疫檢查點阻斷治療的耐受問題[24]。還有研究表明，RIG-I表達量高的肝癌患者對于IFN-α治療更加有效[26]。但是在肝癌細胞株中PBRM1基因的敲除與免疫治療的相關(guān)性還有待探索。

綜上所述，在人肝癌細胞系Huh7中敲除PBRM1基因可以通過G1/S期阻滯抑制細胞增殖，且IFN-γ的殺傷作用在敲除PBRM1基因后的Huh7細胞株中更加顯著。本研究結(jié)果為進一步探討PBRM1基因在肝癌中的功能和作用奠定基礎(chǔ)，為肝癌的治療提供了新的思路。

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