城鎮(zhèn)污水處理系統(tǒng)中4種抗生素抗性基因的沿程變化

包櫻鈺 謝輝 陳呂軍 溫東輝,?

研究簡(jiǎn)報(bào)

城鎮(zhèn)污水處理系統(tǒng)中4種抗生素抗性基因的沿程變化

包櫻鈺1謝輝2陳呂軍2溫東輝1,?

1.北京大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 北京 100871; 2.清華大學(xué)環(huán)境學(xué)院, 北京 100084; ?通信作者, E-mail: dhwen@pku.edu.cn

為探究抗生素抗性基因(ARGs)在城鎮(zhèn)污水處理系統(tǒng)中的沿程變化, 針對(duì) 4 種關(guān)注度較高的 ARGs (,,和bla)和 I 型整合子的整合酶基因(), 選取京津冀地區(qū)一座中小城鎮(zhèn)的污水處理廠, 使用普通 PCR 和實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù), 對(duì)各工藝單元的水樣進(jìn)行細(xì)胞內(nèi) ARGs 和的定性及定量檢測(cè)分析。結(jié)果表明, 4 種 ARGs 和普遍存在于城鎮(zhèn)污水處理系統(tǒng)中, 出水中 ARGs 和的絕對(duì)豐度降低, 去除量在 1.26~2.30logs 之間。相關(guān)性分析表明,和水質(zhì)因子(pH, COD和NH3-N)可能與 4 種 ARGs 的傳播擴(kuò)散有關(guān)。

抗生素抗性基因(ARGs); 城鎮(zhèn)污水處理系統(tǒng); A2/O工藝; 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

由于環(huán)境選擇壓力(抗生素、重金屬等)的存在, 抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)得以迅速在環(huán)境中產(chǎn)生與傳播[1]。與化學(xué)污染物不同, ARGs 具有遺傳復(fù)制、水平轉(zhuǎn)移(horizontal gene transfer, HGT)等生物學(xué)特性[2–3], 一旦進(jìn)入環(huán)境就很難控制和消除。因此, 近年來 ARGs 成為備受矚目的一種新型污染物。研究表明, ARGs 在常規(guī)的城鎮(zhèn)污水處理廠進(jìn)、出水中普遍存在[4–5]。城鎮(zhèn)污水處理系統(tǒng)中的抗生素、重金屬、可移動(dòng)遺傳元件(mobile genetic elements, MGEs)和微生物等可能對(duì)ARGs 的形成、水平轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散起到促進(jìn)作用[6]。因此, 對(duì)城鎮(zhèn)污水處理廠中 ARGs 賦存特征和去除效果展開研究十分必要。

京津冀地區(qū)是我國(guó)北方經(jīng)濟(jì)的重要核心區(qū), 人口密集, 是抗生素排放強(qiáng)度較大的區(qū)域之一[7], 存在潛在的 ARGs 污染風(fēng)險(xiǎn)。本研究選取京津冀地區(qū)典型中小城鎮(zhèn)的污水處理廠, 采集沿程各工藝單元水樣進(jìn)行 ARGs 的定量檢測(cè)分析, 揭示城鎮(zhèn)污水處理過程中 ARGs 的賦存情況, 為京津冀地區(qū) ARGs污染的防控提供參考。

1 ARGs 和基本理化指標(biāo)的測(cè)定

選取河北省一座生活污水處理廠為研究對(duì)象, 圖 1 展示其污水處理工藝流程及采樣點(diǎn)位(圓圈表示)。樣品采集后, 立即進(jìn)行理化指標(biāo)和 ARGs 的定量分析。分別采用電極法[8]、重鉻酸鹽法[8]、納氏試劑分光光度法[8]和鉬酸銨分光光度法[8]測(cè)定樣品的 pH, COD, NH3-N 和 TP, 結(jié)果見表 1。對(duì)樣品進(jìn)行 DNA 提取后, 使用普通 PCR 和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)的 SYBR Green I 方法, 對(duì),,和bla4 種 ARGs 以及 I 型整合子的整合酶基因分別進(jìn)行定性和定量分析, 操作流程見文獻(xiàn)[9]。此外, 對(duì) 16S rDNA 進(jìn)行定量測(cè)定, 作為微生物總量的表征值。

表1 樣品理化指標(biāo)分析結(jié)果

說明: ―表示未測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 污水處理系統(tǒng)中ARGs 的分布特征

2.1.1 ARGs絕對(duì)豐度

圖 2(a)顯示目標(biāo)基因在污水處理系統(tǒng)各單元中的分布情況, 4 種 ARGs 和在全部水樣中均有檢出, 表明它們普遍存在于污水處理系統(tǒng)中?？傔M(jìn)水中的絕對(duì)豐度最高, 目標(biāo)基因絕對(duì)豐度分布在 5.50×105~9.93×107copies/mL 之間。,,bla和的絕對(duì)豐度沿處理工藝流程大致呈降低趨勢(shì)。消毒工藝出水中,,bla和的絕對(duì)豐度顯著升高, 與 Yoon 等[10]的研究結(jié)果一致。

進(jìn)入 A2/O 處理單元后,的絕對(duì)豐度顯著升高, 在厭氧區(qū)達(dá)到最大值。經(jīng)過二次沉淀,的絕對(duì)豐度進(jìn)一步增加, 是絕對(duì)豐度最高的 ARGs; 經(jīng)過絮凝沉淀和消毒后, 出水中的絕對(duì)豐度顯著降低。

在總出水中, 目標(biāo)基因的絕對(duì)豐度排序?yàn)?>>>bla, 在 3.40×103~3.05×106copies/mL 之間, 所有 ARGs 和在出水中的絕對(duì)豐度顯著低于進(jìn)水。

2.1.2 ARGs相對(duì)豐度

圖 2(b)顯示目標(biāo)基因在污水處理系統(tǒng)各單元中的相對(duì)豐度(即目標(biāo)基因與 16S rDNA 拷貝數(shù)之比)。對(duì)比圖 2(a)與(b)可知, ARGs 及在絕對(duì)豐度和相對(duì)豐度上的變化趨勢(shì)不同。這是由單位體積水樣的微生物量差異引起的[11], 僅關(guān)注絕對(duì)豐度無法體現(xiàn) ARGs 在微生物基因組中的占比情況, 因此對(duì)ARGs 及的相對(duì)豐度進(jìn)行分析十分必要。

總進(jìn)水中各目標(biāo)基因的相對(duì)豐度在 10?5~10?2之間, 與絕對(duì)豐度結(jié)果一致, 進(jìn)水中相對(duì)豐度最高的為。,,bla與的相對(duì)豐度變化趨勢(shì)大致相同: 經(jīng)過細(xì)格柵和旋流沉砂池、A2/O 各處理階段, 上述基因在微生物群落基因組中的占比逐漸下降; 經(jīng)過二次沉淀、絮凝沉淀和消毒后, 相對(duì)豐度呈上升趨勢(shì)。相對(duì)豐度的變化趨勢(shì)與上述基因有較大的差異。在 A2/O 的厭氧區(qū)中,相對(duì)豐度升高。經(jīng)過二次沉淀和絮凝沉淀,相對(duì)豐度呈上升趨勢(shì)。消毒處理后,相對(duì)豐度降低, 但仍顯著高于總進(jìn)水。

總出水中, 目標(biāo)基因的相對(duì)豐度分布在 6.76× 10?5~5.71×10?2之間,,和的相對(duì)豐度高于進(jìn)水, 說明污水處理后, 這幾類基因在微生物群落基因組中的占比增大。有研究證明, 污水處理系統(tǒng)是受納水體下游 ARGs 的主要來源[12–13], 因此城鎮(zhèn)污水處理系統(tǒng)對(duì)于受納地表水的ARGs輸入及其生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)不容小覷。

2.2 污水處理系統(tǒng)對(duì) ARGs 和 intI1 的去除效果

圖 3 顯示各污水處理單元及污水處理全程對(duì)目標(biāo)基因的去除情況。不同工藝單元對(duì)各目標(biāo)基因的去除效果有明顯差異, 且存在去除量為負(fù)的現(xiàn)象。生物處理單元中微生物群落的變化可能是導(dǎo)致本研究中 ARGs 去除或富集效果各異的重要原因[14]。Xu 等[15]和 B?rjesson 等[16]認(rèn)為, 二沉池內(nèi) ARGs 附著在生物質(zhì)上, 并隨之脫離液相進(jìn)入污泥中, 使水相中的 ARGs 減少。剩余污泥的外運(yùn)是 ARGs 進(jìn)入自然環(huán)境的潛在途徑[6,17], 因此對(duì)剩余污泥的合理處置是十分必要的。ClO2消毒僅對(duì)和微生物總量有一定的削減作用, 不能有效地控制其他目標(biāo)基因。經(jīng)過全部工藝后, 目標(biāo)基因的削減量在1.26~2.30logs 之間, 順序?yàn)?>bla>>>。

2.3 相關(guān)性分析

2.3.1目標(biāo)基因之間的相關(guān)性

表 2 列出目標(biāo)基因絕對(duì)豐度之間的相關(guān)性分析結(jié)果。與,,bla之間均存在顯著的正相關(guān)關(guān)系(<0.001)。是 I 型整合子中編碼整合酶的基因, 整合子幾乎存在于各種可移動(dòng)遺傳元件和染色體上, 與 ARGs 在環(huán)境中的傳播、擴(kuò)散聯(lián)系十分緊密[18–19]。I 型整合子可能是這幾類抗性基因傳播擴(kuò)散的重要機(jī)制。

2.3.2水質(zhì)因子與目標(biāo)基因的相關(guān)性

表 3 列出水質(zhì)因子與目標(biāo)基因之間的相關(guān)性分析結(jié)果。結(jié)果表明,和微生物總量分別與pH 顯著負(fù)相關(guān)(<0.05), 4 個(gè)目標(biāo)基因(,,bla和)分別與兩個(gè)水質(zhì)因子(COD 和 NH3-N)之間呈顯著的正相關(guān)關(guān)系(<0.05), 總 ARGs 與NH3-N 顯著正相關(guān)(<0.05), 微生物總量與 TP 顯著正相關(guān)(<0.01)。N?lvak 等[20]、奚慧[21]和杜雪[22]的研究結(jié)果分別表明 ARGs 與 pH, NH3-N 及 COD 之間正相關(guān), 本文結(jié)果與之一致, 可能的原因?yàn)樘?、氮和磷等營(yíng)養(yǎng)元素促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)繁殖, 從而有助于 ARGs 的擴(kuò)散[23]。上述研究結(jié)果說明對(duì)污水處理廠基本水質(zhì)指標(biāo)(pH, COD 和 NH3-N 等)的監(jiān)測(cè)可能有助于預(yù)測(cè) ARGs 的豐度水平, 可為揭示污水處理系統(tǒng)的 ARGs 污染風(fēng)險(xiǎn)提供幫助。

表2 目標(biāo)基因之間的相關(guān)性分析

注: ***表示在0.001(雙側(cè))水平上顯著相關(guān), **表示在 0.01(雙側(cè))水平上顯著相關(guān), *表示在0.05 (雙側(cè))水平上顯著相關(guān), 下同。

表3 水質(zhì)因子與目標(biāo)基因之間的相關(guān)性分析

3 結(jié)論

本研究采集一座中小型生活污水處理廠中各工藝單元水樣, 進(jìn)行 4 種 ARGs 的定性和定量檢測(cè)分析, 揭示城鎮(zhèn)污水處理過程中 ARGs 的分布和變化規(guī)律, 得到如下結(jié)論。

1),,,bla與 I 型整合子普遍存在于城鎮(zhèn)污水處理系統(tǒng)中。進(jìn)水中的絕對(duì)和相對(duì)豐度最高, 出水中的絕對(duì)和相對(duì)豐度最高?？偝鏊心繕?biāo)基因的絕對(duì)豐度分布在 3.40×103~3.05×106copies/mL 之間, 相對(duì)豐度分布在 6.76× 10?5~ 5.71×10?2之間。

2)污水處理降低 4 種 ARGs 和 I 型整合子的絕對(duì)豐度(去除量在 1.26~2.30logs 之間), 提高,和的相對(duì)豐度。

3)相關(guān)性分析表明,,和bla之間以及 I 型整合子與,,bla之間均存在顯著的正相關(guān)關(guān)系(<0.0001); pH, COD 和 NH3-N 等水質(zhì)因子與 ARGs、I 型整合子和微生物量之間存在一定的相關(guān)性(<0.005)。

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Variations of 4 Antibiotic Resistance Genes in a Sewage Treatment Plant

BAO Yingyu1, XIE Hui2, CHEN Lüjun2, WEN Donghui1,?

1. College of Environmental Sciences and Engineering, Peking University, Beijing 100871; 2. School of Environment, Tsinghua University, Beijing 100084; ? Corresponding author, E-mail: dhwen@pku.edu.cn

In order to understand the variations of antibiotic resistance genes (ARGs) in sewage treatment plants(STPs), the distribution and removal efficiencies of 4 subtypes of intracellular ARGs (,,andbla) and class I integron integrase gene () in amiddle-scale STP in Hebei Province were detected by PCR and real-time fluorescent quantitative PCR (qPCR). 4 ARGs andwere found in all water samples and 1.26–2.30 orders of magnitude of ARGs were removed by the STP. Correlation analysis showed thatand water quality factors including pH, COD, and NH3-N might affect the distribution and diffusion of,, and bla. The final effluent of a STP may promote the spread of ARGs in surface water system.

antibiotic resistance genes (ARGs); sewage treatment plants (STPs); A2/O process; real-time fluorescence quantitative PCR (qPCR)

10.13209/j.0479-8023.2020.046

國(guó)家自然科學(xué)基金(51678003, 51678334)資助

2019–06–13;

2019–10–31